第14卷第09期 南方農(nóng)業(yè) 2020年3月 Vol 14 No 09 South China Agriculture Mar 2020 191 191 土壤中的微生物主要通過(guò)吸收和轉(zhuǎn)化的途徑影響?zhàn)B 分的利用 而造成土壤營(yíng)養(yǎng)水平低下及產(chǎn)品產(chǎn)量 質(zhì)量 下降的原因則可能是微生物種群發(fā)生了變化 1 產(chǎn)品連 作年限較久會(huì)造成土壤中微生物種群結(jié)構(gòu)單一化 從而 造成土壤質(zhì)量直線下降 土壤 pH發(fā)生變化甚至于造成產(chǎn) 品產(chǎn)量大減或者絕收 而造成產(chǎn)品減產(chǎn)的原因則主要是 真菌 如尖孢鐮刀菌 疫霉屬及炭疽菌屬等致病真菌 基于此 從真菌數(shù)量 種類等方面 研究連作和輪作對(duì) 土壤中真菌多樣性的影響 為連作障礙提供理論依據(jù) 2 3 1 材料與方法 1 1 時(shí)間與地點(diǎn) 試驗(yàn)于 2019年 3 8月在西藏自治區(qū)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè) 示范園區(qū)溫室大棚進(jìn)行 1 2 試驗(yàn)材料 5個(gè)相鄰的溫室 1 多年未種植白肉靈芝 2 連 作白肉靈芝 2年 3 連作白肉靈芝 2年后輪作種植羊肚菌 4 連作白肉靈芝 3年后輪作種植蒜苗 5 連作白肉靈 芝 3年后換土 試劑盒 E Z N A Soil DNA Kit 1 3 取樣及保存 5個(gè)溫室分別在白肉靈芝未種植及種植后分時(shí)間段 采取土壤樣品于 20 冷凍保存 1 4 試驗(yàn)方法 1 4 1 土壤微生物基因組 DNA 的提取 稱取 0 5 g于 20 保存的土壤樣品 按試劑盒的試 驗(yàn)步驟進(jìn)行微生物總 DNA的提取 DNA樣品于 20 保存待用 1 4 2 試驗(yàn)流程 提取樣品總 DNA后 根據(jù)設(shè)計(jì)得到真菌 ITS1 ITS2 合成的引物 合并引物接頭 進(jìn)行 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系 含 15 mmol L 1 MgCl 2 的 10 Buffer 10 0 L 2 5 mmol L 1 dNTPs 2 0 L 10 mol L 1 引物 各 5 0 L 5 U L 1 Taq酶 1 0 L DNA模板 4 0 L 滅菌去離子水 73 0 L 總體積 100 L PCR反應(yīng)條件 94 5 min 94 30 s 55 30 s 72 30 s 30個(gè)循環(huán) 72 10 min 文庫(kù)建立 對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化 定量和均一化形成測(cè) 序文庫(kù) 建好的文庫(kù)先進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢 質(zhì)檢合格的文庫(kù)用 HiSeq PE250進(jìn)行檢測(cè) 由聯(lián)川生物技術(shù)公司完成測(cè)序 4 1 4 3 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用 Excel和 SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析 2 結(jié)果與分析 2 1 不同連作年限土壤真菌OTU聚類分析 將所有樣品的有效序列進(jìn)行聚類 按照 97 的 序列相似度將這些序列聚類成為OTUs Operational Taxonomic Units 得到每個(gè) Cluster的序列及其代表序 列 即為 OTU 用于統(tǒng)計(jì)每個(gè) OTU序列和豐度進(jìn)行 下游分析 5 由圖 1的 Venn圖可知 1號(hào)溫室總 OTUs為 448 2號(hào)溫室總 OTUs為 1 390 3號(hào)溫室總 OTUs為 1 211 4號(hào)溫室總 OTUs為 925 5號(hào)溫室總 OTUs為 421 5個(gè) 樣品中共有的 OTUs個(gè)數(shù)有 143個(gè) 其中 2號(hào)溫室特有 OTUs個(gè)數(shù)最多 達(dá)到 240個(gè) 因 5號(hào)溫室置換土壤過(guò)程 中導(dǎo)致數(shù)據(jù)異常 不再對(duì)其進(jìn)行后續(xù)分析 2 2 不同連作年限土壤真菌Alpha多樣性分析 Alpha多樣性也稱為生境內(nèi)物種多樣性 6 包括 Chao1 Observed species Goods coverage Shannon和 收稿日期 2020 01 15 基金項(xiàng)目 西藏白肉靈芝連 輪 作下土壤生物相關(guān)性研究 XZ2017ZRG 39 國(guó)家食用菌產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系拉薩綜合試驗(yàn)站課題 CARS 20 95 科技富民穩(wěn)邊專項(xiàng) 西藏特色食用菌高效栽培技術(shù) 示范課題 XZ201901NA05 作者簡(jiǎn)介 高磊 1987 男 甘肅白銀人 碩士 助理研究員 從 事食用菌培養(yǎng)等方向的研究 E mail 1173835491 連作與輪作對(duì)溫室土壤中真菌多樣性的影響 高 磊 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院蔬菜研究所 西藏拉薩 850000 摘 要 以不同連 輪 作年限種植白肉靈芝的溫室土壤為實(shí)驗(yàn)材料 研究不同連 輪 作年限土壤真菌多樣 性的變化趨勢(shì) 通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)并結(jié)合相關(guān)生物信息學(xué)方法 分析土壤中真菌ITS1 ITS2區(qū)域的豐富度 多 樣性指數(shù)以及群落結(jié)構(gòu) 結(jié)果表明 連作或輪作后均能夠提高微生物群落多樣性 子囊菌門(mén) 擔(dān)子菌門(mén)及接合 菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)真菌 擔(dān)子菌門(mén)的比例隨連作年限的增加而逐漸增加 輪作后豐度降低 關(guān)鍵詞 白肉靈芝 真菌 多樣性 中圖分類號(hào) S154 3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 B DOI 10 19415 ki 1673 890 x 2020 09 093 高 磊 連作與輪作對(duì)溫室土壤中真菌多樣性的影響 192 Simpson指數(shù) 利用 Alpha多樣性分析方法 對(duì)土壤樣品 中的 OTUs總數(shù)和 Chao1指數(shù)進(jìn)行分析 可得出連作土 壤中真菌的多樣性變化及數(shù)值 7 不同年限連 輪 作 下土壤真菌 Alpha多樣性的結(jié)果如表 1所示 圖1 各溫室土壤樣品Venn圖 表1 土壤樣品多樣性指數(shù)結(jié)果表 溫室序號(hào) Chao1 OTUs總數(shù) 1 254 28 448 2 512 69 1 390 3 555 50 1 211 4 436 56 925 由表 1可知 在白肉靈芝生長(zhǎng)過(guò)程中 輪作及連作 土壤中真菌的 OTUs總數(shù)及 Chao1指數(shù)均高于未種植靈 芝溫室 連作后輪作的品種對(duì)溫室土壤真菌群落 OTUs 總數(shù)及 Chao1指數(shù)有一定的影響 通過(guò) Alpha多樣性分 析可知 連作與輪作均能夠提高微生物群落多樣性 2 3 不同連作年限土壤真菌群落門(mén)類組成物種分析 2 3 1 不同連作年限土壤真菌物種分類統(tǒng)計(jì) 根據(jù)物種豐度表 選取豐度最高的 20個(gè)物種分類 進(jìn)行相對(duì)豐度計(jì)算 獲得相對(duì)豐度數(shù)據(jù) 繪制樣品豐度 柱狀圖 便于更直觀地進(jìn)行樣品豐度比較 8 9 圖 2和圖 3中橫軸為樣品名稱 每個(gè)樣品 3個(gè)重復(fù) 縱軸代表門(mén)及 屬的相對(duì)豐度 不同顏色對(duì)應(yīng)不同物種 由圖 2門(mén)級(jí)別 柱狀圖可以看出各溫室土壤中占比最高的真菌為子囊門(mén) Ascomycota 其次分別為擔(dān)子菌門(mén) Basidiomycota 和 接合菌門(mén) Zygomycota 連作增加了擔(dān)子菌門(mén)的相對(duì) 豐度 輪作降低了擔(dān)子菌門(mén)的相對(duì)豐度 卻增加了接合 菌門(mén)的相對(duì)豐度 由圖 3屬級(jí)別柱狀圖可以看出 2 3 4 號(hào)溫室中內(nèi)生菌屬 Phialocephala 含量較多 1號(hào)溫室 內(nèi)生菌屬含量較少 木霉屬 Hypocrea 在各溫室土壤 中含量較高 煙色織孢霉屬 Plectosphaerella 在 2 4 號(hào)溫室含量較高 1 3號(hào)溫室含量較少 透孢黑團(tuán)殼屬 Massarina 在 2 3號(hào)溫室含量較高 4號(hào)含量較少 1號(hào)溫室沒(méi)有 靈芝屬 Ganoderma 除了 1號(hào)溫室沒(méi)有外 在 2 3 4均有存在 3 結(jié)論 通過(guò)微生物測(cè)序技術(shù)得出白肉靈芝輪作和連作土壤 樣品中真菌的門(mén) 屬類別及豐度 發(fā)現(xiàn)連作或輪作后均 能夠提高微生物群落多樣性 子囊菌門(mén) 擔(dān)子菌門(mén)及接 圖2 各樣品門(mén)級(jí)別相對(duì)豐度柱狀圖 高 磊 連作與輪作對(duì)溫室土壤中真菌多樣性的影響 193 合菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)真菌 擔(dān)子菌門(mén)的比例隨連作年限的增加 而逐漸增加 輪作后豐度降低 但接合菌門(mén)的相對(duì)豐度 增大 但是仍有很大一部分類別真菌物種尚未鑒定出 尤其是屬級(jí)別真菌 所以需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究探討和 鑒定 參考文獻(xiàn) 1 馬琨 張麗 杜茜 等 馬鈴薯連作栽培對(duì)土壤微生物 群落的影響 J 水土保持學(xué)報(bào) 2010 24 4 229 233 2 周陳 李許 楊明開(kāi) 等 冬小麥不同生育期土壤微生 物及養(yǎng)分動(dòng)態(tài)變化 J 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 2008 17 3 113 116 3 張重義 林文雄 藥用植物的化感自毒作用與連作障 礙 J 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 2009 17 1 189 196 4 Bokulich N A Subramanian S Faith J J et al Quality filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing J Nature methods 2013 10 1 57 59 5 Blaxter M Mann J Chapman T et al Defining operational taxonomic units using DNA barcode data J Philosophical transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences 2005 360 1462 1935 1943 6 Sul W J Cole J R Jesus E C et al Bacterial community comparisons by taxonomy supervised analysis independent of sequence alignment and clustering J Proc Natl Acad Sci USA 2011 108 38 14637 14642 7 Price M N Dehal P S Arkin A P FastTree 2 Approximately Maximum Likelihood Trees for Large Alignments J Plos One 2010 5 5 e9490 8 Xiong W G Wang Y L Sun Y X et al Antibiotic mediated changes in the fecal microbiome of broiler chickens define the incidence of antibiotic resistance genes J Microbiome 2018 6 34 9 Ren L L Zhang R B Rao J et al Transcriptionally Active Lung Microbiome and Its Association with Bacterial Biomass and Host Inflammatory Status J mSystems 2018 3 5 e00199 18 責(zé)任編輯 趙中正 圖3 各樣品屬級(jí)別相對(duì)豐度柱狀圖