第14卷第09期 南方農(nóng)業(yè) 2020年3月 Vol 14 No 09 South China Agriculture Mar 2020 135 135 近年來 辣椒 草莓的種植面積越來越大 已成為 我國主要的經(jīng)濟作物 辣椒是人們餐桌上較為普遍的食 材 其種植面積僅次于大白菜 草莓因果實色澤亮麗 營養(yǎng)價值較高 而備受栽培者和消費者的喜愛 1 4 但隨 著辣椒的連年種植及種植面積的逐年增多 辣椒病害發(fā) 生也越發(fā)嚴重 其中由鐮刀菌引起的辣椒枯萎病是辣椒 生產(chǎn)栽培中最典型的病害之一 我國辣椒枯萎病發(fā)病率 一般為 15 30 個別地區(qū)嚴重時高達 70 80 造成巨大經(jīng)濟損失 隨著草莓種植面積的不斷擴大 品種 的不斷更新 頻繁地調種 引種以及連作也導致了草莓枯 萎病蔓延 再加上草莓灰霉病 白粉病 蛇眼病 炭疽病 紅中柱根腐病 根結線蟲病 病毒病和革腐病等不斷發(fā)生 且越發(fā)嚴重 給栽培者帶來較大的經(jīng)濟損失 5 7 目前 國內外關于辣椒枯萎病 草莓枯萎病致病菌 的報道有很多 對由尖孢鐮刀菌引起的辣椒枯萎病 草 莓枯萎病的防治方法一般仍以化學防治為主 常用惡霉 靈 多菌靈和甲基托布津和代森錳鋅等殺菌劑進行灌根 防治 但因連年使用這些藥劑 防治效果逐年降低 甚 至達到無法控制的程度 8 9 由于該病害很難通過植物抗 病防御及抗性育種的方法防治 因此研究選用化學殺菌 劑氟硅唑 吡唑醚菌酯和氰烯菌酯對辣椒枯萎病和草莓 枯萎病進行了藥劑實驗 據(jù)報道 氰烯菌酯對小麥赤霉 病及水稻惡苗病均有良好的防治效果 但對辣椒枯萎病 的防治是否有效果還未見報道 氟硅唑 吡唑醚菌酯在 番茄頸腐病與根腐病的防治上有較好的防治效果 7 但 對草莓枯萎病的防治是否有效鮮有報道 1 材料與方法 1 1 實 驗材料 實驗品種為淮安紅椒 紅顏草莓 供試殺菌劑為氟硅唑 吡醚菌酯和氰烯菌酯 由江 蘇農(nóng)藥研究所提供 藥劑存放于 0 4 環(huán)境中 1 2 尖孢鐮刀菌?；偷姆蛛x純化與鑒定 從植株根際土壤中分別采取辣椒與草莓土樣 10 g 各采取 5組土樣 放入 250 mL三角瓶中 加入 90 mL的 無菌水 在 25 的條件下進行離心 然后吸取 1 mL懸 浮液 采用濃度梯度法按照 10 3 10 4 10 5 和 10 6 濃度 進行稀釋 并均勻涂布于含有硫酸鏈霉素的馬鈴薯葡萄 糖瓊脂培養(yǎng)基 PDA 平板上進行培養(yǎng) 菌落生長完整后 從中篩選出鐮刀菌并保存 1 2 1 真菌菌絲培養(yǎng)和 DNA 提取 將分離純化得到的菌株全都轉接到 PDA平板上 在 25 溫度不變的條件下培育 3 5 d后 在菌落邊緣打 取直徑為 5 mm的菌碟 10 15個 放入配制好的 PDB 培養(yǎng)基中 在 28 的條件下振蕩培養(yǎng) 再經(jīng)過多次過濾 離心等操作后可得到尖孢鐮刀菌菌絲 將得到的菌絲在 0 4 下冷藏 作為提取真菌 DNA的干組織 采用真 菌 DNA提取試劑盒對真菌 DNA進行提取 1 2 2 PCR 與瓊脂糖凝膠電泳分析 對不同專化型的尖孢鐮刀菌種群的IGS序列 經(jīng) Primer 5設計了一對特異性引物對P1 P2 P1為 5 CAGGGTAGGCAGCTTAGATTTGG 3 P2 為 5 GACGGATTTGGCGAACCTACCCT 3 引物由南京金斯 瑞生物科技有限公司合成 通過該引物對 P1 P2對尖孢 鐮刀菌 IGS序列進行 PCR擴增 1 3 尖孢鐮刀菌?；蛯Ω鹘M殺菌劑的敏感性測定 用菌絲生長速率法測定尖孢鐮刀菌對各種殺菌劑的 敏感性 將氟硅唑 吡唑醚菌酯和氰烯菌酯分別溶解在 甲醇中 藥劑濃度梯度為 0 1 mg mL 1 0 2 mg mL 1 0 4 mg mL 1 和 0 8 mg mL 1 將尖孢鐮刀菌在 28 條件 下恒溫培養(yǎng) 3 5 d 挑選生長均勻的菌落 在菌落邊緣 打取直徑為 5 mm的菌碟 然后將菌碟接種到含有氟硅唑 吡唑醚菌酯和氰烯菌酯不同濃度梯度的 PDA平板上 測 試菌株對藥劑的敏感性 25 條件下恒溫連續(xù)培養(yǎng) 5 d后測量各菌株的菌落 直徑 以在不含藥劑的平板上生長的菌株為對照 根據(jù) 收稿日期 2020 02 26 基金項目 江蘇省高等學校自然科學研究面上項目 18KJB210001 作者簡介 王文 1997 男 江蘇宿遷人 本科 從事園藝學方向 的研究 為通信作者 E mail zztsdta 草莓 辣椒枯萎病菌的分離 鑒定及化學防治 王 文 李若南 單紅月 居 娜 孫蜻蜓 胡莊方 鄭志天 淮陰工學院生命科學與食品工程學院 江蘇淮安 223003 摘 要 由尖孢鐮刀菌引起的辣椒枯萎病及草莓枯萎病是為害辣椒和草莓的主要病害之一 為明確淮安地區(qū)辣 椒 草莓枯萎病的病原菌種類及防治方法 采集辣椒 草莓根際土壤樣品 對其病原菌進行了分離 純化和鑒 定 結果表明 該病原菌為尖孢鐮刀菌辣椒專化型及尖孢鐮刀菌草莓?；?采用菌絲生長速率法對3種殺菌劑 進行篩選 其中氟硅唑抑制作用較好 對尖孢鐮刀菌辣椒專化型的EC 50 為0 181 7 0 251 7 g mL 1 對尖孢鐮 刀菌草莓?；偷腅C 50 為0 076 0 0 212 8 g mL 1 且活體藥效實驗表明該藥劑有效 關鍵詞 辣椒枯萎病 草莓枯萎病 尖孢鐮刀菌 氟硅唑 中圖分類號 S436 418 S436 68 文獻標志碼 B DOI 10 19415 ki 1673 890 x 2020 09 068 王 文 李若南 單紅月 居 娜 孫蜻蜓 胡莊方 鄭志天 草莓 辣椒枯萎病菌的分離 鑒定及化學防治 136 公式 1計算菌絲生長抑制率 每個處理重復 3次 試驗 重復 3次 測量菌落直徑時選取生長較為均勻的菌落 取平均值 根據(jù)藥劑濃度的對數(shù) X 與抑制率對應的機 率值 Y 求出各菌株對于 3種藥劑的 EC 50 mm mm 100 mm 5 對照菌落 直徑 處 理 菌 落直徑 抑制率 對照菌落直徑 1 1 4 活體藥效實驗 將尖孢鐮刀菌在 28 下恒溫連續(xù)培養(yǎng) 3 5 d 在 菌落邊緣打取直徑為 5 mm的菌碟 10 15個 放入配置 好的 PDB培養(yǎng)基中 在 28 條件下恒溫振蕩培養(yǎng) 5 d 經(jīng)過離心過濾等操作后可以得到尖刀鐮孢菌孢子 將得到的尖刀鐮孢菌孢子接種至草莓根部 接種 孢子 2 d后 處理組用各種殺菌劑分別灌根 藥劑稀釋 1 000倍 每株施用 100 mL 每 2 d灌藥 1次 對照組采 用清水灌根 20 d后觀察植株的生長發(fā)病情況 1 5 數(shù)據(jù)處理 采用 EXCEL DPS等進行數(shù)據(jù)處理和做圖 2 結果與分析 2 1 草莓枯萎病菌及辣椒枯萎病菌形態(tài)學及分子生 物學鑒定 從草莓和辣椒根際土壤中分別分離到 3個菌株 編 號為草莓 0號 3號和 7號 辣椒 0號 3號和 7號 他們的菌落和形態(tài)學特征無明顯差異 如圖 1A所示 平 板培養(yǎng)結果表明 病原菌在 PDA培養(yǎng)基培養(yǎng) 5 d后 菌 落呈紅色 外部為白色 氣生菌絲為絨狀 如圖 1B常規(guī) PCR結果顯示 特異性引物 P1 P2可 穩(wěn)定地從 100 pg L 1 的尖孢鐮刀菌基因組 DNA模板中 擴增得到一條 1 081 bp左右的條帶 而對土壤中病原菌 DNA的檢測實驗中 能清晰得到特異性條帶 長度約為 1 100左右 即可確認實驗中分離所到的菌即為尖孢鐮刀菌 2 2 不同殺菌劑對草莓和辣椒枯萎病的防治效果 尖孢鐮刀菌草莓?；秃屠苯穼；偷囊志饔脺y 定結果表明 殺菌劑氟硅唑對分離出菌株的抑制效果明 顯 在設定濃度范圍內 隨藥劑濃度的增加 抑菌效果 呈明顯增強的趨勢 由表 1可以看出 殺菌劑氟硅唑對分離出的尖孢 鐮刀菌有很好的抑制作用 對尖孢鐮刀菌草莓?；偷?EC 50 為 0 076 0 0 212 8 mg L 1 對尖孢鐮刀菌辣椒專 化型的 EC 50 為 0 181 7 0 251 7 g mL 1 2 3 尖孢鐮刀菌活體藥效實驗 將尖孢鐮刀菌草莓?；秃屠苯穼；玩咦臃謩e接 種草莓和辣椒幼苗 20 d后觀察幼苗發(fā)病癥狀 結果顯示 發(fā)病初期葉片稍微卷縮 有些則呈波狀 會產(chǎn)生畸形葉莖 老葉呈現(xiàn)紫紅色萎蔫 后葉片逐漸變枯黃 最后全株枯死 A為尖孢鐮刀菌草莓轉化型和辣椒轉化型菌落形態(tài) B為尖孢鐮刀菌草莓?；秃屠苯穼；虸GS序列電泳圖 M 為DL2000 marker 圖1 草莓枯萎病菌及辣椒枯萎病菌形態(tài)學及分子生物學鑒定 表1 殺菌劑氟硅唑對尖孢鐮刀菌的EC 50 值和毒力回歸方程 菌株 殺菌劑 毒力回歸方程 EC 50 g mL 1 草莓0 氟硅唑 Y 0 629 3X 5 705 4 0 075 7 草莓3 氟硅唑 Y 0 832 9X 5 540 8 0 224 2 草莓7 氟硅唑 Y 0 736 7X 5 495 1 0 212 8 辣椒0 氟硅唑 Y 0 933 1X 5 559 1 0 251 7 辣椒3 氟硅唑 Y 0 702 1X 5 520 0 0 181 7 辣椒7 氟硅唑 Y 0 734 0X 5 716 9 0 105 5 EC 50 值為抑制菌絲生長50 時的藥劑濃度 王 文 李若南 單紅月 居 娜 孫蜻蜓 胡莊方 鄭志天 草莓 辣椒枯萎病菌的分離 鑒定及化學防治 137 如圖 2A所示 左側為成活的無病害草莓苗 右側 為處理組實驗 20 d后情況 對照組 CK無明顯發(fā)病癥狀 處理組孢子液蘸根并灌清水的草莓苗 20 d后枯萎死亡 處理組孢子液蘸根并經(jīng)常用氟硅唑水溶液灌根的草莓苗 無發(fā)病癥狀 正常生長 表明氟硅唑對尖孢鐮刀菌草莓 ?；途哂幸欢ǖ囊种苹钚?對于草莓枯萎病的防治有 一定的效果 如圖 2B所示 左側為成活的無病害辣椒苗 右側 為處理組實驗 20 d后的生長情況 對照組 CK無明顯發(fā) 病癥狀 處理組孢子液蘸根并灌清水的辣椒苗 20 d后 枯萎死亡 處理組用辣椒 3號和 7號孢子液蘸根并經(jīng)常 用氟硅唑水溶液灌根的辣椒苗有輕微的發(fā)病癥狀 用辣 椒 0號孢子液蘸根并經(jīng)常用氟硅唑水溶液灌根的辣椒苗 正常生長 表明氟硅唑對尖孢鐮刀菌辣椒?；途哂幸欢?的活體抑制效果 對于辣椒枯萎病的防治有一定的指導 意義 圖2 尖孢鐮刀菌活體藥效試驗 3 結論 草莓和辣椒枯萎病是近年來生產(chǎn)上遇到的較難防治 的土傳病害 在我國一些主要種植區(qū)普遍發(fā)生 為害程 度也逐年加重 尤其是在多年連續(xù)種植的重茬地塊發(fā)病 率更高 病害暴發(fā)嚴重時會直接造成毀園 實驗從淮安市農(nóng)科院溫室草莓種植區(qū)中找到疑似枯萎 病的植株 從根際土壤中分離出來菌株 確認為草莓枯萎 病的病原菌尖孢鐮刀菌 并從中選出致病性強的尖孢鐮刀 菌 分別從形態(tài)學和分子生物學對其進行了驗證 通過菌 絲生長速率法 發(fā)現(xiàn)氟硅唑對于引起草莓枯萎病的尖孢 鐮刀菌防效良好 EC 50 在 0 076 0 0 212 8 g mL 1 同樣對辣椒病樣進行取樣分離 純化 藥劑防治和活體 藥效試驗 發(fā)現(xiàn)氟硅唑對尖孢鐮刀菌辣椒專化型的防效 良好 EC 50 為 0 181 7 0 251 7 g mL 1 參考文獻 1 張運濤 張國珍 草莓病蟲害概論 2版 M 北京 中 國農(nóng)業(yè)出版社 2012 2 倪玉紅 趙秋榮 趙小軍 等 溫度 降雨量和日照時 數(shù)對草莓生長發(fā)育及炭疽病發(fā)生的影響 J 江蘇農(nóng)業(yè) 科學 2014 42 2 133 134 3 趙荷娟 魏啟舜 王琳 等 雙孢蘑菇菌糠基質對架 式栽培草莓生長和果實品質的影響 J 江蘇農(nóng)業(yè)科 學 2014 42 4 120 121 4 趙海濤 李良俊 殷朝珍 等 水生蔬菜輪作對大棚草 莓連作土壤性質的影響 J 江蘇農(nóng)業(yè)學報 2014 30 2 289 295 5 吉沐祥 李國平 楊敬輝 等 江蘇省大棚草莓生產(chǎn)中 存在的問題與技術創(chuàng)新 J 江西農(nóng)業(yè)學報 2012 24 2 58 60 6 顧春波 史曉斌 姜莉莉 等 草莓枯萎病菌對多菌 靈的抗性及其抗性菌株生物學特性 J 植物保護學 報 2010 37 3 266 271 7 于紅梅 趙密珍 王靜 等 草莓枯萎病菌的分離 鑒 定及生物學特性 J 江蘇農(nóng)業(yè)科學 2013 41 11 124 127 8 楊煥青 王開遠 范昆 等 草莓枯萎病菌的生物 學特性及7種殺菌劑對其抑制作用 J 植物保護學 報 2008 35 2 169 174 9 曹海潮 李秀環(huán) 王曉坤 等 吡唑醚菌酯及三唑類 殺菌劑對番茄頸腐根腐病的防治效果 J 中國農(nóng)業(yè)科 學 2018 51 21 4065 4075 責任編輯 趙中正