第14卷第09期 南方農(nóng)業(yè) 2020年3月 Vol 14 No 09 South China Agriculture Mar 2020 135 135 近年來(lái) 辣椒 草莓的種植面積越來(lái)越大 已成為 我國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)作物 辣椒是人們餐桌上較為普遍的食 材 其種植面積僅次于大白菜 草莓因果實(shí)色澤亮麗 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高 而備受栽培者和消費(fèi)者的喜愛(ài) 1 4 但隨 著辣椒的連年種植及種植面積的逐年增多 辣椒病害發(fā) 生也越發(fā)嚴(yán)重 其中由鐮刀菌引起的辣椒枯萎病是辣椒 生產(chǎn)栽培中最典型的病害之一 我國(guó)辣椒枯萎病發(fā)病率 一般為 15 30 個(gè)別地區(qū)嚴(yán)重時(shí)高達(dá) 70 80 造成巨大經(jīng)濟(jì)損失 隨著草莓種植面積的不斷擴(kuò)大 品種 的不斷更新 頻繁地調(diào)種 引種以及連作也導(dǎo)致了草莓枯 萎病蔓延 再加上草莓灰霉病 白粉病 蛇眼病 炭疽病 紅中柱根腐病 根結(jié)線蟲(chóng)病 病毒病和革腐病等不斷發(fā)生 且越發(fā)嚴(yán)重 給栽培者帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)損失 5 7 目前 國(guó)內(nèi)外關(guān)于辣椒枯萎病 草莓枯萎病致病菌 的報(bào)道有很多 對(duì)由尖孢鐮刀菌引起的辣椒枯萎病 草 莓枯萎病的防治方法一般仍以化學(xué)防治為主 常用惡霉 靈 多菌靈和甲基托布津和代森錳鋅等殺菌劑進(jìn)行灌根 防治 但因連年使用這些藥劑 防治效果逐年降低 甚 至達(dá)到無(wú)法控制的程度 8 9 由于該病害很難通過(guò)植物抗 病防御及抗性育種的方法防治 因此研究選用化學(xué)殺菌 劑氟硅唑 吡唑醚菌酯和氰烯菌酯對(duì)辣椒枯萎病和草莓 枯萎病進(jìn)行了藥劑實(shí)驗(yàn) 據(jù)報(bào)道 氰烯菌酯對(duì)小麥赤霉 病及水稻惡苗病均有良好的防治效果 但對(duì)辣椒枯萎病 的防治是否有效果還未見(jiàn)報(bào)道 氟硅唑 吡唑醚菌酯在 番茄頸腐病與根腐病的防治上有較好的防治效果 7 但 對(duì)草莓枯萎病的防治是否有效鮮有報(bào)道 1 材料與方法 1 1 實(shí) 驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)品種為淮安紅椒 紅顏草莓 供試殺菌劑為氟硅唑 吡醚菌酯和氰烯菌酯 由江 蘇農(nóng)藥研究所提供 藥劑存放于 0 4 環(huán)境中 1 2 尖孢鐮刀菌專化型的分離純化與鑒定 從植株根際土壤中分別采取辣椒與草莓土樣 10 g 各采取 5組土樣 放入 250 mL三角瓶中 加入 90 mL的 無(wú)菌水 在 25 的條件下進(jìn)行離心 然后吸取 1 mL懸 浮液 采用濃度梯度法按照 10 3 10 4 10 5 和 10 6 濃度 進(jìn)行稀釋 并均勻涂布于含有硫酸鏈霉素的馬鈴薯葡萄 糖瓊脂培養(yǎng)基 PDA 平板上進(jìn)行培養(yǎng) 菌落生長(zhǎng)完整后 從中篩選出鐮刀菌并保存 1 2 1 真菌菌絲培養(yǎng)和 DNA 提取 將分離純化得到的菌株全都轉(zhuǎn)接到 PDA平板上 在 25 溫度不變的條件下培育 3 5 d后 在菌落邊緣打 取直徑為 5 mm的菌碟 10 15個(gè) 放入配制好的 PDB 培養(yǎng)基中 在 28 的條件下振蕩培養(yǎng) 再經(jīng)過(guò)多次過(guò)濾 離心等操作后可得到尖孢鐮刀菌菌絲 將得到的菌絲在 0 4 下冷藏 作為提取真菌 DNA的干組織 采用真 菌 DNA提取試劑盒對(duì)真菌 DNA進(jìn)行提取 1 2 2 PCR 與瓊脂糖凝膠電泳分析 對(duì)不同?；偷募怄哏牭毒N群的IGS序列 經(jīng) Primer 5設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物對(duì)P1 P2 P1為 5 CAGGGTAGGCAGCTTAGATTTGG 3 P2 為 5 GACGGATTTGGCGAACCTACCCT 3 引物由南京金斯 瑞生物科技有限公司合成 通過(guò)該引物對(duì) P1 P2對(duì)尖孢 鐮刀菌 IGS序列進(jìn)行 PCR擴(kuò)增 1 3 尖孢鐮刀菌專化型對(duì)各組殺菌劑的敏感性測(cè)定 用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定尖孢鐮刀菌對(duì)各種殺菌劑的 敏感性 將氟硅唑 吡唑醚菌酯和氰烯菌酯分別溶解在 甲醇中 藥劑濃度梯度為 0 1 mg mL 1 0 2 mg mL 1 0 4 mg mL 1 和 0 8 mg mL 1 將尖孢鐮刀菌在 28 條件 下恒溫培養(yǎng) 3 5 d 挑選生長(zhǎng)均勻的菌落 在菌落邊緣 打取直徑為 5 mm的菌碟 然后將菌碟接種到含有氟硅唑 吡唑醚菌酯和氰烯菌酯不同濃度梯度的 PDA平板上 測(cè) 試菌株對(duì)藥劑的敏感性 25 條件下恒溫連續(xù)培養(yǎng) 5 d后測(cè)量各菌株的菌落 直徑 以在不含藥劑的平板上生長(zhǎng)的菌株為對(duì)照 根據(jù) 收稿日期 2020 02 26 基金項(xiàng)目 江蘇省高等學(xué)校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目 18KJB210001 作者簡(jiǎn)介 王文 1997 男 江蘇宿遷人 本科 從事園藝學(xué)方向 的研究 為通信作者 E mail zztsdta 草莓 辣椒枯萎病菌的分離 鑒定及化學(xué)防治 王 文 李若南 單紅月 居 娜 孫蜻蜓 胡莊方 鄭志天 淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院 江蘇淮安 223003 摘 要 由尖孢鐮刀菌引起的辣椒枯萎病及草莓枯萎病是為害辣椒和草莓的主要病害之一 為明確淮安地區(qū)辣 椒 草莓枯萎病的病原菌種類及防治方法 采集辣椒 草莓根際土壤樣品 對(duì)其病原菌進(jìn)行了分離 純化和鑒 定 結(jié)果表明 該病原菌為尖孢鐮刀菌辣椒?；图凹怄哏牭毒葺畬；?采用菌絲生長(zhǎng)速率法對(duì)3種殺菌劑 進(jìn)行篩選 其中氟硅唑抑制作用較好 對(duì)尖孢鐮刀菌辣椒專化型的EC 50 為0 181 7 0 251 7 g mL 1 對(duì)尖孢鐮 刀菌草莓?；偷腅C 50 為0 076 0 0 212 8 g mL 1 且活體藥效實(shí)驗(yàn)表明該藥劑有效 關(guān)鍵詞 辣椒枯萎病 草莓枯萎病 尖孢鐮刀菌 氟硅唑 中圖分類號(hào) S436 418 S436 68 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 B DOI 10 19415 ki 1673 890 x 2020 09 068 王 文 李若南 單紅月 居 娜 孫蜻蜓 胡莊方 鄭志天 草莓 辣椒枯萎病菌的分離 鑒定及化學(xué)防治 136 公式 1計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率 每個(gè)處理重復(fù) 3次 試驗(yàn) 重復(fù) 3次 測(cè)量菌落直徑時(shí)選取生長(zhǎng)較為均勻的菌落 取平均值 根據(jù)藥劑濃度的對(duì)數(shù) X 與抑制率對(duì)應(yīng)的機(jī) 率值 Y 求出各菌株對(duì)于 3種藥劑的 EC 50 mm mm 100 mm 5 對(duì)照菌落 直徑 處 理 菌 落直徑 抑制率 對(duì)照菌落直徑 1 1 4 活體藥效實(shí)驗(yàn) 將尖孢鐮刀菌在 28 下恒溫連續(xù)培養(yǎng) 3 5 d 在 菌落邊緣打取直徑為 5 mm的菌碟 10 15個(gè) 放入配置 好的 PDB培養(yǎng)基中 在 28 條件下恒溫振蕩培養(yǎng) 5 d 經(jīng)過(guò)離心過(guò)濾等操作后可以得到尖刀鐮孢菌孢子 將得到的尖刀鐮孢菌孢子接種至草莓根部 接種 孢子 2 d后 處理組用各種殺菌劑分別灌根 藥劑稀釋 1 000倍 每株施用 100 mL 每 2 d灌藥 1次 對(duì)照組采 用清水灌根 20 d后觀察植株的生長(zhǎng)發(fā)病情況 1 5 數(shù)據(jù)處理 采用 EXCEL DPS等進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和做圖 2 結(jié)果與分析 2 1 草莓枯萎病菌及辣椒枯萎病菌形態(tài)學(xué)及分子生 物學(xué)鑒定 從草莓和辣椒根際土壤中分別分離到 3個(gè)菌株 編 號(hào)為草莓 0號(hào) 3號(hào)和 7號(hào) 辣椒 0號(hào) 3號(hào)和 7號(hào) 他們的菌落和形態(tài)學(xué)特征無(wú)明顯差異 如圖 1A所示 平 板培養(yǎng)結(jié)果表明 病原菌在 PDA培養(yǎng)基培養(yǎng) 5 d后 菌 落呈紅色 外部為白色 氣生菌絲為絨狀 如圖 1B常規(guī) PCR結(jié)果顯示 特異性引物 P1 P2可 穩(wěn)定地從 100 pg L 1 的尖孢鐮刀菌基因組 DNA模板中 擴(kuò)增得到一條 1 081 bp左右的條帶 而對(duì)土壤中病原菌 DNA的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中 能清晰得到特異性條帶 長(zhǎng)度約為 1 100左右 即可確認(rèn)實(shí)驗(yàn)中分離所到的菌即為尖孢鐮刀菌 2 2 不同殺菌劑對(duì)草莓和辣椒枯萎病的防治效果 尖孢鐮刀菌草莓?；秃屠苯穼；偷囊志饔脺y(cè) 定結(jié)果表明 殺菌劑氟硅唑?qū)Ψ蛛x出菌株的抑制效果明 顯 在設(shè)定濃度范圍內(nèi) 隨藥劑濃度的增加 抑菌效果 呈明顯增強(qiáng)的趨勢(shì) 由表 1可以看出 殺菌劑氟硅唑?qū)Ψ蛛x出的尖孢 鐮刀菌有很好的抑制作用 對(duì)尖孢鐮刀菌草莓?；偷?EC 50 為 0 076 0 0 212 8 mg L 1 對(duì)尖孢鐮刀菌辣椒專 化型的 EC 50 為 0 181 7 0 251 7 g mL 1 2 3 尖孢鐮刀菌活體藥效實(shí)驗(yàn) 將尖孢鐮刀菌草莓專化型和辣椒?；玩咦臃謩e接 種草莓和辣椒幼苗 20 d后觀察幼苗發(fā)病癥狀 結(jié)果顯示 發(fā)病初期葉片稍微卷縮 有些則呈波狀 會(huì)產(chǎn)生畸形葉莖 老葉呈現(xiàn)紫紅色萎蔫 后葉片逐漸變枯黃 最后全株枯死 A為尖孢鐮刀菌草莓轉(zhuǎn)化型和辣椒轉(zhuǎn)化型菌落形態(tài) B為尖孢鐮刀菌草莓?；秃屠苯穼；虸GS序列電泳圖 M 為DL2000 marker 圖1 草莓枯萎病菌及辣椒枯萎病菌形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定 表1 殺菌劑氟硅唑?qū)怄哏牭毒腅C 50 值和毒力回歸方程 菌株 殺菌劑 毒力回歸方程 EC 50 g mL 1 草莓0 氟硅唑 Y 0 629 3X 5 705 4 0 075 7 草莓3 氟硅唑 Y 0 832 9X 5 540 8 0 224 2 草莓7 氟硅唑 Y 0 736 7X 5 495 1 0 212 8 辣椒0 氟硅唑 Y 0 933 1X 5 559 1 0 251 7 辣椒3 氟硅唑 Y 0 702 1X 5 520 0 0 181 7 辣椒7 氟硅唑 Y 0 734 0X 5 716 9 0 105 5 EC 50 值為抑制菌絲生長(zhǎng)50 時(shí)的藥劑濃度 王 文 李若南 單紅月 居 娜 孫蜻蜓 胡莊方 鄭志天 草莓 辣椒枯萎病菌的分離 鑒定及化學(xué)防治 137 如圖 2A所示 左側(cè)為成活的無(wú)病害草莓苗 右側(cè) 為處理組實(shí)驗(yàn) 20 d后情況 對(duì)照組 CK無(wú)明顯發(fā)病癥狀 處理組孢子液蘸根并灌清水的草莓苗 20 d后枯萎死亡 處理組孢子液蘸根并經(jīng)常用氟硅唑水溶液灌根的草莓苗 無(wú)發(fā)病癥狀 正常生長(zhǎng) 表明氟硅唑?qū)怄哏牭毒葺?專化型具有一定的抑制活性 對(duì)于草莓枯萎病的防治有 一定的效果 如圖 2B所示 左側(cè)為成活的無(wú)病害辣椒苗 右側(cè) 為處理組實(shí)驗(yàn) 20 d后的生長(zhǎng)情況 對(duì)照組 CK無(wú)明顯發(fā) 病癥狀 處理組孢子液蘸根并灌清水的辣椒苗 20 d后 枯萎死亡 處理組用辣椒 3號(hào)和 7號(hào)孢子液蘸根并經(jīng)常 用氟硅唑水溶液灌根的辣椒苗有輕微的發(fā)病癥狀 用辣 椒 0號(hào)孢子液蘸根并經(jīng)常用氟硅唑水溶液灌根的辣椒苗 正常生長(zhǎng) 表明氟硅唑?qū)怄哏牭毒苯穼；途哂幸欢?的活體抑制效果 對(duì)于辣椒枯萎病的防治有一定的指導(dǎo) 意義 圖2 尖孢鐮刀菌活體藥效試驗(yàn) 3 結(jié)論 草莓和辣椒枯萎病是近年來(lái)生產(chǎn)上遇到的較難防治 的土傳病害 在我國(guó)一些主要種植區(qū)普遍發(fā)生 為害程 度也逐年加重 尤其是在多年連續(xù)種植的重茬地塊發(fā)病 率更高 病害暴發(fā)嚴(yán)重時(shí)會(huì)直接造成毀園 實(shí)驗(yàn)從淮安市農(nóng)科院溫室草莓種植區(qū)中找到疑似枯萎 病的植株 從根際土壤中分離出來(lái)菌株 確認(rèn)為草莓枯萎 病的病原菌尖孢鐮刀菌 并從中選出致病性強(qiáng)的尖孢鐮刀 菌 分別從形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證 通過(guò)菌 絲生長(zhǎng)速率法 發(fā)現(xiàn)氟硅唑?qū)τ谝鸩葺菸〉募怄?鐮刀菌防效良好 EC 50 在 0 076 0 0 212 8 g mL 1 同樣對(duì)辣椒病樣進(jìn)行取樣分離 純化 藥劑防治和活體 藥效試驗(yàn) 發(fā)現(xiàn)氟硅唑?qū)怄哏牭毒苯穼；偷姆佬?良好 EC 50 為 0 181 7 0 251 7 g mL 1 參考文獻(xiàn) 1 張運(yùn)濤 張國(guó)珍 草莓病蟲(chóng)害概論 2版 M 北京 中 國(guó)農(nóng)業(yè)出版社 2012 2 倪玉紅 趙秋榮 趙小軍 等 溫度 降雨量和日照時(shí) 數(shù)對(duì)草莓生長(zhǎng)發(fā)育及炭疽病發(fā)生的影響 J 江蘇農(nóng)業(yè) 科學(xué) 2014 42 2 133 134 3 趙荷娟 魏?jiǎn)⑺?王琳 等 雙孢蘑菇菌糠基質(zhì)對(duì)架 式栽培草莓生長(zhǎng)和果實(shí)品質(zhì)的影響 J 江蘇農(nóng)業(yè)科 學(xué) 2014 42 4 120 121 4 趙海濤 李良俊 殷朝珍 等 水生蔬菜輪作對(duì)大棚草 莓連作土壤性質(zhì)的影響 J 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 2014 30 2 289 295 5 吉沐祥 李國(guó)平 楊敬輝 等 江蘇省大棚草莓生產(chǎn)中 存在的問(wèn)題與技術(shù)創(chuàng)新 J 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 2012 24 2 58 60 6 顧春波 史曉斌 姜莉莉 等 草莓枯萎病菌對(duì)多菌 靈的抗性及其抗性菌株生物學(xué)特性 J 植物保護(hù)學(xué) 報(bào) 2010 37 3 266 271 7 于紅梅 趙密珍 王靜 等 草莓枯萎病菌的分離 鑒 定及生物學(xué)特性 J 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2013 41 11 124 127 8 楊煥青 王開(kāi)遠(yuǎn) 范昆 等 草莓枯萎病菌的生物 學(xué)特性及7種殺菌劑對(duì)其抑制作用 J 植物保護(hù)學(xué) 報(bào) 2008 35 2 169 174 9 曹海潮 李秀環(huán) 王曉坤 等 吡唑醚菌酯及三唑類 殺菌劑對(duì)番茄頸腐根腐病的防治效果 J 中國(guó)農(nóng)業(yè)科 學(xué) 2018 51 21 4065 4075 責(zé)任編輯 趙中正