第14卷第09期 南方農(nóng)業(yè) 2020年3月 Vol 14 No 09 South China Agriculture Mar 2020 191 191 土壤中的微生物主要通過吸收和轉化的途徑影響?zhàn)B 分的利用 而造成土壤營養(yǎng)水平低下及產(chǎn)品產(chǎn)量 質量 下降的原因則可能是微生物種群發(fā)生了變化 1 產(chǎn)品連 作年限較久會造成土壤中微生物種群結構單一化 從而 造成土壤質量直線下降 土壤 pH發(fā)生變化甚至于造成產(chǎn) 品產(chǎn)量大減或者絕收 而造成產(chǎn)品減產(chǎn)的原因則主要是 真菌 如尖孢鐮刀菌 疫霉屬及炭疽菌屬等致病真菌 基于此 從真菌數(shù)量 種類等方面 研究連作和輪作對 土壤中真菌多樣性的影響 為連作障礙提供理論依據(jù) 2 3 1 材料與方法 1 1 時間與地點 試驗于 2019年 3 8月在西藏自治區(qū)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè) 示范園區(qū)溫室大棚進行 1 2 試驗材料 5個相鄰的溫室 1 多年未種植白肉靈芝 2 連 作白肉靈芝 2年 3 連作白肉靈芝 2年后輪作種植羊肚菌 4 連作白肉靈芝 3年后輪作種植蒜苗 5 連作白肉靈 芝 3年后換土 試劑盒 E Z N A Soil DNA Kit 1 3 取樣及保存 5個溫室分別在白肉靈芝未種植及種植后分時間段 采取土壤樣品于 20 冷凍保存 1 4 試驗方法 1 4 1 土壤微生物基因組 DNA 的提取 稱取 0 5 g于 20 保存的土壤樣品 按試劑盒的試 驗步驟進行微生物總 DNA的提取 DNA樣品于 20 保存待用 1 4 2 試驗流程 提取樣品總 DNA后 根據(jù)設計得到真菌 ITS1 ITS2 合成的引物 合并引物接頭 進行 PCR擴增 PCR反應體系 含 15 mmol L 1 MgCl 2 的 10 Buffer 10 0 L 2 5 mmol L 1 dNTPs 2 0 L 10 mol L 1 引物 各 5 0 L 5 U L 1 Taq酶 1 0 L DNA模板 4 0 L 滅菌去離子水 73 0 L 總體積 100 L PCR反應條件 94 5 min 94 30 s 55 30 s 72 30 s 30個循環(huán) 72 10 min 文庫建立 對產(chǎn)物進行純化 定量和均一化形成測 序文庫 建好的文庫先進行文庫質檢 質檢合格的文庫用 HiSeq PE250進行檢測 由聯(lián)川生物技術公司完成測序 4 1 4 3 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)均采用 Excel和 SPSS軟件進行統(tǒng)計分析 2 結果與分析 2 1 不同連作年限土壤真菌OTU聚類分析 將所有樣品的有效序列進行聚類 按照 97 的 序列相似度將這些序列聚類成為OTUs Operational Taxonomic Units 得到每個 Cluster的序列及其代表序 列 即為 OTU 用于統(tǒng)計每個 OTU序列和豐度進行 下游分析 5 由圖 1的 Venn圖可知 1號溫室總 OTUs為 448 2號溫室總 OTUs為 1 390 3號溫室總 OTUs為 1 211 4號溫室總 OTUs為 925 5號溫室總 OTUs為 421 5個 樣品中共有的 OTUs個數(shù)有 143個 其中 2號溫室特有 OTUs個數(shù)最多 達到 240個 因 5號溫室置換土壤過程 中導致數(shù)據(jù)異常 不再對其進行后續(xù)分析 2 2 不同連作年限土壤真菌Alpha多樣性分析 Alpha多樣性也稱為生境內(nèi)物種多樣性 6 包括 Chao1 Observed species Goods coverage Shannon和 收稿日期 2020 01 15 基金項目 西藏白肉靈芝連 輪 作下土壤生物相關性研究 XZ2017ZRG 39 國家食用菌產(chǎn)業(yè)技術體系拉薩綜合試驗站課題 CARS 20 95 科技富民穩(wěn)邊專項 西藏特色食用菌高效栽培技術 示范課題 XZ201901NA05 作者簡介 高磊 1987 男 甘肅白銀人 碩士 助理研究員 從 事食用菌培養(yǎng)等方向的研究 E mail 1173835491 連作與輪作對溫室土壤中真菌多樣性的影響 高 磊 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院蔬菜研究所 西藏拉薩 850000 摘 要 以不同連 輪 作年限種植白肉靈芝的溫室土壤為實驗材料 研究不同連 輪 作年限土壤真菌多樣 性的變化趨勢 通過高通量測序技術并結合相關生物信息學方法 分析土壤中真菌ITS1 ITS2區(qū)域的豐富度 多 樣性指數(shù)以及群落結構 結果表明 連作或輪作后均能夠提高微生物群落多樣性 子囊菌門 擔子菌門及接合 菌門為優(yōu)勢真菌 擔子菌門的比例隨連作年限的增加而逐漸增加 輪作后豐度降低 關鍵詞 白肉靈芝 真菌 多樣性 中圖分類號 S154 3 文獻標志碼 B DOI 10 19415 ki 1673 890 x 2020 09 093 高 磊 連作與輪作對溫室土壤中真菌多樣性的影響 192 Simpson指數(shù) 利用 Alpha多樣性分析方法 對土壤樣品 中的 OTUs總數(shù)和 Chao1指數(shù)進行分析 可得出連作土 壤中真菌的多樣性變化及數(shù)值 7 不同年限連 輪 作 下土壤真菌 Alpha多樣性的結果如表 1所示 圖1 各溫室土壤樣品Venn圖 表1 土壤樣品多樣性指數(shù)結果表 溫室序號 Chao1 OTUs總數(shù) 1 254 28 448 2 512 69 1 390 3 555 50 1 211 4 436 56 925 由表 1可知 在白肉靈芝生長過程中 輪作及連作 土壤中真菌的 OTUs總數(shù)及 Chao1指數(shù)均高于未種植靈 芝溫室 連作后輪作的品種對溫室土壤真菌群落 OTUs 總數(shù)及 Chao1指數(shù)有一定的影響 通過 Alpha多樣性分 析可知 連作與輪作均能夠提高微生物群落多樣性 2 3 不同連作年限土壤真菌群落門類組成物種分析 2 3 1 不同連作年限土壤真菌物種分類統(tǒng)計 根據(jù)物種豐度表 選取豐度最高的 20個物種分類 進行相對豐度計算 獲得相對豐度數(shù)據(jù) 繪制樣品豐度 柱狀圖 便于更直觀地進行樣品豐度比較 8 9 圖 2和圖 3中橫軸為樣品名稱 每個樣品 3個重復 縱軸代表門及 屬的相對豐度 不同顏色對應不同物種 由圖 2門級別 柱狀圖可以看出各溫室土壤中占比最高的真菌為子囊門 Ascomycota 其次分別為擔子菌門 Basidiomycota 和 接合菌門 Zygomycota 連作增加了擔子菌門的相對 豐度 輪作降低了擔子菌門的相對豐度 卻增加了接合 菌門的相對豐度 由圖 3屬級別柱狀圖可以看出 2 3 4 號溫室中內(nèi)生菌屬 Phialocephala 含量較多 1號溫室 內(nèi)生菌屬含量較少 木霉屬 Hypocrea 在各溫室土壤 中含量較高 煙色織孢霉屬 Plectosphaerella 在 2 4 號溫室含量較高 1 3號溫室含量較少 透孢黑團殼屬 Massarina 在 2 3號溫室含量較高 4號含量較少 1號溫室沒有 靈芝屬 Ganoderma 除了 1號溫室沒有外 在 2 3 4均有存在 3 結論 通過微生物測序技術得出白肉靈芝輪作和連作土壤 樣品中真菌的門 屬類別及豐度 發(fā)現(xiàn)連作或輪作后均 能夠提高微生物群落多樣性 子囊菌門 擔子菌門及接 圖2 各樣品門級別相對豐度柱狀圖 高 磊 連作與輪作對溫室土壤中真菌多樣性的影響 193 合菌門為優(yōu)勢真菌 擔子菌門的比例隨連作年限的增加 而逐漸增加 輪作后豐度降低 但接合菌門的相對豐度 增大 但是仍有很大一部分類別真菌物種尚未鑒定出 尤其是屬級別真菌 所以需要進行進一步的研究探討和 鑒定 參考文獻 1 馬琨 張麗 杜茜 等 馬鈴薯連作栽培對土壤微生物 群落的影響 J 水土保持學報 2010 24 4 229 233 2 周陳 李許 楊明開 等 冬小麥不同生育期土壤微生 物及養(yǎng)分動態(tài)變化 J 西北農(nóng)業(yè)學報 2008 17 3 113 116 3 張重義 林文雄 藥用植物的化感自毒作用與連作障 礙 J 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報 2009 17 1 189 196 4 Bokulich N A Subramanian S Faith J J et al Quality filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing J Nature methods 2013 10 1 57 59 5 Blaxter M Mann J Chapman T et al Defining operational taxonomic units using DNA barcode data J Philosophical transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences 2005 360 1462 1935 1943 6 Sul W J Cole J R Jesus E C et al Bacterial community comparisons by taxonomy supervised analysis independent of sequence alignment and clustering J Proc Natl Acad Sci USA 2011 108 38 14637 14642 7 Price M N Dehal P S Arkin A P FastTree 2 Approximately Maximum Likelihood Trees for Large Alignments J Plos One 2010 5 5 e9490 8 Xiong W G Wang Y L Sun Y X et al Antibiotic mediated changes in the fecal microbiome of broiler chickens define the incidence of antibiotic resistance genes J Microbiome 2018 6 34 9 Ren L L Zhang R B Rao J et al Transcriptionally Active Lung Microbiome and Its Association with Bacterial Biomass and Host Inflammatory Status J mSystems 2018 3 5 e00199 18 責任編輯 趙中正 圖3 各樣品屬級別相對豐度柱狀圖