單頭切花菊"白扇"組培快繁技術(shù).pdf
<p>熱帶作物學(xué)報(bào) 2019, 40(4): 715723 Chinese Journal of Tropical Crops 收稿日期 2018-06-12； 修回日期 2018-11-22 基金項(xiàng)目 福建省林業(yè)廳科技項(xiàng)目（閩林科 20163 號(hào)）。 作者簡(jiǎn)介 周 婷（ 1990 ），女，碩士，研究方向：花卉生物技術(shù)。 *同等貢獻(xiàn)作者：楊惠婷（ 1994 ），女，碩士研究生，研究方向： 花卉生物技術(shù)。 *通信作者 （ Corresponding author） ： 佘文琴 （ SHE Wenqin） ， E-mail： wenqinshe163.com；陳桂信（ CHEN Guixin）， E-mail： guixinchen126.com。 單頭切花菊白扇組培快繁技術(shù) 周 婷1,2，楊惠婷1*，胡計(jì)紅1，朱夢(mèng)珠1，洪榮欽3，潘東明1，佘文琴1*， 陳桂信1*1. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建福州 350002； 2. 福建省林木種苗總站，福建福州 350002； 3. 尤溪縣三葉花卉園藝有限公司，福建尤溪 365100 摘 要 以日本單頭切花菊白扇的頂芽和帶腋芽莖段為外植體，對(duì)其組培快繁技術(shù)進(jìn)行研究。結(jié)果表明：初代培養(yǎng)中，先用 75%酒精消毒 30 s，后 用 0.1%升汞溶液消毒，頂芽和帶腋芽莖段最佳消毒時(shí)間分別為 3 min 和 4 min，初代最適培養(yǎng)基為 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，平均芽誘導(dǎo)率為 100%，平均單芽數(shù)達(dá) 1.69 個(gè)。以無(wú)菌苗腋芽莖段進(jìn)行擴(kuò)增繁殖， 其最佳的增殖培養(yǎng)基為 MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L， 30 d 后增殖系數(shù)達(dá) 3.05， 有效芽率 65.26%，平均株高 3.22 cm；瓶?jī)?nèi)生根培養(yǎng)時(shí)，添加了 NAA 和 IBA 的 1/2MS 培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)生根，生根率達(dá) 100%；也可瓶外生根，插穗浸蘸 NAA 溶液 5 min 后插入基質(zhì)，生根效果良好。本研究結(jié)果可以為白扇的大面積推廣和產(chǎn)業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)種苗提供理論與技術(shù)指導(dǎo)。 關(guān)鍵詞 單頭切花菊；白扇；組培快繁 中圖分類號(hào) Q813.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Rapid Propagation of Standard Cut Chrysanthemum Baishan ZHOU Ting1,2, YANG Huiting1*, HU Jihong1, ZHU Mengzhu1, HONG Rongqin3, PAN Dongming1, SHE Wenqin1*, CHEN Guixin1*1. College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China; 2. Forest Seedling General Station of Fujian Province, Fuzhou, Fujian 350002, China; 3. Youxi Sanye Flower Limited Company, Youxi, Fujian 365100, China Abstract Using terminal buds and stems with axillary buds as the explants, the technology of tissue culture and rapid propagation of standard cut chrysanthemum Baishan was studied. The best sterilization conditions of apical bud ex-plants and axillary buds was 75% alcohol 30 s+0.1% HgCl2for 3 min and 4 min. The best primary culture medium of Baishan was MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L with the best inducing effect rate 100% and average single bud in-duction 1.69. The optimal proliferation medium was MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L with multiplication coeffi-cient 3.05, effective rate of bud 65.26% and average height 3.22 cm cultivated 30 d after. The 1/2MS medium supple-mented with NAA and IBA could induce rooting in bottles, and the rooting rate was 100%. It could root outside bottles. The buds was inserted into the substrate after 5 minutes of immersion in the NAA solution, and the rooting condition was good. The results could be applied directly for production popularization of Banshan. The results could provide theoretical and technical guidance for the large-scale promotion and industrialization of Baishan and standardized production of seedlings. Keywords standard cut chrysanthemum; Chrysanthemum Baishan; tissue culture and rapid propagation DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.04.014 716 熱帶作物學(xué)報(bào) 第 40 卷 白扇（ Chrysanthemum Baishan）是優(yōu)良的白色單頭切花菊品種，主要出口至日本和韓國(guó)， 是上述國(guó)家舉行葬禮和祭祖拜神的必需品。在 69 月， 日本白菊市場(chǎng)基本被夏菊品種 白扇占據(jù)，因而研究該品種的繁殖和栽培技術(shù)，特別是組培快速繁殖技術(shù)對(duì)于開(kāi)拓日本夏菊市場(chǎng)具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。 我國(guó)種植的白扇種苗均從日本購(gòu)入，由于種苗市場(chǎng)壟斷，生產(chǎn)成本高，難以進(jìn)行大規(guī)模推廣應(yīng)用。白扇側(cè)芽易萌發(fā)開(kāi)花，且多次扦插繁殖容易造成品種退化，種植者難以長(zhǎng)期自主扦插繁殖。目前我國(guó)尚沒(méi)有關(guān)于單頭切花菊白扇組培與快速繁殖技術(shù)的研究，而通過(guò)本研究所建立的單頭切花菊新品種的組培快繁體系，對(duì)打破優(yōu)質(zhì)單頭菊種苗的壟斷、加速引進(jìn)的單頭切花菊優(yōu)良品種產(chǎn)業(yè)化提供優(yōu)質(zhì)種苗和技術(shù)支持，具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。 王蔚林1以 2 個(gè)傳統(tǒng)名貴菊花品種的葉片和花蕾為外植體進(jìn)行研究，獲得了高效再生體系。王卉等2對(duì) 13 個(gè)品種的地被菊進(jìn)行組織培養(yǎng)，并以不同的部位作為外植體進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)以莖尖及腋芽作為外植體時(shí)， 均能直接誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，而其他部位需要經(jīng)過(guò)脫分化形成愈傷組織，再分化成新的植株。楊玉萍等3的研究表明，以根、葉片、葉柄為外植體分化不定芽，不定芽的誘導(dǎo)率最高。菊科植物的無(wú)菌系建立和增殖培養(yǎng)通常采用 MS 培養(yǎng)基或 MS 改良培養(yǎng)基4。 Renou 等5試驗(yàn)結(jié)果顯示， 6-BA 和 NAA 為菊花再生的最適生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，目前菊花組培中這 2 種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的使用也較多， KT、 2, 4-D、 TDZ 也有一些應(yīng)用。唐煥偉等6將無(wú)根的食用菊試管苗用生長(zhǎng)素處理后扦插至珍珠巖中，期間注意保持空氣濕度和土壤濕度， 30 d 后成活率達(dá) 95%。 近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究者利用雜交育種、基因工程等技術(shù)開(kāi)發(fā)和培育了許多性狀優(yōu)良的菊科花卉新品種7-8。優(yōu)良的新品種既需要數(shù)量上的快速增殖，也需要性狀上的穩(wěn)定保持，可以依靠植物組培快繁技術(shù)解決這一問(wèn)題。目前菊科花卉的離體快繁研究日益成熟，但也有大量研究表明，由于每個(gè)品種的基因型不同，其離體再生體系沒(méi)有普遍性9。因此啟動(dòng)了本研究，建立單頭切花菊白扇的組培快繁體系，內(nèi)容主要包括外植體的選擇和消毒、植物激素的選擇與配比、培養(yǎng)條件的調(diào)節(jié)等方面。 1 材料與方法 1.1 材料 單頭切花菊白扇原種插穗由福建省尤溪縣三葉花卉有限公司從北京延慶縣永寧盛世鼎新菊苗場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)，插穗經(jīng)扦插形成種苗植株，掐取長(zhǎng)度 10 cm 的插穗為實(shí)驗(yàn)材料。 1.2 方法 1.2.1 初代培養(yǎng) 將白扇插穗剪去葉片，切成 11.5 cm 的莖段，用 1%雕牌洗衣粉溶液浸泡后用流水沖洗 90 min，再用蒸餾水沖洗 2 次；將頂芽和帶腋芽莖段分別轉(zhuǎn)移至消毒過(guò)的三角瓶中，移到超凈工作臺(tái)，倒入 75%酒精浸泡并不斷攪動(dòng) 30 s，用無(wú)菌水沖洗數(shù)次，再加入 0.1%升汞溶液進(jìn)行消毒，設(shè)置 5 個(gè)不同時(shí)間（ 2、 3、 4、 5、6 min）的消毒處理，最后用無(wú)菌水沖洗 5 次。將頂芽和帶腋芽莖段接種于附加不同濃度 6-BA（ 0.5、 1.0、 1.5 mg/L） 和 NAA（ 0.1、 0.2、 0.3 mg/L）一一組合至含 30 g/L 蔗糖和 7 g/L 瓊脂的 MS 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基的 pH 為 5.86.0，培養(yǎng)條件：溫度 (25±2) ，光照強(qiáng)度 20003000 lx，光照時(shí)間12 h/d；每瓶接種 1 個(gè)外植體，每個(gè)處理接種 30瓶，重復(fù) 3 次，于接種后 20 d 統(tǒng)計(jì)污染率和成活率， 其中污染率 =污染的外植體數(shù) /接種總外植體數(shù) 100%，成活率 =成活的外植體數(shù) /接種總外植體數(shù) 100%。接種后 30 d 統(tǒng)計(jì)芽誘導(dǎo)率、單芽總數(shù)，并觀察外植體的生長(zhǎng)狀況，其中芽誘導(dǎo)率 =誘導(dǎo)出芽的外植體數(shù)量 /接種總外植體數(shù) 100%，單芽總數(shù) =培養(yǎng) 30 d 后瓶?jī)?nèi)有效單芽總數(shù)。 1.2.2 增殖培養(yǎng) 由于大田插穗分化較完全，而無(wú)菌苗各個(gè)部分均十分幼嫩，故增殖培養(yǎng)不再區(qū)分頂芽和腋芽。取初代培養(yǎng)中生長(zhǎng)狀態(tài)一致的無(wú)菌苗，切成 11.5 cm 左右的帶芽莖段，接種至不同激素濃度的增殖培養(yǎng)基中，其中 6-BA 的濃度為 1.0、 1.5、 2.0 mg/L， NAA 為 0.05、 0.10、0.15 mg/L。 培養(yǎng)基分為 MS、 1/2MS、 1/4MS 三種，一一組合成 L9(34)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。培養(yǎng)條件同1.2.1；每個(gè)處理接種 30 瓶，每瓶接種 5 個(gè)帶芽莖段，重復(fù) 3 次，接種后 30 d 統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)和苗的生長(zhǎng)情況，其中增殖系數(shù) =增殖培養(yǎng)后瓶?jī)?nèi)總芽數(shù) /接第 4 期 周 婷等 : 單頭切花菊白扇組培快繁技術(shù) 717 種時(shí)的總芽數(shù)， 有效芽率 =有效芽數(shù) （株高 1.0 cm）/增殖 30 d 后瓶?jī)?nèi)總芽數(shù) 100%，株高（ cm） =試管苗基部至頂芽的長(zhǎng)度；用 Excel 2003 軟件和SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。 將初代培養(yǎng)中生長(zhǎng)狀態(tài)一致的無(wú)菌試管苗切成 11.5 cm 左右的帶芽莖段，轉(zhuǎn)接至最佳增殖培養(yǎng)基（ MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.15 mg/L）中，培養(yǎng)條件同 1.2.1；光照時(shí)間設(shè)置 3 個(gè)處理： 8、 12、 16 h/d，每個(gè)處理接種 30 瓶，每瓶接種 5 個(gè)芽，重復(fù) 3 次；接種后 30 d 統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)、有效芽率和平均株高（計(jì)算方法同 1.2.1）。 1.2.3 瓶?jī)?nèi)生根培養(yǎng) 生根培養(yǎng)基配方采用兩因素 （ NAA/IBA） 四水平設(shè)計(jì)， 基本培養(yǎng)基為 1/2MS，僅添加 NAA（ 0.05、 0.1、 0.15、 0.2 mg/L） 4 個(gè)處理和僅添加 IBA（ 0.05、 0.1、 0.15、 0.2 mg/L） 4個(gè)處理以及空白對(duì)照；將繼代培養(yǎng)中生長(zhǎng)狀態(tài)基本一致的無(wú)菌苗切成 2 cm 左右的切段， 接種至生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件均同 1.2.1；每個(gè)處理接種30 瓶，每瓶接 3 個(gè)芽，重復(fù) 3 次，接種后 20 d觀察并統(tǒng)計(jì)生根情況， 瓶?jī)?nèi)生根率 =生根苗總株數(shù)/接種總株數(shù) 100%，數(shù)據(jù)處理同 1.2.2。 1.2.4 瓶外扦插生根培養(yǎng) 分別探討生根劑配方和基質(zhì)配比對(duì)無(wú)菌苗生根的影響。選取繼代培養(yǎng)基中生長(zhǎng)健壯、株高整齊度較高（ 56 cm）的未生根無(wú)菌苗， 將培養(yǎng)瓶移到自然條件下松開(kāi)瓶蓋，煉苗 1 d，再開(kāi)蓋加入少量無(wú)菌水，再煉苗 7 d。從瓶中小心取出無(wú)菌苗，從其基部剪下，基部用NAA（ 50、 100 mg/L）和 ABT 生根粉（ 500 mg/L）分別浸蘸 5 min 后，插入無(wú)菌的移栽基質(zhì)（蛭石、蛭石珍珠巖 =1 1、草炭土蛭石 =2 1、草炭土蛭石珍珠巖 =2 1 1）中，澆透水，移到溫室中。 每個(gè)處理 96 株。 晝夜溫度為 25 /20 ，空氣濕度為 90%，基質(zhì)保持水分充足，每隔 3 d觀察一次，扦插后 7 d 統(tǒng)計(jì)扦插生根率，扦插生根率 =扦插生根總株數(shù) /扦插總株數(shù) 100%。 1.2.5 生根苗的煉苗與移栽 分別探討不同煉苗時(shí)間和移栽基質(zhì)對(duì)生根苗的移栽效果的影響。對(duì)生根培養(yǎng)基培養(yǎng) 20 d 后的植株進(jìn)行煉苗，對(duì)生根苗先松蓋 1 d 后開(kāi)蓋 2、 4、 6、 8 d 再移栽的方式進(jìn)行煉苗，小心清洗無(wú)菌苗根部附著的培養(yǎng)基，移栽到無(wú)菌基質(zhì)（草炭土、草炭土蛭石 =2 1、草炭土珍珠巖 =2 1、草炭土蛭石珍珠巖 = 3 1 1）中，每個(gè)處理 96 株，移栽后 15 d 統(tǒng)計(jì)移栽成活率，移栽成活率 =移栽成活總株數(shù) /移栽總株數(shù) 100%。 1.3 數(shù)據(jù)處理 采用 SPSS 17.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。 2 結(jié)果與分析 2.1 初代培養(yǎng) 2.1.1 消毒時(shí)間對(duì)外植體消毒效果的影響 不同消毒時(shí)間對(duì)頂芽和腋芽外植體的消毒效果有明顯差異。頂芽以 0.1%升汞溶液消毒 3 min 消毒效果最好，消毒 3 min 和消毒 4 min 的污染率均為2.2%，其中消毒 3 min 后頂芽的成活率最高，達(dá)到 96.7%。用 0.1%升汞溶液消毒 6 min 后，污染率為 0，但由于消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)造成毒害，成活率僅為 30%。 用 0.1%升汞溶液消毒帶腋芽莖段 4 min為最佳消毒時(shí)間，此時(shí)成活率達(dá) 92.2%，污染率為 4.4%。消 毒 5 min 時(shí)的污染率為 1.1%，但成活率僅為 82.2%。消 毒 6 min 時(shí)的污染率為 0，但 成活率迅速下降至 55.5%。因此，以 0.1%升汞溶液為消毒劑，頂芽外植體的最佳消毒時(shí)間為 3 min，帶腋芽莖段的外植體最佳消毒時(shí)間為 4 min。 具體情況見(jiàn)表 1。 表1 不同消毒時(shí)間對(duì)頂芽和腋芽外植體的消毒效果 Tab. 1 Effects of sterilizing time on sterilizing of terminal buds and lateral buds as explants 消毒部位Sterilization site 消毒時(shí)間Disinfection time/min 平均污染率 Average pollution rate/% 平均成活率 Average survival rate/% 2 25.6a74.4b3 2.2b96.7a4 2.2b86.7a5 1.1c57.8c頂芽 Terminal buds 6 0.0c30.0d2 37.8a61.1b3 14.4b85.6a4 4.4c92.2a5 1.1c82.2a腋芽 Axillary buds 6 0.0c55.5b注： 同列數(shù)據(jù)不同小寫(xiě)字母表示處理間差異顯著 （ P NAA>6-BA。 用 SPSS 軟件對(duì)有效芽率進(jìn)行分析， P>0.05，即在 a=0.05 水平上 9 組配方之間不存在顯著性差異，方差具有齊次性，因此接下來(lái)采用 LSD 法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 NAA 和基本培養(yǎng)基對(duì)白扇有效芽的誘導(dǎo)率具有顯著性差異（ P0.05）。 第 4 期 周 婷等 : 單頭切花菊白扇組培快繁技術(shù) 719 表3 培養(yǎng)基配方對(duì)無(wú)菌苗外植體增殖培養(yǎng)的影響 Tab. 3 Effects of different formula of media on multiplication of sterile plantlets 處理 Treatment 6-BA /(mg·L1) NAA /(mg·L1) 基本培養(yǎng)基 Basic medium 生長(zhǎng)狀況 Growth Status 平均有效芽率 Average effective germination rate/% 增殖系數(shù)均值 Mean value of proliferation coefficient1 1.0 0.05 MS 無(wú)菌苗較健壯，莖干較細(xì)，葉片濃綠，生長(zhǎng)速度較快，基部少量愈傷組織 57.48b2.81b2 1.0 0.10 1/2MS 無(wú)菌苗葉片較小，呈翠綠色，生長(zhǎng)速度較快，基部少量愈傷組織 48.69c2.13e3 1.0 0.15 1/4MS 無(wú)菌苗生長(zhǎng)十分緩慢，葉片窄小，部分底部葉片變黃，基部少量愈傷組織 36.30e1.79f4 1.5 0.05 1/2MS 無(wú)菌苗莖干細(xì)長(zhǎng)，葉片翠綠，生長(zhǎng)速度較慢，基部少量愈傷組織 41.88d2.60c5 1.5 0.10 1/4MS 無(wú)菌苗低矮細(xì)弱，生長(zhǎng)十分緩慢，部分底部葉片變黃，基部少量愈傷組織 35.97e1.64g6 1.5 0.15 MS 無(wú)菌苗健壯，葉片濃綠，生長(zhǎng)速度快，基部少量愈傷組織 65.26a3.05a7 2.0 0.05 1/4MS 無(wú)菌苗低矮，生長(zhǎng)十分緩慢，部分底部葉片變黃，基部有愈傷組織 27.98f1.55g8 2.0 0.10 MS 無(wú)菌苗健壯，葉片濃綠，生長(zhǎng)較快，基部少量愈傷組織 56.53b2.43d9 2.0 0.15 1/2MS 無(wú)菌苗較健壯，葉片呈翠綠色，生長(zhǎng)速度一般，基部少量愈傷組織 56.63b2.11e注：同列不同小寫(xiě)字母表示處理間差異顯著（ PNAA>6-BA。 綜合以上結(jié)果， MS+6-BA 1.0 mg/L+ NAA -0.15 mg/L、 MS+6-BA 1.5 mg/L+ NAA 0.15 mg/L 和MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.15 mg/L 均有利于切花菊白扇有效芽的誘導(dǎo)。因此，根據(jù)經(jīng)濟(jì)性原則 MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L 最有利于獲得增殖系數(shù)最大的白扇增殖無(wú)菌苗。 2.2.3 光照時(shí)間對(duì)無(wú)菌苗增殖培養(yǎng)的影響 將初代培養(yǎng)得到的無(wú)菌苗切成 11.5 cm 左右的帶芽莖段，接種至最佳激素組合的增殖培養(yǎng)基中（ MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L），光照時(shí)間處理為 8、 12、 16 h/d，接 種 后 30 d 統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)、有效芽率及平均苗高。由表 4 可知，在 3個(gè)處理中，處理 2（光照 12 h/d）與處理 3（光照16 h/d）的無(wú)菌苗最為健壯，生長(zhǎng)速度較快，其中處理 3 的增殖系數(shù)和有效芽率均達(dá)到最大值，其平均苗高達(dá) 3.44 cm，與處理 1（光照 8 h/d）之 間極差達(dá)到 2.02 cm， 有效芽率與處理 1 之間極差達(dá)23.01%。 進(jìn)一步對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較得出，各組數(shù)據(jù)方差均具有齊次性，不同光照時(shí)間對(duì)增殖系數(shù)、有效芽率及平均芽高均有顯著性影響。切花菊白扇增殖培養(yǎng)的最佳光照時(shí)間為16 h/d。 綜上所述，切花菊白扇的最佳增殖培養(yǎng)基為 MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L，增殖培養(yǎng)的最佳光照時(shí)間為 16 h/d。 720 熱帶作物學(xué)報(bào) 第 40 卷 表4 光照時(shí)間對(duì)無(wú)菌苗增殖的影響 Tab. 4 Effects of lighting time on multiplication of sterile plantlets 處理 Treatment 光照時(shí)間Illumination time/(h·d1) 平均增殖系數(shù) Average proliferation coefficient 平均有效芽率Average effective germination rate/%平均苗高 Average seedling height/cm 生長(zhǎng)狀況 Growth status 1 8 2.38b47.08c1.42c無(wú)菌苗葉片翠綠，生長(zhǎng)速度緩慢 2 12 3.05a65.26b3.22b無(wú)菌苗健壯，葉片濃綠，生長(zhǎng)速度較快3 16 3.17a70.09a3.44a無(wú)菌苗健壯，葉片較大，生長(zhǎng)速度快 極差 0.79 23.01 2.02 注：同列不同小寫(xiě)字母表示處理間差異顯著（ P<0.05）。 Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference between treatments (P<0.05). 2.3 瓶?jī)?nèi)生根 將增殖培養(yǎng)產(chǎn)生的無(wú)根苗，切成 2 cm 左右的切段，接種至不同激素配比的生根培養(yǎng)基中，接種 20 d 后觀察并統(tǒng)計(jì)生根情況（圖 2）。由表 5可見(jiàn)，培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)素，對(duì)促進(jìn)無(wú)根苗生根具有良好效果，在生根率、生根根數(shù)、根長(zhǎng)及根系粗細(xì)程度上，均起到促進(jìn)作用，對(duì)照組 CK 的生根率為 96.67%，而添加了生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中生根率均達(dá) 100%，且根系生長(zhǎng)粗壯。對(duì)以上數(shù)據(jù)用SPSS 軟件進(jìn)行分析， 結(jié)果表明： 不同濃度的 NAA之間，生根率、根數(shù)、根長(zhǎng)均沒(méi)有顯著性差異；不同濃度的 IBA 之間，上述各個(gè)指標(biāo)亦均不存在顯著性差異。添加 NAA 的培養(yǎng)基上，根系較添加 IBA 的處理組粗壯，但生根根數(shù)、根長(zhǎng)均略低于 IBA 處理組。綜上所述， NAA 和 IBA 均適合進(jìn)行白扇無(wú)根苗的生根。 2.4 瓶外生根培養(yǎng) 從表 6 可看出，無(wú)菌苗用 50、 100 mg/L 的NAA 溶液處理 5 min 后，扦插的成活率和生根率均達(dá)為 96.9%， 平均生根數(shù)分別為 18.7 和 19.0 根，用 ABT 生根粉 500 mg/L 浸蘸后，成活率和生根率均為 93.8%，平均生根數(shù)為 12 根，略低于其他兩組處理。因此，白扇無(wú)菌苗的最佳瓶外扦插生根劑為 NAA 50 mg/L 和 NAA 100 mg/L。 表5 激素配比對(duì)瓶?jī)?nèi)生根的影響 Tab. 5 Effects of combinations of plant regulators on rooting of root-free plantlets in vitro 處理 Treatment NAA/ (mg·L1) IBA / (mg·L1) 生根率 Rooting rate/%平均根數(shù) Average number of roots 平均根長(zhǎng) Average root length/cm 根系粗細(xì) Root thickness CK 0 0 96.67 5.3 1.3 細(xì) 1 0.05 0 100 15.2 2.2 粗 2 0.10 0 100 15.2 2.3 粗 3 0.15 0 100 15.0 2.3 粗 4 0.20 0 100 15.4 2.2 粗 5 0 0.05 100 15.9 2.9 較粗 6 0 0.10 100 16.2 2.7 較粗 7 0 0.15 100 16.1 2.6 較粗 8 0 0.20 100 16.0 2.7 較粗 A：對(duì)照組； B：處理 2； C 處理 6。 A: Rooting culture CK; B:Proliferation culture 2; C: Proliferation culture 6. 圖2 不同生根培養(yǎng)基第20天的生根情況 Fig. 2 Rooting situation of different rooting media after 20 days 第 4 期 周 婷等 : 單頭切花菊白扇組培快繁技術(shù) 721 移栽后 5 d， 觀察到 4 種不同配比的扦插基質(zhì)中，無(wú)根苗均開(kāi)始生根；移栽后 7 d 統(tǒng)計(jì)成活率及生根率。由表 7 可見(jiàn)，無(wú)根苗在 4 種扦插基質(zhì)中的生根情況存在一定差異。其中，扦插到蛭石、蛭石珍珠巖 =1 1 的無(wú)根苗成活率和生根率最高，均為 96.9%，但蛭石珍珠巖 =1 1 這個(gè)組合的平均生根根數(shù)較多，達(dá) 14 根。因此， 白扇無(wú)菌苗的最佳扦插基質(zhì)為蛭石珍珠巖 =1 1。 綜上所述，瓶外扦插生根的最佳處理為將5 cm 左右的無(wú)根苗基部用生根劑 NAA 50 mg/L 或NAA 100 mg/L 處理浸蘸 5 min 后，扦插至蛭石珍珠巖 =1 1 的組合基質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)。 2.5 煉苗移栽 2.5.1 煉苗時(shí)間對(duì)生根苗移栽效果的影響 將生根培養(yǎng) 20 d 左右的無(wú)菌苗移到自然條件下，分別 表6 生根劑對(duì)無(wú)菌苗瓶外生根的影響 Tab. 6 Effect of root ingredient on the roots outside sterile bottle 處理 Treatment 生根率 Rooting rate/% 平均生根數(shù) Average number of rootsNAA 50 mg/L 96.9 18.7aNAA 100 mg/L 96.9 19.0aABT 生根粉 500 mg/L 93.8 12.0b注：同列不同小寫(xiě)字母表示處理間差異顯著（ P<0.05）。 Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference between treatments (P<0.05). 表7 基質(zhì)配比對(duì)無(wú)菌苗瓶外生根的影響 Tab. 7 Effect of matrix ratio on rooting outside sterile bottle 處理 Treatment 成活率 Survival rate/% 平均生根數(shù) Average number of roots蛭石 96.9 12.7 蛭石珍珠巖 =1 1 96.9 14.0 草炭土蛭石 =2 1 87.5 11.3 草炭土蛭石珍珠巖 =2 1 1 93.8 12.0 進(jìn)行不同時(shí)間的煉苗后，移栽至草炭土蛭石珍珠巖 =3 1 1 的基質(zhì)組合中， 移栽后 25 d 統(tǒng)計(jì)成活率。從表 8 中可知，松蓋 1 d 后開(kāi)蓋 6 d 的煉苗效果最好，移栽成活率達(dá) 100%，松蓋 1 d 后開(kāi)蓋 2 d 的成活率最低，為 88.54%，這可能是由于煉苗時(shí)間過(guò)短，無(wú)菌苗沒(méi)有充足的時(shí)間適應(yīng)復(fù)雜的外界環(huán)境，導(dǎo)致移栽后部分小苗出現(xiàn)萎蔫，最終枯死。松蓋 1 d 后開(kāi)蓋 8 d 的成活率為 91.67%，在煉苗過(guò)程中部分培養(yǎng)基發(fā)生污染，植株根系較綿軟，移栽時(shí)易發(fā)生斷根。因此，生根苗的最佳煉苗方式為：松開(kāi)瓶蓋煉苗 1 d，再開(kāi)蓋煉苗 6 d。 表8 煉苗時(shí)間對(duì)生根苗移栽效果的影響 Tab. 8 Effect of time of domestication on transplanting of rooted plantlets 煉苗天數(shù)Days of refining/d移栽株數(shù) Number of transplanted plants 成活株數(shù) Number of living plants 成活率 Survival rate/% 2 96 85 88.54 4 96 93 96.90 6 96 96 100.00 8 96 88 91.67 2.5.2 基質(zhì)配比對(duì)生根苗移栽效果的影響 將生根培養(yǎng) 20 d 左右的無(wú)菌苗移到自然條件下進(jìn)行松蓋煉苗 1 d，再開(kāi)蓋煉苗 6 d 后，移栽至 4 種基質(zhì)配比的基質(zhì)中，移栽后 20 d 統(tǒng)計(jì)成活率和觀察小苗的生長(zhǎng)狀態(tài)（圖 3）。由表 9 可見(jiàn)，生根苗在草炭土蛭石 =2 1、草炭土珍珠巖 =2 1 和草炭土蛭石珍珠巖 =3 1 1 這 3 種移栽基質(zhì)中的成活率均為 100%， 其中草炭土蛭石珍珠巖= 3 1 1 這個(gè)組合小苗的生長(zhǎng)情況最佳， 恢復(fù)迅速，且頂端有新葉長(zhǎng)出，葉片大，葉色翠綠。 4種移栽基質(zhì)中，草炭土的移栽效果最差，成活率為 93.75%，在移栽過(guò)程中出現(xiàn)無(wú)菌苗易倒伏的情況。因此，生根苗的最佳移栽基質(zhì)為草炭土蛭 表9 不同基質(zhì)配比對(duì)生根苗移栽效果的影響 Tab. 9 Effect of combinations of media on transplanting of rooted plantlets 移栽基質(zhì) Transplanting matrix 移栽株數(shù) Number of transplanted plants成活株數(shù) Number of living plants成活率 Survival rate/% 生長(zhǎng)情況 Growing situation 草炭土 96 90 93.75 小苗恢復(fù)較慢，長(zhǎng)勢(shì)較差草炭土蛭石 =2 1 96 96 100.00 小苗恢復(fù)良好，長(zhǎng)勢(shì)較好草炭土珍珠巖 =2 1 96 96 100.00 小苗恢復(fù)良好，長(zhǎng)勢(shì)較好草炭土蛭石珍珠巖 =3 1 1 96 96 100.00 小苗恢復(fù)迅速，長(zhǎng)勢(shì)良好722 熱帶作物學(xué)報(bào) 第 40 卷 A：開(kāi)蓋煉苗； B： 4 種移栽基質(zhì)； C：移栽后 20 d。 A: Seedling hardening; B: Four types of substrates; C: 20 days after transplanted. 圖3 煉苗及移栽 Fig. 3 Plantlet acclimatization and transplant 石珍珠巖 =3 1 1。 綜合以上分析，生根苗的最佳移栽方式為：先松開(kāi)瓶蓋煉苗 1 d，再開(kāi)蓋煉苗 6 d，清洗掉根系上附著的瓊脂，最后移栽到草炭土蛭石珍珠巖 =3 1 1 的基質(zhì)中。 3 討論 組培快繁具有繁殖速度快、培養(yǎng)周期短、保持母本優(yōu)良性狀且不受地域、季節(jié)限制的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用到花卉種苗的工廠化生產(chǎn)中，對(duì)于一些繁殖系數(shù)低或新引進(jìn)培育的花卉品種進(jìn)行組培快繁，可以短期內(nèi)獲得大量基因型一致的優(yōu)質(zhì)苗木10-11。 菊科植物常用的再生體系有 2 種，分別為誘導(dǎo)外植體直接分化不定芽成為新植株和誘導(dǎo)愈傷組織再分化這 2 種途徑。大多數(shù)的研究者認(rèn)為，由莖段或葉片作為外植體直接誘導(dǎo)不定芽，能較好的保持原有的遺傳性狀，避免變異和嵌合體的發(fā)生。 Shinoyama 等12研究表明通過(guò)愈傷組織途徑建立再生體系需要 143180 d， 而不定芽直接誘導(dǎo)再生體系僅需 80120 d，且愈傷誘導(dǎo)體系比不定芽誘導(dǎo)體系的再生率低。本研究采用直接分化不定芽的方法，以白扇的頂芽和腋芽為外植體建立無(wú)菌株系，得出如下結(jié)果：頂芽外植體的最佳消毒條件為 75%酒精 30 s+0.1%升汞溶液消毒 3 min；帶腋芽莖段的最佳消毒條件為 75%酒精 30 s+0.1%升汞溶液消毒 4 min； 在初代培養(yǎng)中，以頂芽誘導(dǎo)無(wú)菌苗或不定芽的效果比帶腋芽莖段更好，因此，頂芽為初代培養(yǎng)的最佳外植體； 白扇的最佳初代培養(yǎng)基為 MS+6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.1 mg/L。 在植物組織培養(yǎng)中將不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行組合搭配使用，會(huì)比單獨(dú)使用效果更佳。程蕾潔13研究發(fā)現(xiàn)，在對(duì)外植體的誘導(dǎo)過(guò)程中，用不同濃度的 6-BA 和 NAA 進(jìn)行組合比單一的采用6-BA 對(duì)芽的萌發(fā)率影響更大。本研究結(jié)果表明，白扇無(wú)菌苗的增殖培養(yǎng)的最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L。并且隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，無(wú)菌苗的株高也隨之增加，當(dāng)光照時(shí)間為 16 h/d 時(shí)，平均株高均高于 8 h/d 和12 h/d，且無(wú)菌苗生長(zhǎng)健壯、葉面積增大，這一結(jié)果與 Adams 等14和 Kurilik 等15的研究結(jié)果一致。 菊科植物為較易生根的草本植物，生根周期較短，在組培快繁中一般將無(wú)根試管苗接種至添加了 NAA、 IBA 或 IAA 生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)試管苗不定根產(chǎn)生，再進(jìn)行馴化移栽。陳燕梅16、王麗華17等研究表明， 1/2MS 培養(yǎng)基較 MS 培養(yǎng)基、 1/4MS 培養(yǎng)基更利于菊科花井的生根培養(yǎng)。本研究得出，只要添加了生長(zhǎng)素的 1/2MS 培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)白扇無(wú)根苗生根，生根率達(dá) 100%。無(wú)菌苗的馴化煉苗對(duì)其出瓶成活率起到關(guān)鍵作用，煉苗可以使無(wú)菌苗植株從恒溫、恒濕、無(wú)菌高養(yǎng)分的環(huán)境逐漸過(guò)渡到復(fù)雜的自然環(huán)境中。經(jīng)煉苗移栽， 即將 白扇 生根的無(wú)菌苗經(jīng)松蓋 1 d，開(kāi)蓋 6 d 進(jìn)行煉苗， 移栽到基質(zhì)為草炭土蛭石珍珠巖 =3 1 1 的穴盤(pán)中， 移栽 15 d 后成活率達(dá)100%； 草炭土蛭石珍珠巖 =3 1 1 為最佳移栽基質(zhì)，移栽 20 d 后成活率達(dá) 100%，小苗恢復(fù)迅速，長(zhǎng)勢(shì)良好。 本研究不僅開(kāi)展了有根試管苗的露地移栽，還嘗試了無(wú)根苗的瓶外生根試驗(yàn)。結(jié)果表明，瓶外扦插生根的最佳處理為將 5 cm 左右的無(wú)根苗基部用生根劑 NAA 50 mg/L 或 NAA 100 mg/L 處理浸蘸 5 min 后， 扦插至蛭石珍珠巖 =1 1 的組合基質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)。無(wú)根苗直接生根可以進(jìn)一步減少移苗步驟和移栽成本，可以快速的生產(chǎn)白第 4 期 周 婷等 : 單頭切花菊白扇組培快繁技術(shù) 723 扇種苗，并且在實(shí)際應(yīng)用中可以將瓶苗直接交給切花菊生產(chǎn)企業(yè)， 由生產(chǎn)者自主安排扦插時(shí)間，減少運(yùn)輸成本和能源消耗，做到種植季節(jié)種苗的持續(xù)供應(yīng)。 本研究的不足之處在于誘導(dǎo)的試管苗沒(méi)有經(jīng)過(guò)變異檢測(cè)，因此下一步的研究需要進(jìn)行田間觀察和分子鑒定，以確保繁育過(guò)程中種苗的一致性與高質(zhì)量。 參考文獻(xiàn) 1 王蔚林 . 菊花再生體系的建立及用 PPMADS5 基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的研究 D. 北京 : 首都師范大學(xué) , 2007. 2 王 卉 , 劉少翔 , 趙處文 , 等 . 地被菊組培快繁及栽培技術(shù)研究 J. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué) , 1995, 35(1): 49-51. 3 楊文雅 . 切花多頭菊莖尖離體培養(yǎng)與快繁技術(shù)研究 D. 銀川 : 寧夏大學(xué) , 2014. 4 楊玉萍 , 李宜蕓 , 李茜雯 , 等 . 紫錐菊葉柄高效再生體系的建立 J. 華南師范大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版 ), 2015, 47(4): 94-97. 5 Renou J, Brochard P, Jalouzot R. 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