熱帶作物學報 2019, 40(4): 715723 Chinese Journal of Tropical Crops     收稿日期  2018-06-12； 修回日期  2018-11-22 基金項目  福建省林業(yè)廳科技項目（閩林科 20163 號）。  作者簡介  周   婷（ 1990 ），女，碩士，研究方向：花卉生物技術。 *同等貢獻作者：楊惠婷（ 1994 ），女，碩士研究生，研究方向： 花卉生物技術。 *通信作者 （ Corresponding author） ： 佘文琴 （ SHE Wenqin） ， E-mail： wenqinshe163.com；陳桂信（ CHEN Guixin）， E-mail： guixinchen126.com。  單頭切花菊白扇組培快繁技術 周  婷1,2，楊惠婷1*，胡計紅1，朱夢珠1，洪榮欽3，潘東明1，佘文琴1*， 陳桂信1*1. 福建農林大學園藝學院，福建福州   350002； 2. 福建省林木種苗總站，福建福州   350002； 3. 尤溪縣三葉花卉園藝有限公司，福建尤溪   365100 摘  要  以日本單頭切花菊白扇的頂芽和帶腋芽莖段為外植體，對其組培快繁技術進行研究。結果表明：初代培養(yǎng)中，先用 75%酒精消毒 30 s，后 用 0.1%升汞溶液消毒，頂芽和帶腋芽莖段最佳消毒時間分別為 3 min 和 4 min，初代最適培養(yǎng)基為 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，平均芽誘導率為 100%，平均單芽數(shù)達 1.69 個。以無菌苗腋芽莖段進行擴增繁殖， 其最佳的增殖培養(yǎng)基為 MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L， 30 d 后增殖系數(shù)達 3.05， 有效芽率 65.26%，平均株高 3.22 cm；瓶內生根培養(yǎng)時，添加了 NAA 和 IBA 的 1/2MS 培養(yǎng)基均能誘導生根，生根率達 100%；也可瓶外生根，插穗浸蘸 NAA 溶液 5 min 后插入基質，生根效果良好。本研究結果可以為白扇的大面積推廣和產業(yè)化、標準化生產種苗提供理論與技術指導。  關鍵詞  單頭切花菊；白扇；組培快繁  中圖分類號  Q813.1     文獻標識碼  A Rapid Propagation of Standard Cut Chrysanthemum Baishan ZHOU Ting1,2, YANG Huiting1*, HU Jihong1, ZHU Mengzhu1, HONG Rongqin3, PAN Dongming1,  SHE Wenqin1*, CHEN Guixin1*1. College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China; 2. Forest Seedling General Station of Fujian Province, Fuzhou, Fujian 350002, China; 3. Youxi Sanye Flower Limited Company, Youxi, Fujian 365100, China Abstract  Using terminal buds and stems with axillary buds as the explants, the technology of tissue culture and rapid propagation of standard cut chrysanthemum Baishan was studied. The best sterilization conditions of apical bud ex-plants and axillary buds was 75% alcohol 30 s+0.1% HgCl2for 3 min and 4 min. The best primary culture medium of Baishan was MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L with the best inducing effect rate 100% and average single bud in-duction 1.69. The optimal proliferation medium was MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L with multiplication coeffi-cient 3.05, effective rate of bud 65.26% and average height 3.22 cm cultivated 30 d after. The 1/2MS medium supple-mented with NAA and IBA could induce rooting in bottles, and the rooting rate was 100%. It could root outside bottles. The buds was inserted into the substrate after 5 minutes of immersion in the NAA solution, and the rooting condition was good. The results could be applied directly for production popularization of Banshan. The results could provide theoretical and technical guidance for the large-scale promotion and industrialization of Baishan and standardized production of seedlings. Keywords  standard cut chrysanthemum; Chrysanthemum Baishan; tissue culture and rapid propagation DOI  10.3969/j.issn.1000-2561.2019.04.014 716 熱帶作物學報  第 40 卷  白扇（ Chrysanthemum Baishan）是優(yōu)良的白色單頭切花菊品種，主要出口至日本和韓國， 是上述國家舉行葬禮和祭祖拜神的必需品。在 69 月， 日本白菊市場基本被夏菊品種 白扇占據，因而研究該品種的繁殖和栽培技術，特別是組培快速繁殖技術對于開拓日本夏菊市場具有重要的經濟意義。  我國種植的白扇種苗均從日本購入，由于種苗市場壟斷，生產成本高，難以進行大規(guī)模推廣應用。白扇側芽易萌發(fā)開花，且多次扦插繁殖容易造成品種退化，種植者難以長期自主扦插繁殖。目前我國尚沒有關于單頭切花菊白扇組培與快速繁殖技術的研究，而通過本研究所建立的單頭切花菊新品種的組培快繁體系，對打破優(yōu)質單頭菊種苗的壟斷、加速引進的單頭切花菊優(yōu)良品種產業(yè)化提供優(yōu)質種苗和技術支持，具有重要的理論意義和實踐價值。  王蔚林1以 2 個傳統(tǒng)名貴菊花品種的葉片和花蕾為外植體進行研究，獲得了高效再生體系。王卉等2對 13 個品種的地被菊進行組織培養(yǎng)，并以不同的部位作為外植體進行試驗，發(fā)現(xiàn)以莖尖及腋芽作為外植體時， 均能直接誘導產生不定芽，而其他部位需要經過脫分化形成愈傷組織，再分化成新的植株。楊玉萍等3的研究表明，以根、葉片、葉柄為外植體分化不定芽，不定芽的誘導率最高。菊科植物的無菌系建立和增殖培養(yǎng)通常采用 MS 培養(yǎng)基或 MS 改良培養(yǎng)基4。 Renou 等5試驗結果顯示， 6-BA 和 NAA 為菊花再生的最適生長調節(jié)劑，目前菊花組培中這 2 種生長調節(jié)劑的使用也較多， KT、 2, 4-D、 TDZ 也有一些應用。唐煥偉等6將無根的食用菊試管苗用生長素處理后扦插至珍珠巖中，期間注意保持空氣濕度和土壤濕度， 30 d 后成活率達 95%。  近年來國內外研究者利用雜交育種、基因工程等技術開發(fā)和培育了許多性狀優(yōu)良的菊科花卉新品種7-8。優(yōu)良的新品種既需要數(shù)量上的快速增殖，也需要性狀上的穩(wěn)定保持，可以依靠植物組培快繁技術解決這一問題。目前菊科花卉的離體快繁研究日益成熟，但也有大量研究表明，由于每個品種的基因型不同，其離體再生體系沒有普遍性9。因此啟動了本研究，建立單頭切花菊白扇的組培快繁體系，內容主要包括外植體的選擇和消毒、植物激素的選擇與配比、培養(yǎng)條件的調節(jié)等方面。  1  材料與方法 1.1  材料   單頭切花菊白扇原種插穗由福建省尤溪縣三葉花卉有限公司從北京延慶縣永寧盛世鼎新菊苗場購買，插穗經扦插形成種苗植株，掐取長度 10 cm 的插穗為實驗材料。  1.2  方法 1.2.1  初代培養(yǎng)   將白扇插穗剪去葉片，切成 11.5 cm 的莖段，用 1%雕牌洗衣粉溶液浸泡后用流水沖洗 90 min，再用蒸餾水沖洗 2 次；將頂芽和帶腋芽莖段分別轉移至消毒過的三角瓶中，移到超凈工作臺，倒入 75%酒精浸泡并不斷攪動 30 s，用無菌水沖洗數(shù)次，再加入 0.1%升汞溶液進行消毒，設置 5 個不同時間（ 2、 3、 4、 5、6 min）的消毒處理，最后用無菌水沖洗 5 次。將頂芽和帶腋芽莖段接種于附加不同濃度 6-BA（ 0.5、 1.0、 1.5 mg/L） 和 NAA（ 0.1、 0.2、 0.3 mg/L）一一組合至含 30 g/L 蔗糖和 7 g/L 瓊脂的 MS 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基的 pH 為 5.86.0，培養(yǎng)條件：溫度 (252) ，光照強度 20003000 lx，光照時間12 h/d；每瓶接種 1 個外植體，每個處理接種 30瓶，重復 3 次，于接種后 20 d 統(tǒng)計污染率和成活率， 其中污染率 =污染的外植體數(shù) /接種總外植體數(shù) 100%，成活率 =成活的外植體數(shù) /接種總外植體數(shù) 100%。接種后 30 d 統(tǒng)計芽誘導率、單芽總數(shù)，并觀察外植體的生長狀況，其中芽誘導率 =誘導出芽的外植體數(shù)量 /接種總外植體數(shù) 100%，單芽總數(shù) =培養(yǎng) 30 d 后瓶內有效單芽總數(shù)。  1.2.2  增殖培養(yǎng)   由于大田插穗分化較完全，而無菌苗各個部分均十分幼嫩，故增殖培養(yǎng)不再區(qū)分頂芽和腋芽。取初代培養(yǎng)中生長狀態(tài)一致的無菌苗，切成 11.5 cm 左右的帶芽莖段，接種至不同激素濃度的增殖培養(yǎng)基中，其中 6-BA 的濃度為 1.0、 1.5、 2.0 mg/L， NAA 為 0.05、 0.10、0.15 mg/L。 培養(yǎng)基分為 MS、 1/2MS、 1/4MS 三種，一一組合成 L9(34)的正交試驗設計。培養(yǎng)條件同1.2.1；每個處理接種 30 瓶，每瓶接種 5 個帶芽莖段，重復 3 次，接種后 30 d 統(tǒng)計增殖系數(shù)和苗的生長情況，其中增殖系數(shù) =增殖培養(yǎng)后瓶內總芽數(shù) /接第 4 期  周   婷等 : 單頭切花菊白扇組培快繁技術  717 種時的總芽數(shù)， 有效芽率 =有效芽數(shù) （株高 1.0 cm）/增殖 30 d 后瓶內總芽數(shù) 100%，株高（ cm） =試管苗基部至頂芽的長度；用 Excel 2003 軟件和SPSS 17.0 軟件進行數(shù)據處理。 將初代培養(yǎng)中生長狀態(tài)一致的無菌試管苗切成 11.5 cm 左右的帶芽莖段，轉接至最佳增殖培養(yǎng)基（ MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.15 mg/L）中，培養(yǎng)條件同 1.2.1；光照時間設置 3 個處理： 8、 12、 16 h/d，每個處理接種 30 瓶，每瓶接種 5 個芽，重復 3 次；接種后 30 d 統(tǒng)計增殖系數(shù)、有效芽率和平均株高（計算方法同 1.2.1）。  1.2.3  瓶內生根培養(yǎng)   生根培養(yǎng)基配方采用兩因素 （ NAA/IBA） 四水平設計， 基本培養(yǎng)基為 1/2MS，僅添加 NAA（ 0.05、 0.1、 0.15、 0.2 mg/L） 4 個處理和僅添加 IBA（ 0.05、 0.1、 0.15、 0.2 mg/L） 4個處理以及空白對照；將繼代培養(yǎng)中生長狀態(tài)基本一致的無菌苗切成 2 cm 左右的切段， 接種至生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件均同 1.2.1；每個處理接種30 瓶，每瓶接 3 個芽，重復 3 次，接種后 20 d觀察并統(tǒng)計生根情況， 瓶內生根率 =生根苗總株數(shù)/接種總株數(shù) 100%，數(shù)據處理同 1.2.2。  1.2.4  瓶外扦插生根培養(yǎng)   分別探討生根劑配方和基質配比對無菌苗生根的影響。選取繼代培養(yǎng)基中生長健壯、株高整齊度較高（ 56 cm）的未生根無菌苗， 將培養(yǎng)瓶移到自然條件下松開瓶蓋，煉苗 1 d，再開蓋加入少量無菌水，再煉苗 7 d。從瓶中小心取出無菌苗，從其基部剪下，基部用NAA（ 50、 100 mg/L）和 ABT 生根粉（ 500 mg/L）分別浸蘸 5 min 后，插入無菌的移栽基質（蛭石、蛭石珍珠巖 =1 1、草炭土蛭石 =2 1、草炭土蛭石珍珠巖 =2 1 1）中，澆透水，移到溫室中。 每個處理 96 株。 晝夜溫度為 25 /20 ，空氣濕度為 90%，基質保持水分充足，每隔 3 d觀察一次，扦插后 7 d 統(tǒng)計扦插生根率，扦插生根率 =扦插生根總株數(shù) /扦插總株數(shù) 100%。  1.2.5  生根苗的煉苗與移栽   分別探討不同煉苗時間和移栽基質對生根苗的移栽效果的影響。對生根培養(yǎng)基培養(yǎng) 20 d 后的植株進行煉苗，對生根苗先松蓋 1 d 后開蓋 2、 4、 6、 8 d 再移栽的方式進行煉苗，小心清洗無菌苗根部附著的培養(yǎng)基，移栽到無菌基質（草炭土、草炭土蛭石 =2 1、草炭土珍珠巖 =2 1、草炭土蛭石珍珠巖 = 3 1 1）中，每個處理 96 株，移栽后 15 d 統(tǒng)計移栽成活率，移栽成活率 =移栽成活總株數(shù) /移栽總株數(shù) 100%。  1.3  數(shù)據處理   采用 SPSS 17.0 軟件對實驗數(shù)據進行方差分析。  2  結果與分析 2.1  初代培養(yǎng) 2.1.1  消毒時間對外植體消毒效果的影響   不同消毒時間對頂芽和腋芽外植體的消毒效果有明顯差異。頂芽以 0.1%升汞溶液消毒 3 min 消毒效果最好，消毒 3 min 和消毒 4 min 的污染率均為2.2%，其中消毒 3 min 后頂芽的成活率最高，達到 96.7%。用 0.1%升汞溶液消毒 6 min 后，污染率為 0，但由于消毒時間過長造成毒害，成活率僅為 30%。 用 0.1%升汞溶液消毒帶腋芽莖段 4 min為最佳消毒時間，此時成活率達 92.2%，污染率為 4.4%。消 毒 5 min 時的污染率為 1.1%，但成活率僅為 82.2%。消 毒 6 min 時的污染率為 0，但 成活率迅速下降至 55.5%。因此，以 0.1%升汞溶液為消毒劑，頂芽外植體的最佳消毒時間為 3 min，帶腋芽莖段的外植體最佳消毒時間為 4 min。 具體情況見表 1。  表1  不同消毒時間對頂芽和腋芽外植體的消毒效果 Tab. 1  Effects of sterilizing time on sterilizing of  terminal buds and lateral buds as explants 消毒部位Sterilization site 消毒時間Disinfection time/min 平均污染率  Average pollution rate/% 平均成活率  Average survival rate/% 2 25.6a74.4b3 2.2b96.7a4 2.2b86.7a5 1.1c57.8c頂芽  Terminal buds 6 0.0c30.0d2 37.8a61.1b3 14.4b85.6a4 4.4c92.2a5 1.1c82.2a腋芽  Axillary buds 6 0.0c55.5b注： 同列數(shù)據不同小寫字母表示處理間差異顯著 （ P NAA>6-BA。  用 SPSS 軟件對有效芽率進行分析， P>0.05，即在 a=0.05 水平上 9 組配方之間不存在顯著性差異，方差具有齊次性，因此接下來采用 LSD 法進行數(shù)據分析。 NAA 和基本培養(yǎng)基對白扇有效芽的誘導率具有顯著性差異（ P0.05）。  第 4 期  周   婷等 : 單頭切花菊白扇組培快繁技術  719 表3  培養(yǎng)基配方對無菌苗外植體增殖培養(yǎng)的影響 Tab. 3  Effects of different formula of media on multiplication of sterile plantlets 處理  Treatment 6-BA /(mgL1) NAA /(mgL1) 基本培養(yǎng)基  Basic  medium 生長狀況  Growth Status 平均有效芽率  Average effective germination rate/% 增殖系數(shù)均值  Mean value of  proliferation coefficient1 1.0 0.05 MS 無菌苗較健壯，莖干較細，葉片濃綠，生長速度較快，基部少量愈傷組織  57.48b2.81b2 1.0 0.10 1/2MS 無菌苗葉片較小，呈翠綠色，生長速度較快，基部少量愈傷組織  48.69c2.13e3 1.0 0.15 1/4MS 無菌苗生長十分緩慢，葉片窄小，部分底部葉片變黃，基部少量愈傷組織  36.30e1.79f4 1.5 0.05 1/2MS 無菌苗莖干細長，葉片翠綠，生長速度較慢，基部少量愈傷組織  41.88d2.60c5 1.5 0.10 1/4MS 無菌苗低矮細弱，生長十分緩慢，部分底部葉片變黃，基部少量愈傷組織  35.97e1.64g6 1.5 0.15 MS 無菌苗健壯，葉片濃綠，生長速度快，基部少量愈傷組織  65.26a3.05a7 2.0 0.05 1/4MS 無菌苗低矮，生長十分緩慢，部分底部葉片變黃，基部有愈傷組織  27.98f1.55g8 2.0 0.10 MS 無菌苗健壯，葉片濃綠，生長較快，基部少量愈傷組織  56.53b2.43d9 2.0 0.15 1/2MS 無菌苗較健壯，葉片呈翠綠色，生長速度一般，基部少量愈傷組織  56.63b2.11e注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著（ PNAA>6-BA。  綜合以上結果， MS+6-BA 1.0 mg/L+ NAA -0.15 mg/L、 MS+6-BA 1.5 mg/L+ NAA 0.15 mg/L 和MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.15 mg/L 均有利于切花菊白扇有效芽的誘導。因此，根據經濟性原則 MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L 最有利于獲得增殖系數(shù)最大的白扇增殖無菌苗。  2.2.3  光照時間對無菌苗增殖培養(yǎng)的影響  將初代培養(yǎng)得到的無菌苗切成 11.5 cm 左右的帶芽莖段，接種至最佳激素組合的增殖培養(yǎng)基中（ MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L），光照時間處理為 8、 12、 16 h/d，接 種 后 30 d 統(tǒng)計增殖系數(shù)、有效芽率及平均苗高。由表 4 可知，在 3個處理中，處理 2（光照 12 h/d）與處理 3（光照16 h/d）的無菌苗最為健壯，生長速度較快，其中處理 3 的增殖系數(shù)和有效芽率均達到最大值，其平均苗高達 3.44 cm，與處理 1（光照 8 h/d）之 間極差達到 2.02 cm， 有效芽率與處理 1 之間極差達23.01%。  進一步對數(shù)據進行方差分析和多重比較得出，各組數(shù)據方差均具有齊次性，不同光照時間對增殖系數(shù)、有效芽率及平均芽高均有顯著性影響。切花菊白扇增殖培養(yǎng)的最佳光照時間為16 h/d。  綜上所述，切花菊白扇的最佳增殖培養(yǎng)基為 MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L，增殖培養(yǎng)的最佳光照時間為 16 h/d。  720 熱帶作物學報  第 40 卷  表4  光照時間對無菌苗增殖的影響 Tab. 4  Effects of lighting time on multiplication of sterile plantlets 處理  Treatment 光照時間Illumination time/(hd1) 平均增殖系數(shù)  Average proliferation coefficient 平均有效芽率Average effective germination rate/%平均苗高  Average seedling height/cm 生長狀況  Growth status 1 8 2.38b47.08c1.42c無菌苗葉片翠綠，生長速度緩慢  2 12 3.05a65.26b3.22b無菌苗健壯，葉片濃綠，生長速度較快3 16 3.17a70.09a3.44a無菌苗健壯，葉片較大，生長速度快  極差   0.79 23.01 2.02  注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著（ P<0.05）。  Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference between treatments (P<0.05). 2.3  瓶內生根 將增殖培養(yǎng)產生的無根苗，切成 2 cm 左右的切段，接種至不同激素配比的生根培養(yǎng)基中，接種 20 d 后觀察并統(tǒng)計生根情況（圖 2）。由表 5可見，培養(yǎng)基中添加生長素，對促進無根苗生根具有良好效果，在生根率、生根根數(shù)、根長及根系粗細程度上，均起到促進作用，對照組 CK 的生根率為 96.67%，而添加了生長素的培養(yǎng)基中生根率均達 100%，且根系生長粗壯。對以上數(shù)據用SPSS 軟件進行分析， 結果表明： 不同濃度的 NAA之間，生根率、根數(shù)、根長均沒有顯著性差異；不同濃度的 IBA 之間，上述各個指標亦均不存在顯著性差異。添加 NAA 的培養(yǎng)基上，根系較添加 IBA 的處理組粗壯，但生根根數(shù)、根長均略低于 IBA 處理組。綜上所述， NAA 和 IBA 均適合進行白扇無根苗的生根。  2.4  瓶外生根培養(yǎng) 從表 6 可看出，無菌苗用 50、 100 mg/L 的NAA 溶液處理 5 min 后，扦插的成活率和生根率均達為 96.9%， 平均生根數(shù)分別為 18.7 和 19.0 根，用 ABT 生根粉 500 mg/L 浸蘸后，成活率和生根率均為 93.8%，平均生根數(shù)為 12 根，略低于其他兩組處理。因此，白扇無菌苗的最佳瓶外扦插生根劑為 NAA 50 mg/L 和 NAA 100 mg/L。  表5  激素配比對瓶內生根的影響 Tab. 5  Effects of combinations of plant regulators on rooting of root-free plantlets in vitro 處理  Treatment NAA/ (mgL1) IBA / (mgL1) 生根率  Rooting rate/%平均根數(shù)  Average number of roots 平均根長  Average root length/cm 根系粗細  Root thickness CK 0 0 96.67 5.3 1.3 細  1 0.05 0 100 15.2 2.2 粗  2 0.10 0 100 15.2 2.3 粗  3 0.15 0 100 15.0 2.3 粗  4 0.20 0 100 15.4 2.2 粗  5 0 0.05 100 15.9 2.9 較粗  6 0 0.10 100 16.2 2.7 較粗  7 0 0.15 100 16.1 2.6 較粗  8 0 0.20 100 16.0 2.7 較粗  A：對照組； B：處理 2； C 處理 6。  A: Rooting culture CK; B:Proliferation culture 2; C: Proliferation culture 6. 圖2  不同生根培養(yǎng)基第20天的生根情況 Fig. 2  Rooting situation of different rooting media after 20 days 第 4 期  周   婷等 : 單頭切花菊白扇組培快繁技術  721 移栽后 5 d， 觀察到 4 種不同配比的扦插基質中，無根苗均開始生根；移栽后 7 d 統(tǒng)計成活率及生根率。由表 7 可見，無根苗在 4 種扦插基質中的生根情況存在一定差異。其中，扦插到蛭石、蛭石珍珠巖 =1 1 的無根苗成活率和生根率最高，均為 96.9%，但蛭石珍珠巖 =1 1 這個組合的平均生根根數(shù)較多，達 14 根。因此， 白扇無菌苗的最佳扦插基質為蛭石珍珠巖 =1 1。  綜上所述，瓶外扦插生根的最佳處理為將5 cm 左右的無根苗基部用生根劑 NAA 50 mg/L 或NAA 100 mg/L 處理浸蘸 5 min 后，扦插至蛭石珍珠巖 =1 1 的組合基質中進行培養(yǎng)。  2.5  煉苗移栽  2.5.1  煉苗時間對生根苗移栽效果的影響   將生根培養(yǎng) 20 d 左右的無菌苗移到自然條件下，分別  表6  生根劑對無菌苗瓶外生根的影響 Tab. 6  Effect of root ingredient on the roots  outside sterile bottle 處理  Treatment 生根率  Rooting rate/% 平均生根數(shù)  Average number of rootsNAA 50 mg/L 96.9 18.7aNAA 100 mg/L 96.9 19.0aABT 生根粉 500 mg/L 93.8 12.0b注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著（ P<0.05）。  Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference between treatments (P<0.05). 表7  基質配比對無菌苗瓶外生根的影響 Tab. 7  Effect of matrix ratio on rooting  outside sterile bottle 處理  Treatment 成活率  Survival rate/% 平均生根數(shù)  Average number of roots蛭石  96.9 12.7 蛭石珍珠巖 =1 1 96.9 14.0 草炭土蛭石 =2 1 87.5 11.3 草炭土蛭石珍珠巖 =2 1 1 93.8 12.0 進行不同時間的煉苗后，移栽至草炭土蛭石珍珠巖 =3 1 1 的基質組合中， 移栽后 25 d 統(tǒng)計成活率。從表 8 中可知，松蓋 1 d 后開蓋 6 d 的煉苗效果最好，移栽成活率達 100%，松蓋 1 d 后開蓋 2 d 的成活率最低，為 88.54%，這可能是由于煉苗時間過短，無菌苗沒有充足的時間適應復雜的外界環(huán)境，導致移栽后部分小苗出現(xiàn)萎蔫，最終枯死。松蓋 1 d 后開蓋 8 d 的成活率為 91.67%，在煉苗過程中部分培養(yǎng)基發(fā)生污染，植株根系較綿軟，移栽時易發(fā)生斷根。因此，生根苗的最佳煉苗方式為：松開瓶蓋煉苗 1 d，再開蓋煉苗 6 d。  表8  煉苗時間對生根苗移栽效果的影響 Tab. 8  Effect of time of domestication on transplanting of rooted plantlets 煉苗天數(shù)Days of refining/d移栽株數(shù)  Number of  transplanted plants 成活株數(shù)  Number of living plants 成活率  Survival rate/% 2 96 85 88.54 4 96 93 96.90 6 96 96 100.00 8 96 88 91.67 2.5.2  基質配比對生根苗移栽效果的影響   將生根培養(yǎng) 20 d 左右的無菌苗移到自然條件下進行松蓋煉苗 1 d，再開蓋煉苗 6 d 后，移栽至 4 種基質配比的基質中，移栽后 20 d 統(tǒng)計成活率和觀察小苗的生長狀態(tài)（圖 3）。由表 9 可見，生根苗在草炭土蛭石 =2 1、草炭土珍珠巖 =2 1 和草炭土蛭石珍珠巖 =3 1 1 這 3 種移栽基質中的成活率均為 100%， 其中草炭土蛭石珍珠巖= 3 1 1 這個組合小苗的生長情況最佳， 恢復迅速，且頂端有新葉長出，葉片大，葉色翠綠。 4種移栽基質中，草炭土的移栽效果最差，成活率為 93.75%，在移栽過程中出現(xiàn)無菌苗易倒伏的情況。因此，生根苗的最佳移栽基質為草炭土蛭  表9  不同基質配比對生根苗移栽效果的影響 Tab. 9  Effect of combinations of media on transplanting of rooted plantlets 移栽基質  Transplanting matrix 移栽株數(shù)  Number of transplanted plants成活株數(shù)  Number of living plants成活率  Survival rate/% 生長情況  Growing situation 草炭土  96 90 93.75 小苗恢復較慢，長勢較差草炭土蛭石 =2 1 96 96 100.00 小苗恢復良好，長勢較好草炭土珍珠巖 =2 1 96 96 100.00 小苗恢復良好，長勢較好草炭土蛭石珍珠巖 =3 1 1 96 96 100.00 小苗恢復迅速，長勢良好722 熱帶作物學報  第 40 卷  A：開蓋煉苗； B： 4 種移栽基質； C：移栽后 20 d。  A: Seedling hardening; B: Four types of substrates; C: 20 days after transplanted. 圖3  煉苗及移栽 Fig. 3  Plantlet acclimatization and transplant 石珍珠巖 =3 1 1。  綜合以上分析，生根苗的最佳移栽方式為：先松開瓶蓋煉苗 1 d，再開蓋煉苗 6 d，清洗掉根系上附著的瓊脂，最后移栽到草炭土蛭石珍珠巖 =3 1 1 的基質中。  3  討論 組培快繁具有繁殖速度快、培養(yǎng)周期短、保持母本優(yōu)良性狀且不受地域、季節(jié)限制的優(yōu)點，被廣泛應用到花卉種苗的工廠化生產中，對于一些繁殖系數(shù)低或新引進培育的花卉品種進行組培快繁，可以短期內獲得大量基因型一致的優(yōu)質苗木10-11。  菊科植物常用的再生體系有 2 種，分別為誘導外植體直接分化不定芽成為新植株和誘導愈傷組織再分化這 2 種途徑。大多數(shù)的研究者認為，由莖段或葉片作為外植體直接誘導不定芽，能較好的保持原有的遺傳性狀，避免變異和嵌合體的發(fā)生。 Shinoyama 等12研究表明通過愈傷組織途徑建立再生體系需要 143180 d， 而不定芽直接誘導再生體系僅需 80120 d，且愈傷誘導體系比不定芽誘導體系的再生率低。本研究采用直接分化不定芽的方法，以白扇的頂芽和腋芽為外植體建立無菌株系，得出如下結果：頂芽外植體的最佳消毒條件為 75%酒精 30 s+0.1%升汞溶液消毒 3 min；帶腋芽莖段的最佳消毒條件為 75%酒精 30 s+0.1%升汞溶液消毒 4 min； 在初代培養(yǎng)中，以頂芽誘導無菌苗或不定芽的效果比帶腋芽莖段更好，因此，頂芽為初代培養(yǎng)的最佳外植體； 白扇的最佳初代培養(yǎng)基為 MS+6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.1 mg/L。  在植物組織培養(yǎng)中將不同的植物生長調節(jié)劑進行組合搭配使用，會比單獨使用效果更佳。程蕾潔13研究發(fā)現(xiàn)，在對外植體的誘導過程中，用不同濃度的 6-BA 和 NAA 進行組合比單一的采用6-BA 對芽的萌發(fā)率影響更大。本研究結果表明，白扇無菌苗的增殖培養(yǎng)的最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L。并且隨著光照時間的延長，無菌苗的株高也隨之增加，當光照時間為 16 h/d 時，平均株高均高于 8 h/d 和12 h/d，且無菌苗生長健壯、葉面積增大，這一結果與 Adams 等14和 Kurilik 等15的研究結果一致。  菊科植物為較易生根的草本植物，生根周期較短，在組培快繁中一般將無根試管苗接種至添加了 NAA、 IBA 或 IAA 生長素的培養(yǎng)基中，誘導試管苗不定根產生，再進行馴化移栽。陳燕梅16、王麗華17等研究表明， 1/2MS 培養(yǎng)基較 MS 培養(yǎng)基、 1/4MS 培養(yǎng)基更利于菊科花井的生根培養(yǎng)。本研究得出，只要添加了生長素的 1/2MS 培養(yǎng)基均能誘導白扇無根苗生根，生根率達 100%。無菌苗的馴化煉苗對其出瓶成活率起到關鍵作用，煉苗可以使無菌苗植株從恒溫、恒濕、無菌高養(yǎng)分的環(huán)境逐漸過渡到復雜的自然環(huán)境中。經煉苗移栽， 即將 白扇 生根的無菌苗經松蓋 1 d，開蓋 6 d 進行煉苗， 移栽到基質為草炭土蛭石珍珠巖 =3 1 1 的穴盤中， 移栽 15 d 后成活率達100%； 草炭土蛭石珍珠巖 =3 1 1 為最佳移栽基質，移栽 20 d 后成活率達 100%，小苗恢復迅速，長勢良好。  本研究不僅開展了有根試管苗的露地移栽，還嘗試了無根苗的瓶外生根試驗。結果表明，瓶外扦插生根的最佳處理為將 5 cm 左右的無根苗基部用生根劑 NAA 50 mg/L 或 NAA 100 mg/L 處理浸蘸 5 min 后， 扦插至蛭石珍珠巖 =1 1 的組合基質中進行培養(yǎng)。無根苗直接生根可以進一步減少移苗步驟和移栽成本，可以快速的生產白第 4 期  周   婷等 : 單頭切花菊白扇組培快繁技術  723 扇種苗，并且在實際應用中可以將瓶苗直接交給切花菊生產企業(yè)， 由生產者自主安排扦插時間，減少運輸成本和能源消耗，做到種植季節(jié)種苗的持續(xù)供應。  本研究的不足之處在于誘導的試管苗沒有經過變異檢測，因此下一步的研究需要進行田間觀察和分子鑒定，以確保繁育過程中種苗的一致性與高質量。  參考文獻 1 王蔚林 . 菊花再生體系的建立及用 PPMADS5 基因進行遺傳轉化的研究 D. 北京 : 首都師范大學 , 2007. 2 王   卉 , 劉少翔 , 趙處文 , 等 . 地被菊組培快繁及栽培技術研究 J. 山西農業(yè)科學 , 1995, 35(1): 49-51. 3 楊文雅 . 切花多頭菊莖尖離體培養(yǎng)與快繁技術研究 D. 銀川 : 寧夏大學 , 2014. 4 楊玉萍 , 李宜蕓 , 李茜雯 , 等 . 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