書書書高溫脅迫下番茄幼苗對冷激的響應(yīng)*李勝利夏亞真 劉 金 師曉丹 孫治強(qiáng)( 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 ， 鄭州 450002)摘 要 高溫逆境是影響夏秋季蔬菜設(shè)施集約化育苗質(zhì)量的主要因素之一 ， 利用溫度逆境誘導(dǎo)植物產(chǎn)生交叉適應(yīng)是植物獲得抗逆性的一種有效手段 為探索冷激強(qiáng)度對番茄幼苗高溫脅迫的緩解效應(yīng) ， 試驗(yàn)采用人工氣候箱模擬夏季設(shè)施中的高溫脅迫 ， 研究了不同冷激溫度 ( 5、10、15 ) 和冷激持續(xù)時間 ( 10、20、30 min) 對番茄幼苗生長 、生物膜保護(hù)系統(tǒng)的影響 ， 并研究了單次適宜冷激處理對番茄小分子熱激蛋白 LeHSP23 8 和 CaHSP18 基因表達(dá)的影響 結(jié)果表明 : 在高溫脅迫前對番茄幼苗進(jìn)行冷激處理可以抑制其下胚軸的伸長和株高的生長 冷激緩解番茄幼苗高溫脅迫的效應(yīng)在不同冷激溫度下表現(xiàn)出不同的變化趨勢 ; 5 冷激處理抑制了番茄幼苗抗氧化酶活性的升高 ， 使細(xì)胞膜透性增大 ， 對幼苗產(chǎn)生傷害 ; 10 冷激處理對番茄幼苗高溫脅迫的緩解效應(yīng)隨冷激時間的延長呈降低趨勢 ; 而 15 冷激處理緩解番茄幼苗高溫脅迫的效應(yīng)隨冷激時間的延長呈增加趨勢 適宜冷激溫度和冷激持續(xù)時間能夠誘導(dǎo)番茄幼苗對高溫逆境的交叉適應(yīng)性 ， 在高溫脅迫前將番茄幼苗進(jìn)行溫度為 10 、持續(xù) 10 min 的冷激處理效果最佳 ， 與對照相比 ， 顯著提高了高溫脅迫下番茄幼苗植株單株干質(zhì)量和壯苗指數(shù) ，降低了番茄幼苗葉片相對電導(dǎo)率和丙二醛含量 ， 促進(jìn)了脯氨酸和可溶性蛋白的積累 ， 提高了番茄幼苗葉片超氧化物歧化酶 ( SOD) 、過氧化物酶 ( POD) 、過氧化氫酶 ( CAT) 3 種抗氧化酶活性 ， 并誘導(dǎo)了小分子熱激蛋白基因 LeHSP238 和 CaHSP18 在常溫條件下的上調(diào)表達(dá) 關(guān)鍵詞 冷激 高溫脅迫 番茄幼苗 生物膜保護(hù)系統(tǒng) 小分子熱激蛋白* 河南省蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目 ( S2010-03-03) 和國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng) ( CAS-25-C06) 資助 通訊作者 E-mail: lslhc yeah net2013-12-12 收稿 ， 2014-07-24 接受 文章編號 10019332( 2014) 10292708中圖分類號 S6412 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 AEffects of cold-shock on tomato seedlings under high temperature stress LI Sheng-li， XIAYa-zhen， LIU Jin， SHI Xiao-dan， SUN Zhi-qiang ( College of Horticulture， Henan AgriculturalUniversity， Zhengzhou 450002， China) -Chin J Appl Ecol ， 2014， 25( 10) : 29272934Abstract: High temperature stress ( HTS) is one of the major limiting factors that affect the qualityof intensively cultured seedlings in protected facilitates during hot season Increasing the crossadaptive response of plant induced by temperature stress is an effective way to improve plant stressresistance In order to explore the alleviating effect of cold-shock intensity on tomato seedlingsunder HTS， tomato seedlings were subjected to cold-shock treatments every day with 5 ， 10 ，and 15 for 10 min， 20 min， and 30 min， respectively， in an artificial climate chamber Theeffect of single appropriate cold-shock on the gene expression of small heat shock proteins LeH-SP238 and CaHSP18 was investigated The results showed that hypocotyl elongation and plantheight of tomato seedlings were restrained by cold-shock treatment before HTS was met The allevia-ting effect of tomato seedlings under HTS by cold-shock varied greatly with levels and durations oftemperature The membrane lipids in the leaf of tomato seedlings were subjected to peroxidation in-jury in the cold-shock treatment at 5 ， in which the penetration of cell membrane was increasedand the activities of antioxidant enzyme was inhibited The alleviating effect to HTS by cold-shockwas decreased with the increasing cold-shock duration at 10 ， however， a reverse change wasfound at 15 The results indicated that cross adaptive response of tomato seedling could be in-duced with a moderate cold-shock temperature for a proper duration before HTS was met The opti-mum cold-shock treatment was at 10 for 10 min per day， under which， the dry mass， healthy in-dex， activities of protective enzymes ( including SOD， POD and CAT) in leaves of tomato seedlings were應(yīng) 用 生 態(tài) 學(xué) 報 2014 年 10 月 第 25 卷 第 10 期Chinese Journal of Applied Ecology， Oct 2014， 25( 10) : 29272934DOI:10.13287/j.1001-9332.20140801.014significantly increased， the contents of proline and soluble protein were enhanced， relative conductivityand malondialdehyde concentration were significantly decreased， and the expression levels of LeHSP238 and CaHSP18 were increased compared with that under normal temperature conditionKey words: cold-shock; high temperature stress; tomato seedlings; biomembrane protection sys-tem; small heat shock protein由于溫度不斷上升造成的高溫脅迫已成為世界許多地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個主要問題 ， 短暫或持續(xù)的高溫引起了植株一系列的生理變化 ， 如光合暗呼吸 、膜穩(wěn)定性 、線粒體呼吸等 ， 這些都影響了植株的生長發(fā)育 ， 致使經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量急劇下降 12 因高溫激發(fā)了過量的呼吸和光合電子傳遞 ， 導(dǎo)致對植株有毒害作用的活性氧如超氧化氫和過氧化氫的產(chǎn)生 3 通過一些措施來誘導(dǎo)植株對熱脅迫的忍受能力受到了極大的關(guān)注 ， 主要方法有基因工程 45、育種 67、外源生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 89、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì) 10和鈣離子 1113等 基因工程和育種需要耗費(fèi)大量的時間 ， 外源物質(zhì)使用效果受不同作物 、不同基因型的影響而得出各異的結(jié)論 利用溫度逆境鍛煉誘導(dǎo)植物交叉適應(yīng)性是植物獲得抗逆性的另一有效手段 ， 如 Fu 等 14發(fā)現(xiàn) ， 對黑麥進(jìn)行低溫鍛煉后 ， 其耐熱性明顯提高 ; 馬德華等 1516研究表明 ， 高溫鍛煉和低溫鍛煉均可提高黃瓜幼苗的耐高溫能力 ; 張俊環(huán)等 1718在葡萄上的研究表明 ， 8 低溫鍛煉能夠誘導(dǎo)葡萄幼苗對高溫逆境的交叉適應(yīng)性 ， 保護(hù)葉綠體 、線粒體等膜結(jié)構(gòu)免受高溫脅迫傷害 ， 低溫鍛煉可增強(qiáng)葡萄葉片中sHSPl76 基因在高溫脅迫條件下的表達(dá)水平 番茄作為一種喜溫性作物 ， 在夏秋季設(shè)施育苗中 ， 由于透明材料的覆蓋 ， 40 以上高溫經(jīng)常出現(xiàn) ，高溫脅迫常常造成幼苗徒長 、花芽分化不良等問題 ，最終影響產(chǎn)量和品質(zhì) ， 高溫逆境已成為夏秋季蔬菜集約化育苗生產(chǎn)中的重要限制因子 1921 冷激在番茄集約化育苗中已被驗(yàn)證是一種有效的措施 ， 但適宜的冷激強(qiáng)度在不同的研究中則有不同的結(jié)論 ， 如Huang 和 Chin 22研究表明 ， 5 冷水刺激可增強(qiáng)番茄幼苗抗高溫脅迫的能力 ; 但 Allen 和 Ort 23認(rèn)為 ，當(dāng)番茄植株遭受 10 以下低溫時 ， 光合器官功能失調(diào) 另外 ， 冷水刺激這種低溫誘導(dǎo)措施受基質(zhì)濕度的影響 ， 頻繁的冷水灌溉容易增加濕度 ， 在高溫高濕的設(shè)施環(huán)境中應(yīng)用受到限制 為了探明番茄集約化育苗時適宜的冷激強(qiáng)度 ， 本試驗(yàn)采用直接冷激這種不增加空氣和基質(zhì)濕度的低溫誘導(dǎo)措施 ， 研究不同冷激溫度和冷激時間對番茄幼苗生長 、葉片生物膜保護(hù)系統(tǒng)的影響 ， 通過單次適宜冷激探討小分子熱激蛋白基因 LeHSP23 8 和 CaHSP18 表達(dá)對適宜冷激強(qiáng)度的反應(yīng) ， 從生理生化和分子生物學(xué)角度闡釋冷激對緩解幼苗高溫脅迫效應(yīng)的機(jī)理 ， 為番茄夏季集約化育苗環(huán)境調(diào)控提供理論支撐 1 材料與方法1. 1 試驗(yàn)材料和培養(yǎng)條件試驗(yàn)于 2012 年 12 月 2013 年 2 月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院蔬菜栽培實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行 ， 供試番茄( Solanum lycopersicon) 品種為 “粉都 77”， 由河南豫藝種業(yè)提供 種子經(jīng)浸種消毒 、催芽后 ， 播于裝有復(fù)合基質(zhì)的 72 孔穴盤中 ， 在適溫人工氣候室內(nèi)育苗 ，晝溫 ( 281) ， 夜溫 ( 221) ， 光周期 12 h/12 h，光照強(qiáng)度 800 molm2s1， 相對濕度 70% 當(dāng)幼苗子葉展平真葉露出時 ， 選擇生長基本一致的幼苗移入模擬外界夏季晴天自然條件溫度變化規(guī)律的人工 氣 候 箱 中 該人工氣候箱的光強(qiáng)為 800molm2s1， 相對濕度為 70%， 光周期 12 h/12h; 8: 0012: 00 溫度為 28 32 ， 12: 0016: 00 溫度為 ( 381) ( 4 h 的高溫脅迫 ) ， 16: 0020: 00 溫度為 28 32 ， 20: 00次日 8: 00 溫度為 25 1. 2 冷激處理試驗(yàn)共設(shè) 10 個處理 : 幼苗子葉展平后開始進(jìn)行冷激處理 ， 在每天 10: 00 進(jìn)行冷激鍛煉 ( 高溫脅迫前2 h) ， 分別將番茄幼苗移入 5、10、15 的人工氣候箱中 ， 冷激持續(xù)時間分別設(shè)為 10、20、30 min， 然后將幼苗再移回原模擬夏季溫度變化的人工氣候箱中 ，對照幼苗一直在模擬夏季溫度變化的人工氣候箱中生長 ( 表 1) 每個處理 30 株 ， 重復(fù) 3 次 ， 采用隨機(jī)區(qū)組排列 ， 在冷激鍛煉處理第 21 天 ( 4 片真葉時 ) 、高溫脅迫 4 h 后開始取樣 ， 測定各項(xiàng)生理指標(biāo) 在冷激強(qiáng)度生理試驗(yàn)篩選的基礎(chǔ)上 ， 選擇在適溫人工氣候箱中生長一致的 120 棵番茄幼苗 ( 3 4片真葉 ) ， 放入模擬夏季溫度變化的人工氣候箱中適應(yīng) 2 d 后 ， 第 3 天 8: 00( 高溫脅迫前 4 h) 將番茄幼苗放入 10 的人工氣候箱中 ， 冷激處理 10 min 后移回原模擬夏季溫度變化的人工氣候箱中 ， 對照為在模擬夏季溫度變化的人工氣候箱中生長的番茄幼8292 應(yīng) 用 生 態(tài) 學(xué) 報 25 卷表 1 試驗(yàn)設(shè)計Table 1 Experimental design處理Treatment冷激溫度Temperature ofcold-shock ( )冷激持續(xù)時間Duration ofcold-shock ( min)T15 10T25 20T35 30T410 10T510 20T610 30T715 10T815 20T915 30CK 0 0苗 ， 分別在冷激后 0、2、4、8、12、24 h 取樣 ， 每次取樣重復(fù) 3 次 ， 取樣后放入液氮迅速冷凍 ， 用于 NA 的提取 1. 3 測定項(xiàng)目及方法1. 3. 1 生長指標(biāo)的測定 每個處理隨機(jī)取 8 株 ， 用自來水沖洗干凈后擦干 ， 用于生長指標(biāo)的測定 ， 重復(fù)3 次 株高和下胚軸長用直尺測量 : 從莖基部到生長點(diǎn)的長度作為株高 ， 莖基部到子葉基部的長度作為下胚軸長 ; 莖粗采用游標(biāo)卡尺測量 ， 測量部位為子葉基部 ; 單株干質(zhì)量采用烘干法測量 ， 105 殺青 15 min， 75 烘干至恒量 ， 稱干質(zhì)量 ; 壯苗指數(shù)采用以下公式計算 :SI=HW式中 : SI 為壯苗指數(shù) ; 為莖粗 ( cm) ; H 為株高( cm) ; W 為單株干質(zhì)量 ( mg) 1. 3. 2 生理指標(biāo)的測定 取番茄幼苗的第 2 和第 3片真葉 ， 用于生理指標(biāo)測定 參考王學(xué)奎 24提出的方法 : 采用電導(dǎo)儀法測定相對電導(dǎo)率 ; 采用考馬斯亮藍(lán) G-250 染色法測定可溶性蛋白質(zhì)含量 ; 采用磺基水楊酸法測定脯氨酸含量 ; 采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛含量 保護(hù)酶活性的測定參考李合生 25提出的方法 ， 略有改動 : 分別取鮮樣 0 5 1 g， 液氮速凍后放置70 冰箱保存 ， 測定時分別用相應(yīng)的磷酸緩沖液研磨勻漿 超氧化物歧化酶 ( SOD) 活性采用氮藍(lán)四唑法測定 ， SOD 活性以抑制 NBT 光化還原的一半為一個酶活性單位 ; 過氧化物酶 ( POD) 活性采用愈創(chuàng)木酚法測定 ， 以每分鐘內(nèi) A470變化 0 01 為一個活性單位 ; 過氧化氫酶 ( CAT) 活性采用紫外分光光度法測定 ， 以每分鐘內(nèi) A240變化為一個活性單位 1. 3. 3 實(shí)時熒光 PC 分析 采用 Trizol 小量 NA試劑盒 ( TaKaa) 提取總 NA; 反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA 使用能夠去除基因組 DNA 污染的試劑盒 Pri-meScriptTMT reagent Kit with gDNA Eraser( Taka-ra) ; 利用 genscritp 網(wǎng)站設(shè)計番茄 CaHSP18 基因 ( 登錄號 : AY284925) 和 LeHSP23 8 基 因 ( 登 錄 號 :AB017134) 引 物 序 列 ， 其 序 列 分 別 為 P1: 5-ACATCTTCGACCCAGTCTCC-3， P2: 5-CAGAG-GTTTCACGAGCAGAG-3; P3: 5-TTCTCCATTCG-TAGCTGCA-3， P4: 5-ACATCCCATCCTCTTCTTGC-3; 內(nèi)參使用番茄 EF1- 基因 ( Genbank no X530431) ， P5: 5-TACTGGTGGTTTTGAAGCTG-3; P6: 5-AACTTCCTTCACGATTTCATCATA-3 26 用 Bio-ad的 iQrM5 多重實(shí)時熒光定量 PC 儀 ， 以各取樣時間點(diǎn)的 cNDA 為模板 ， 反應(yīng)體系為 20 L， 包括 8 5 L的 SYB GreenII 混合液 ( Takara 公司生產(chǎn) ) ， 9 5 LcDNA 和 1 L 的 F/ 引物 熒光定量 PC 條件設(shè)置為 : 95 30 s; 95 5 s， 59 35 s， 40 個循環(huán) ( 熒光的采集在 59 ) ， 反應(yīng)完成后分析熒光值變化曲線和溶解曲線 ， 查看每個基因的擴(kuò)增情況 ， 導(dǎo)出相應(yīng)的閾值循環(huán)數(shù) ( cycle at threshold， Ct) ， 在 Excel 中進(jìn)行統(tǒng)計分析 采用 2-CT 計算各取樣時間點(diǎn)基因的相對表達(dá) ， 重復(fù) 3 次 1. 4 數(shù)據(jù)處理采用 DPS 75 和 Microsoft Excel 2003 統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn) ( LSD 法 ， =0. 05) ， 采用 SigmaPlot 10 0 軟件進(jìn)行繪圖 ， 數(shù)據(jù)均采用平均值 標(biāo)準(zhǔn)誤表示 2 結(jié)果與分析2. 1 冷激對高溫脅迫下番茄幼苗生長指標(biāo)的影響由表 2 可以看出 ， 冷激抑制了番茄幼苗下胚軸的伸長 ， 降低了幼苗株高的生長 ， 除了 T7( 冷激溫度15 ， 持續(xù) 10 min) ， 所有冷激處理番茄幼苗的株高和下胚軸均低于 CK 冷激強(qiáng)度對幼苗的形態(tài)指標(biāo)有較大影響 ， 隨著冷激溫度的降低和冷激持續(xù)時間的延長 ， 幼苗的株高 、莖粗 、下胚軸長度基本呈下降趨勢 適宜的冷激溫度與持續(xù)時間有利于番茄幼苗干物質(zhì)積累與壯苗指數(shù)的提高 ， 5 冷激條件下的 3個時間處理 ， 番茄幼苗營養(yǎng)生長受抑制較大 ， 幼苗的莖粗 、干質(zhì)量和壯苗指數(shù)均低于 CK T4處理 ( 冷激溫度 10 ， 持續(xù)時間 10 min) 番茄幼苗的莖粗與單株干質(zhì)量為 282 mm 和 10924 mg， 比 CK 分別提高了 24 2% 和 48 0%， 與 CK 差異達(dá)到顯著水平 ， 反映幼苗綜合素質(zhì)的壯苗指數(shù)達(dá)到 3 81， 在所有處理中最高 929210 期 李勝利等 : 高溫脅迫下番茄幼苗對冷激的響應(yīng)表 2 冷激對高溫脅迫下番茄幼苗生長指標(biāo)的影響Table 2 Effects of cold-shock on the growth of tomato seedlings under high temperature stress處理Treatment株高Plant height( cm)莖粗Stem diameter( mm)下胚軸長Hypocotyl length( cm)單株干質(zhì)量Dry mass( mg)壯苗指數(shù)Healthy indexT1568017e 211054bc 392005b 5140181de 1920094cT2555067e 164021f 381006bc 3521813e 103012dT367 5020cd 183054def 320013d 67591190cd 184009cT4812032a 282029a 388009b 10924889a 381017aT5809012ab 203054bc 379017bc 95681077ab 265032bT6698013cd 179090ef 367009bc 6962358c 178007cT7850018a 283044a 443004a 8424521c 280005cT8730015bc 206065bc 362004e 7023197c 198007cT9634035de 200060cde 389005b 9382447ab 300025bCK 851054a 227065b 419006a 7382414c 198009c同列不同小寫字母表示處理間差異顯著 ( P005) Different small letters in the same column meant significant difference at 0 05 level among treat-ments2. 2 冷激對高溫脅迫下番茄幼苗脯氨酸和可溶性蛋白含量的影響植物中游離脯氨酸具有調(diào)節(jié)滲透及保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用 ， 其含量高低與植物的抗逆性有極大的相關(guān)性 27 從圖 1 可以看出 ， 所有冷激處理的番茄幼苗葉片脯氨酸含量均高于 CK， 這說明高溫前對番茄幼苗進(jìn)行冷激處理可以誘導(dǎo)番茄幼苗的抗高溫能力 脯氨酸含量與冷激溫度和冷激持續(xù)時間有很大關(guān)系 ， 在 5 冷激條件下 ， 隨著冷激時間的延長 ， 脯氨酸含量呈降低趨勢 ， 而在 10 和 15 冷激處理中 ， 脯氨酸含量則隨著冷激時間的延長呈先增加后降低趨勢 其中冷激處理 T5( 冷激溫度 10 ，持續(xù)時間 20 min) 和 T4( 冷激溫度 10 ， 持續(xù)時間10 min) 番茄幼苗脯氨酸含量與 CK 相比差異達(dá)到了極顯著水平 ， 脯氨酸含量分別提高了 42 7% 和394%高溫脅迫下可溶性蛋白含量與作物的耐熱性密切相關(guān) 28， 由圖 1可以看出 ， 冷激處理不同程度增圖 1 冷激對高溫脅迫下番茄幼苗葉片脯氨酸 、可溶性蛋白 、丙二醛含量和相對電導(dǎo)率的影響Fig1 Effects of cold-shock on proline， soluble protein， malondialdehyde contents and relative conductivity in leaves of tomato seed-lings under high temperature stress不同小寫字母表示處理間差異顯著 ( P0 05) Different small letters meant significant difference at 0 05 level among treatments 下同 The samebelow0392 應(yīng) 用 生 態(tài) 學(xué) 報 25 卷加了番茄幼苗葉片可溶性蛋白含量 ， 冷激強(qiáng)度對番茄幼苗可溶性蛋白含量有較大影響 在 5 的冷激處理中 ， 隨著冷激時間的延長 ， 其可溶性蛋白含量呈增加趨勢 ， 而在 10 和 15 冷激處理中 ， 可溶性蛋白含量隨著冷激時間的延長呈降低趨勢 10 冷激處理番茄幼苗可溶性蛋白含量均高于同時間 5 和 15處理 ， 其中 T4( 冷激溫度 10 ， 持續(xù)時間 10 min) 處理番茄幼苗可溶性蛋白含量在所有處理中最高 ， 比 CK提高了 422%， 差異達(dá)到顯著水平 2. 3 冷激對高溫脅迫下番茄幼苗膜透性和丙二醛含量的影響由圖 1 可以看出 ， 冷激溫度和持續(xù)時間對番茄幼苗葉片相對電導(dǎo)率和丙二醛含量有較大影響 在試驗(yàn)的溫度范圍內(nèi) ， 5 處理的相對電導(dǎo)率和丙二醛含量高于 10 和 15 處理 ， 5 冷激條件下持續(xù) 10、20、30 min 的 3 個處理番茄幼苗相對電導(dǎo)率和丙二醛含量均高于 CK; 而 10 和 15 冷激處理的番茄幼苗相對電導(dǎo)率和丙二醛含量均低于 CK， 與15 處理不同的是 ， 在 10 處理中 ， 隨著冷激持續(xù)時間的延長其丙二醛含量逐漸升高 ， 其中 T4( 冷激溫度 10 ， 持 續(xù) 時 間 10 min) 與 T7( 冷 激 溫度 15 ， 持續(xù)時間 30 min) 2 個處理番茄幼苗丙二醛含量最低 ， 比 CK 分別降低了 16 9% 和 19 7%，差異達(dá)顯著水平 這說明適宜的冷激溫度與冷激持續(xù)時間可以明顯減少高溫脅迫下幼苗葉片膜脂過氧化反應(yīng)的發(fā)生 ， 有效緩解高溫脅迫引起的葉片相對電導(dǎo)率的升高 ， 但過低的冷激溫度或過長的冷激持續(xù)時間也會造成番茄幼苗葉片內(nèi)的電解質(zhì)外滲 ， 從而使相對電導(dǎo)率增加 2. 4 冷激對高溫脅迫下番茄幼苗葉片保護(hù)酶活性的影響SOD、POD、CAT 是清除自由基重要的抗氧化酶類 ， 在植物抗氧化系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用 29 由圖2 可以看出 ， 冷激強(qiáng)度對高溫脅迫下番茄幼苗葉片SOD、CAT 和 POD 活性的影響有較大差異 5 冷激溫度下番茄幼苗葉片 3 種酶的活性均低于 CK， 而10 、15 冷激溫度下 ， 適宜的冷激持續(xù)時間則有利于番茄幼苗葉片 3 種酶活性的升高 不同冷激溫度下 ， 冷激持續(xù)時間對 3 種酶的活性存在不同的累積效應(yīng) ， 在 10 的處理中 ， 隨冷激持續(xù)時間的延長 ，其 SOD、CAT 和 POD 活性均呈降低趨勢 ， 而在 15 的處理中 ， 3 種酶的活性則呈現(xiàn)相反的趨勢 ， 其中SOD、CAT 和 POD 活性的最高值均出現(xiàn)在 T4( 冷激溫度 10 ， 持續(xù)時間 10 min) 處理中 ， 分別比 CK 提高了 152%、14 2% 和 23 4%， 與 CK 差異達(dá)到顯著水平 2. 5 單次冷激對 CaHSP18 和 LeHSP23 8 基因表達(dá)的影響在冷激強(qiáng)度生理試驗(yàn)篩選的基礎(chǔ)上 ， 選擇 T4( 冷激溫度 10 ， 持續(xù)時間 10 min) 處理作為較適冷激強(qiáng)度 ， 對番茄幼苗進(jìn)行單次冷激試驗(yàn) 從圖 3 可以看出 ， 番茄幼苗中 CaHSP18 和 LeHSP238 基因在冷激鍛煉后相對表達(dá)量變化趨勢一致 在 T4處理后0 h， 番 茄 生 長 適 溫 條 件 下 ( 0 4 h， 28 32) CaHSP18 和 LeHSP23 8 基因的表達(dá)量顯著上調(diào) ， 在 2 h 和 4 h 表達(dá)量逐漸趨于回落 ， 而在 0 4 h，CK 處理中的 CaHSP18 和 LeHSP238 基因表達(dá)量幾乎沒有變化 在 8 h 時 ， 番茄幼苗處于高溫脅迫環(huán)境( 4 8 h， 38 ) 中 ， T4處理和 CK 處理的 CaHSP18、LeHSP238 基因表達(dá)均表現(xiàn)為顯著上調(diào) ， 但 T4處理的基因表達(dá)量顯著低于 CK 處理 說明這兩個小分子熱激蛋白基因雖然能被 T4處理的冷激強(qiáng)度誘導(dǎo)表達(dá) ， 但表達(dá)量顯著低于未冷激處理 冷激后 12 h 和 24h 均處于番茄生長適溫條件下 ( 8 24 h， 28 32 ) ， T4處理 和 CK 處 理 的 CaHSP18、LeHSP23 8 基 因 表達(dá)量均呈現(xiàn)上調(diào) ， 而冷激處理的基因表達(dá)量均高于圖 2 冷激對高溫脅迫下番茄幼苗葉片超氧化物歧化酶 ( SOD) 、過氧化氫酶 ( CAT) 和過氧化物酶 ( POD) 活性的影響Fig2 Effects of cold-shock on SOD， CAT and POD activities in leaves of tomato seedlings under high temperature stress139210 期 李勝利等 : 高溫脅迫下番茄幼苗對冷激的響應(yīng)圖 3 單次冷激對高溫脅迫下番茄幼苗 CaHSP18和 LeHSP238 基因表達(dá)的影響Fig3 Effects of one cold-shock on the expression of CaHSP18and LeHSP23 8 in tomato seedlings under high temperaturestressCK 處理 ， 且在 24 h 時差異達(dá)到顯著水平 3 討 論高溫脅迫下 ， 冷激處理對番茄幼苗的直接效應(yīng)表現(xiàn)為株高的降低 ， 這種矮化效應(yīng)隨著冷激強(qiáng)度的提高而增強(qiáng) ， 這與 Huang 等 22的研究結(jié)果相一致 關(guān)于冷激誘導(dǎo)幼苗矮化效應(yīng)的機(jī)理則有不同的觀點(diǎn) ， Huang 等 22認(rèn)為 ， 冷激誘導(dǎo)番茄幼苗矮化效應(yīng)的主要原因是冷水刺激了乙烯的產(chǎn)生 ; 但 Sun 等 30的研究認(rèn)為 ， 冷激誘發(fā)的矮化效應(yīng)與 GA3含量變化有關(guān) 植株高的伸長取決于細(xì)胞的延伸生長和分裂 ， 其中細(xì)胞延伸生長對株高起著決定性作用 31，持續(xù)膨壓提供了細(xì)胞延伸生長所需的動力 32， 多種植物激素在細(xì)胞的延伸生長中起著重要的作用 本試驗(yàn)中的冷激處理作為一種不同于冷水刺激的誘導(dǎo)方式 ， 從激素水平探明其矮化效應(yīng)的機(jī)理還需要進(jìn)一步研究 植物在高溫逆境下的傷害與脂質(zhì)透性的增加是高溫傷害的本質(zhì)之一 ， 高溫脅迫加劇膜脂過氧化作用 ， 導(dǎo)致膜蛋白變性和生物膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化 ， 造成植物體內(nèi)正常的生理功能被破壞 ， 許多生理生化代謝不能正常進(jìn)行 植物自身的抗氧化防御酶促系統(tǒng)主要由 SOD、POD、CAT 和抗壞血酸過氧化物酶( APX) 等構(gòu)成 ， 它們能有效減少活性氧積累 ， 維護(hù)膜結(jié)構(gòu)完整 正常條件下 ， 植物抗氧化系統(tǒng)處于相對較低的水平 ， 當(dāng)植物接受適度的逆境誘導(dǎo)過程后 ， 作為植物對外界逆境因子的適應(yīng)性反應(yīng)才表現(xiàn)出上升的態(tài)勢 33 本試驗(yàn)中 ， 高溫脅迫之前的冷激處理作為一種逆境誘導(dǎo) ， 提前啟動了番茄幼苗的抗氧化系統(tǒng) ， 這與張俊環(huán) 17在葡萄幼苗上進(jìn)行的溫度逆境交叉鍛煉改善其抗逆性的研究結(jié)果相一致 冷激處理對番茄幼苗的誘導(dǎo)效應(yīng)取決于冷激溫度 ， 番茄作為一種喜溫性的作物 ， 適宜的冷激溫度為 10 ， 而 5的冷激處理則成了一種低溫脅迫 ， 降低了抗氧化酶的活性 ， 增加了細(xì)胞膜的透性 ， 這與 Huang 等 22和 Sun 等 30的觀點(diǎn)不同 ， 后者認(rèn)為 5 冷水刺激可以顯著提高番茄幼苗的抗高溫能力 這可能與兩者冷激處理方法不同有關(guān) ， 本試驗(yàn)是將番茄幼苗直接放在 5 的人工氣候室中進(jìn)行冷激 ， Huang 等 22和Sun 等 30是用 5 的冷水進(jìn)行冷激處理 ， 同樣是 5 ， 冷水處理較為緩和 小分 子 熱 激 蛋 白 ( small heat shock protein，sHSP) 是熱激蛋白家族的異類分子質(zhì)量在 1530 KD 的熱激蛋白 ， 它們在植物的耐熱性中起著重要作用 34 許多研究表明 ， sHSP 是植物對逆境因素產(chǎn)生的與植物抗性有關(guān)的應(yīng)激蛋白 18 試驗(yàn)結(jié)果表明 ， 10 持續(xù) 10 min 的冷激強(qiáng)度鍛煉能夠誘導(dǎo)CaHSP18 和 LeHSP238 基因在常溫下表達(dá) ， 這與前人的研究結(jié)果相一致 3435 冷激誘導(dǎo) CaHSP18 和LeHSP238 基因上調(diào)表達(dá)具有時效性 ， 冷激之后 4 h這種效應(yīng)逐漸回落 ， 但冷激處理后 24 h( 次日 8: 00，開始光照 ， 溫度由 25 上升至 28 32 ) ， CaH-SP18 和 LeHSP238 基因表達(dá)量又顯著高于對照 ， 關(guān)于冷激處理誘導(dǎo)基因周期表達(dá)的現(xiàn)象未見報道 ， 其原因是否因?yàn)槔浼ぬ幚硎蛊鋵囟饶婢撤磻?yīng)具有“記憶 ”功能 ， 還需要進(jìn)一步驗(yàn)證 綜上所述 ， 冷激處理是緩解番茄幼苗高溫脅迫的一種有效方法 ， 對于番茄幼苗每天進(jìn)行 10 持續(xù)10 min 的冷激處理可以顯著提高幼苗的健壯程度 ，但在集約化育苗中如何選擇經(jīng)濟(jì)可行的冷激措施 ，還需要進(jìn)一步研究與之相配套的工程技術(shù) 參考文獻(xiàn) 1 Almeselmani M， Deshmukh PS， Sairam K， et al Pro-tective role of antioxidant enzymes under high tempera-ture stress Plant Science， 2006， 171: 382388 2 Wahid A， Gelani S， Ashraf M Heat tolerance inplants: An overview Environmental and Experimental2392 應(yīng) 用 生 態(tài) 學(xué) 報 25 卷Botany， 2007， 61: 199223 3 Loreto F， Velikova V Isoprene produced by leaves pro-tects the photosynthetic apparatus against ozone damage，quenches ozone products， and reduces lipid peroxidationof cellular membranes Plant Physiology， 2001， 127:17811787 4 McKersie BD， Senaratna T， Walker MA， et al 13-De-terioration of membranes during aging in plants: Evi-dence for free radical mediation/ / Nooden LD， LeoopoldAC， eds Senescence and Aging in Plants San Diego:Academic Press， 1988: 441464 5 Xu X-Y ( 許向陽 ) ， Wang D-M ( 王冬梅 ) ， Kang L-G( 康立功 ) ， et al Selection of SS and APD markersrelated to tomato heat tolerance Acta Horticulturae Sini-ca ( 園藝學(xué)報 ) ， 2008， 35( 1) : 4752 ( in Chinese) 6 Sun AQ， Yi SY， Yang JY， et al Identification andcharacterization of a heat-inducible ftsH gene from toma-to ( Lycopersicon esculentum Mill ) Plant Science，2006， 170: 551562 7 Nautiyal PC， Shono M， Egawa Y Enhanced thermotol-erance of the vegetative part of MT-sHSP transgenictomato line Scientia Horticulturae， 2005， 105: 393409 8 Wan Z-L ( 萬正林 ) ， Luo Q-X ( 羅慶熙 ) The mecha-nism of SA， ABA and B in inducing heat resistance onplants Southwest China J