34(2)247-253 中國生物防治學(xué)報 Chinese Journal of Biological Control 2018 年 4 月 收稿日期： 2017-11-20 基金項目： 國家重點研發(fā)計劃（ 2017YFD0200400）；國家現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（ CARS-25）；國家自然科學(xué)基金（ 31572014）；農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室基金 作者簡介： 劉貽聰，碩士研究生， E-mail： yicongliu0829163.com； *通信作者，研究員， E-mail： wangshaolicaas.cn。 DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2018.02.011 麗蚜小蜂糖轉(zhuǎn)運蛋白基因克隆及其誘導(dǎo)表達 劉貽聰，張友軍，吳青君，謝 文，王少麗 * （中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所 ， 北京 100081） 摘要： 麗蚜小蜂 Encarsia formosa Gahan是粉虱類害蟲的重要寄生性天敵昆蟲，補充糖分等營養(yǎng)可以延長麗蚜小蜂壽命及增加其產(chǎn)卵量，但對其糖轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白基因及其糖誘導(dǎo)表達尚不清楚。本研究克隆獲得麗蚜小蜂的糖轉(zhuǎn)運蛋白 EfST1基因，與其他寄生蜂的糖轉(zhuǎn)運蛋白基因序列同源性達 65%以上；進一步采用實時熒光定量 qPCR 技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，飼喂不同濃度的葡萄糖溶液均可顯著提高 EfST1 基因的表達量，且飼喂不同時間段（ 2 48 h）后，麗蚜小蜂 EfST1基因表達量均顯著高于對照組， 2 h和 48 h處理組間差異不顯著。綜上， EfST1 基因可能與糖分補充及其轉(zhuǎn)運密切相關(guān)，該基因誘導(dǎo)表達受糖分濃度影響小。研究結(jié)果為進一步研究寄生蜂生物防治過程中補充營養(yǎng)及其轉(zhuǎn)運機制奠定基礎(chǔ)。 關(guān) 鍵 詞 ： 麗蚜小蜂； 煙 粉虱； CODEHOP；糖轉(zhuǎn)運蛋白基因；表達分析 中圖分類號 ： S476.3 文獻標識碼： A 文章編號： 1005-9261(2018)02-0247-07 Cloning and Induced Expression of Sugar Transporter Gene in Parasitoid, Encarsia formosa Gahan LIU Yicong, ZHANG Youjun, WU Qingjun, XIE Wen, WANG Shaoli* (Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China) Abstract: Encarsia formosa Gahan is a kind of endoparasitoid world widely used for control of pest whiteflies. Sugar supplement prolong longevity and/or increase their egg production; however, the sugar transporter gene and the induced expression in E. formosa was unclear. In this present study, the sugar transporter gene named EfST1 was cloned; sequence alignment and phylogenetic analysis revealed that EfST1 shared more than 65% homology with other parasitoids. Real-time PCR showed that EfST1 was significantly expressed by feeding different concentrations of glucose. After feeding sugar for different periods (2 48 h) on 10% glucose, EfST1 gene expression was found to be increased compared to the water control. Besides, there were no significant differences between the 2 h and 48 h feeding treatments. In conclusion, the EfST1 gene was probably related to sugar supplement and transportation; and the gene expression induced by different sugar concentrations was not greatly fluctuated. The results will provide a basis for studying the nutrition supplement and transportation mechanism during the biological control of parasitoids. Key words: Encarsia formosa; Bemisa tabaci; CODEHOP; sugar transporter gene; expression analysis 麗蚜小蜂 Encarsia formosa Gahan 是粉虱類害蟲的重要寄生性天敵昆蟲，麗蚜小蜂除了可以取食煙粉虱 Bemisa tabaci 若蟲外，還能以煙粉虱分泌的蜜露及花蜜作為食物來源。 2004 年，就有報道稱粉虱分泌的蜜露可以延長麗蚜小蜂的壽命并促進卵子發(fā)育 1。研究表明，寄生蜂補充取食糖分之后其壽命及對靶標生物的寄生率等生物學(xué)特性也有提升 2， Williams 等 3測定了不同濃度和不同時間飼喂蔗糖后橄欖果蠅248 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報 第 34 卷 Bactrocera oleae 的寄生蜂 Psyttalia lounsburyi 壽命、糖分攝 入量和能量攝取，發(fā)現(xiàn)蔗糖濃度和喂飼時間對橄欖果蠅的寄生蜂的壽命有顯著影響，糖分攝取量和能量攝取均可以顯著增加。粉虱類害蟲的另一個寄生蜂 槳角蚜小蜂 Eretmocerus eremicus，麗蚜小蜂和海氏槳角蚜小蜂 Er. hayati Zolnerowich Rose 也可以利用糖類來延長壽命和增加生殖率 4,5。 糖分等營養(yǎng)物質(zhì)進入昆蟲體內(nèi)后，通過轉(zhuǎn)運再被吸收利用。已經(jīng)證明，刺吸式口器昆蟲煙粉虱 Bemisia tabaci（ Gennadius） 以含有高濃度蔗糖的植株韌皮部汁液為營養(yǎng)物質(zhì)，主要通過糖轉(zhuǎn) 運蛋白使葡萄糖從腸道內(nèi)進入細胞 6。褐飛虱 Nilaparvata lugens（ Stl） 體內(nèi)糖轉(zhuǎn)運基因 Nlst6 被干擾后，昆蟲產(chǎn)卵前期顯著性延長，卵期顯著縮短，卵數(shù)量減少，蟲體變小，脂肪體和卵巢的蛋白質(zhì)含量和卵黃原蛋白基因表達量的減少，推測該 Nlst6 基因在褐飛虱生長發(fā)育、產(chǎn)卵等方面具有重要作用 7。糖轉(zhuǎn)運蛋白不僅在糖的運轉(zhuǎn)過程中起作用，在家蠶 Bombyx mori 中，發(fā)現(xiàn)它們還可作為家蠶核型多角體病毒 BmNPV 感染時的受體，因為糖轉(zhuǎn)運蛋白只在易受感染的種群中被調(diào)節(jié) 8。進一步研究發(fā)現(xiàn)，豌豆蚜 Acyrthosiphon pisum（ Harris） 基因組中有 19 個糖轉(zhuǎn)運基因，目前僅發(fā)現(xiàn) ApST3 和 ApST4 基因承擔(dān)著葡萄糖和果糖的運輸 9；而褐飛虱種群中糖轉(zhuǎn)運蛋白家族的 Nlst16 基因和 Nlst1 基因均在褐飛虱中腸中高表達，但 Nlst16 基因在褐飛虱取食 2 h 后被誘導(dǎo)表達升高，但 Nlst1 基因并未受到害蟲取食的誘導(dǎo)而進行表達 10，說明生物體內(nèi)有其特定的糖轉(zhuǎn)運蛋白基因承擔(dān)著糖分的吸收和運轉(zhuǎn)。麗蚜小蜂種群繁育過程中需補充糖分提升其種群擴繁效率，但截止目前，尚無麗蚜小蜂糖轉(zhuǎn)運蛋白基因及糖分攝入后的表達等 報道，限制了對麗蚜小蜂糖轉(zhuǎn)運分子機理的深入研究，因此克隆麗蚜小蜂糖轉(zhuǎn)運蛋白基因序列以及明確其在麗蚜小蜂體內(nèi)的表達就成為重要基礎(chǔ)。 本研究首先采用 CODEHOP（ Consensus-Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primers）在線軟件 11，在線程序化設(shè)計簡并引物，同源克隆麗蚜小蜂糖轉(zhuǎn)運蛋白基因；然后利用實時熒光定量 PCR 技術(shù)研究該基因在不同濃度糖分及飼喂不同時間后在麗蚜小蜂成蜂體內(nèi)的表達譜，研究結(jié)果將為進一步明確麗蚜小蜂對糖分吸收和轉(zhuǎn)運機制提供堅實基礎(chǔ)。 1 材料 與方法 1.1 供試麗蚜小蜂 麗 蚜小蜂蛹由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所提供，在人工氣候箱內(nèi)煙粉虱若蟲上繁育，煙粉虱若蟲飼養(yǎng)在一品紅 Euphorbia pulcherrima 上，培養(yǎng)條件為溫度（ 26 1） 、 相對濕度 60% 80%、 光周期 16L:8D。 1.2 軟件與試劑 試驗采用在線 CODEHOP（ http:/blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.html/）和 Blockmaker 軟件 （ Fred Hutchinson Cancer Research Center， USA） 。 感受態(tài)細胞（ Trans1-T1）和 T1 克隆載體（ pEASY-T1）均購自全式金生物技術(shù)有限公司。 RNA 提取試劑盒 TRIzol 購自 Invitrogen 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScript II 和 LA Taq 聚合酶購自于北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司（ TaKaRa）； PCR 產(chǎn)物純化試劑盒購自北京康為世紀公司；熒光定量 PCR 試劑盒為天根生化科技 （ 北京 ） 有限公司生產(chǎn)的熒光定量預(yù)混試劑增強版 ； DNA Marker 購自于北京天根生化生物科技有限公司；葡萄糖購自于北京化工廠。 引物合成和序列測定委托北京擎科生物技術(shù)有限公 司進行。 1.3 簡并引物設(shè)計 利用 CODEHOP（ Consensus-Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primers）軟件設(shè)計簡并引物。 以麗蠅蛹集金小蜂 Nasonia vitripennis（ Accession No: XP_008203106）為遞交序列，再從 NCBI 數(shù)據(jù)庫中選取 3 個代表性的昆蟲糖轉(zhuǎn)運蛋白基因序列作為引物設(shè)計的模板，它們分別是短管赤眼蜂 Trichogramma pretiosum Riley（ Accession No: XP_014233934）、普 通麥莖蜂 Cephus cinctus（ Accession No: XP_015604651）和傳粉榕小蜂 Ceratosolen solmsi marchali（ Accession No: XP_011495920）。以 blockmaker12對這些序列進行塊狀比對，找出 14 塊無間隙高度保守的氨基酸序列，最后將比對結(jié)果遞交到 CodeHop 服務(wù)器進行運算 13，檢索出幾條昆蟲糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的簡并引物。檢索主要設(shè)定參數(shù)為 最大核心簡并度 （ Maximum core degeneracy） ：128；目標夾板區(qū)溫度 （ Target clamp temperature） ： 60.0 ，密碼子使用表 （ Codon usage table） : Apis mellifera。依據(jù)簡并引物簡并度盡可能小、 Tm 值盡可能高、上下游引物之距離盡可能大等原則選擇引物。 第 2 期 劉貽聰 等 ： 麗蚜小蜂糖轉(zhuǎn)運蛋白基因克隆及其誘導(dǎo)表達 249 1.4 麗蚜小蜂糖轉(zhuǎn)運蛋白基因克隆 用 TRIzol 法提取麗蚜小蜂總 RNA，并以 Oligo dT 為引物反轉(zhuǎn)錄 cDNA，以上述設(shè)計的簡并引物進行PCR 擴增。隨后 PCR 擴增反應(yīng)選用 Touch-down PCR 法進行：首先在 95 條件下預(yù)變性 5 min；然后 94 變性 30 s，從 65 下降到 50 退火 30 s，每個循環(huán)降低 1 ， 72 延伸 1 min，共 5 個循環(huán)；隨后再94 變性 30 s， 55 退火 1 min， 72 延伸 1 min，共進行 25 個循環(huán)；最后在 72 延伸 10 min。 PCR 產(chǎn)物在 1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測。回收目的條帶后與 pEASY-T1 載體連接過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞， 37 條件下培養(yǎng)過夜，挑選白斑。經(jīng) M13 通用引物進行菌液 PCR 擴增，鑒定陽性克隆。取陽性克隆送交北京擎科生物技術(shù)有限公司測序，采用通用引物 M13 進行序列測定，測序結(jié)果輸 GenBank 進行blastx 同源性比較。 1.5 麗蚜小蜂 EfST1 基因 系統(tǒng)進化分析 利用 GenBank 數(shù)據(jù)庫已有的昆蟲糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的氨基酸序列：黃翅菜葉蜂 Athalia rosae（ XP_012266479.1）；普通麥莖蜂（ XP_015604651）；紅火蟻 Solenopsis invicta（ XP_011169177.1）；中華蜜蜂 Apis cerana（ XP_016910856.1） ；黃蜂 （ XP_015178798.1） ；蘋果實蠅繭蜂 Diachasma alloeum（ XP_015108434.1） ；傳粉 榕小蜂 （ XP_011495920.1） ；麗蠅蛹集金小蜂 N. vitripennis（ XP_008203106.1） ；短管赤眼蜂 （ XP_014233934.1） ， 采用 Clustalw 2.0 軟件比較不同物種的 ST 氨基酸序列，并計算它們之間序列的相似性， 采用 MEGA 6.0 軟件的鄰接法（ Neighbour-Joining）構(gòu)建了麗蚜小蜂 EfST1 序列與其他相近昆蟲 ST 之間的系統(tǒng)進化樹。 1.6 麗蚜小蜂 EfST1 基因的誘導(dǎo)表達 采集初羽化（ 24 h）的麗蚜小蜂雌蜂進行葡萄糖飼喂處理。第一，不同時間處理組，飼喂 10%葡萄糖2、 12、 24、 48 h； 第二，不同 濃度 處理組，小蜂分別飼喂 2 h，飼喂?jié)舛纫来螢?1%、 5%、 10%、 15%、 20%；清水處理作為對照 。 麗蚜小蜂 EfST1 基因的 mRNA 表達采用熒光定量 PCR 反應(yīng)測定，該 PCR 反應(yīng)中所采用引物序列如下：正向： 5-CTTCATCTTCTGCGTGGCTA-3，反向： 5-TCTGTTCGTTCATGCGACGTT-3。PCR 反應(yīng)體系為 5.0 L qPCR Mix， 5 mol/L 正反向引物各 0.5 L， 2.0 L cDNA 模板，用超純水補到 10 L。實 時熒光定量 PCR 程序如下： 95 預(yù)變性 3 min； 95 20 s， 60 30 s， 72 35 s， 40 個循環(huán)。 選擇麗蚜小蜂的 18S rRNA 作為參照基因，引物序列為：正向： 5-ATTCCATGCACACAGTATT CAGG-3，反向： 5-CGGCCCAACTAATATCCCGTC-3。 PCR 反應(yīng)后進行熔解曲線分析，以排除非特異性 PCR 產(chǎn)物的污染。每個試驗至少進行 4 個生物學(xué)重復(fù)， 4 個技術(shù)性重復(fù)。對所克隆的麗蚜小蜂糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的 mRNA 熒光定量表達結(jié)果用 ABI 7500 SDS v 1.4 軟件（ Applied Biosystems， USA），采用 2 Ct方法進行數(shù)據(jù)記錄和分析。 2 結(jié)果與分析 2.1 簡并引物設(shè)計及其 PCR 擴增 根據(jù) CODEHOP 程序運行結(jié)果，分別選取 3 條上游引物（ ST1-F、 ST2-F 和 ST3-F）和 3 條下游引物（ ST1-R、 ST2-R 和 ST3-R）進行配對及 PCR擴增，最后篩選出一對能夠成功擴增出預(yù)期基因片段的簡并引物。上游引物： 5-TGAGTCCACTGGTT GG ATTCttyg tna cnc c-3；下游引物： 5-AATACA GA CTATAACAAACATGTGCCatyc arc arm a-3。 簡并引物 PCR 擴增后，得到一條高度特異性的PCR 產(chǎn)物，產(chǎn)物大小為 824 bp，與預(yù)期擴增產(chǎn)物大小一致（圖 1）。 2.2 EfST1 基因的 序列 比對及進化樹分析 PCR 產(chǎn)物的測序結(jié)果進行 blast 同源性比較， 800 bpM 1 2 3M： DNA Marker ； 12：麗蚜小蜂 RTPCR 擴增 RTPCR amplification of E. formosa； 3：空白對照 Negative control 圖 1 簡并引物 RT-PCR 擴增麗蚜小蜂的糖轉(zhuǎn)運蛋白基因 Fig. 1 Sugar transporter gene in E. formosa by RT-PCR using degenerate primers 250 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報 第 34 卷 發(fā)現(xiàn)所 克隆的麗蚜小蜂 cDNA 序列所編碼的氨基酸序列與 GenBank 上其他糖轉(zhuǎn)運蛋白基因具有高度相似性 ，特別是與其他寄生性天敵昆蟲比較結(jié)果表明該基因存在膜翅目昆蟲糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的保守序列 （圖 2），證明 所克隆的 cDNA 序列為麗蚜小蜂糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達序列，命名為 EfST1 基因。 通過與其 他昆蟲之間構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)不同昆蟲糖轉(zhuǎn)運基因在進化上保守性強，相比其他物種而言，麗蚜小蜂 EfST1 序列在系統(tǒng)進化上與同屬于膜翅目的短管赤眼蜂的遺傳距離更近，且同源性 高達 84%（圖 3） 。 C. cinctus (XP_015604651) FFVTPILGSVSDRCRLKQGRRRPFILLLAVGVLIGLILVPNGEGMGYAFGDVPSVTNVTV C. solmsi marchali (XP_011495920.1) FFVTPILGSVSDRCRLKQGRRRPFILLLAIGVLVGLILVPNGESIGYAFGDTS-SNFTM N. vitripennis (XP_008203106.1) FFVTPILGSVSDRCRLKQGRRRPFILLLAIGVLMGLLLVPNGESMGYAFGDTR-MNFTA T. pretiosum (XP_014233934.1) FFVTPLLGSLSDRCRLKQGRRRPFIALLAIGVLMGLILVPNGEGMGYAFGDIQG NYTA E. formosa (EfST1) -VLMGLILVPNGEDLGYSFGDTKS-NFSA C. cinctus (XP_015604651) PHGHRTTATSS-KDDAPMTSSVS-SHSWGIFFTILGTVLLDFDADACQS C. solmsi marchali (XP_011495920.1) GMLHRTTAKTM-GNDSLPPIPPS-SHSWGIIFTILGTVLLDFDADACQS N. vitripennis (XP_008203106.1) ALGHRISGKTA-HNETLPPPPPS-SHSWGIFFTILGTVLLDFDADACQS T. pretiosum (XP_014233934.1) SFIHRITGKTAKVI-SDNATMTTATTTIEPPLVQPSHSWGIFFTILGTVLLDFDADACQS E. formosa (EfST1) RFIHRTTGKATTVIPLNATVAPPPPS-THSWGIFFTILGTVLLDFDADACQS C. cinctus (XP_015604651) PARAYLLDVTVPEDHARGLSTFTIMAGLGGFMGYGLGGINWDATTIGVMLGGHLHATFTL C. solmsi marchali (XP_011495920.1) PARAYLLDVTLPEDHARGLSTFTIMAGLGGFMGYGLGGINWDATSIGIALGGHLHATFTL N. vitripennis (XP_008203106.1) PARAYLLDVTIPEDHAKGLSTFTIMAGLGGFMGYGLGGINWDATAIGVALGGHLHATFTL T. pretiosum (XP_014233934.1) PARAYLLDVTIPEDHARGLSTFTIMAGLGGFMGYGLGGINWDATRIGVALGGHLHAVFTL E. formosa (EfST1) PARAYLLDVTLPEDHARGLSTFTIMAGLGGFMGYGLGGINWDATAIGVALGGHLHATFTL C. cinctus (XP_015604651) ITIIFVICVALTITSFKEIPLEVLERDQYQQLQNQKIAEEQDKDDEREKIANDECTSYGA C. solmsi marchali (XP_011495920.1) ITFIFIICVASTLTSFKEIPLDFIESNEYKQQLQQKLENEQ-RDNEQEKITEEDSITYET N. vitripennis (XP_008203106.1) ITIIFIICVASTLTSFKEIPLDFLESDDCKEQLQRKLEEER-KQNEAEKMIPDESATYGT T. pretiosum (XP_014233934.1) ITFIFIFCVASTLTSFKEIPLVFLESEECQQQLREMAEDKR-RQSESGKIAAEESVTYGT E. formosa (EfST1) ITIIFIFCVASTLTSFKEIPLDFLESEECQKQLQIKIEQER-RMNEQMKPAADGSGTYGT C. cinctus (XP_015604651) LGHESETN-IGKTDDFVLKPLPVEEPVKR-LGAVPMVPDVPAPP-D C. solmsi marchali (XP_011495920.1) GGNESEINSIDNTQEFQMKELS-NEPCK-LGTAPIFPDVQSSV-N N. vitripennis (XP_008203106.1) IGNEQEVDNDVNPEEIPMKPIEQPPPAPRKPGTVPMIPDVQPAP-R T. pretiosum (XP_014233934.1) LGNEQEME-NGEELPMKELP-PQRK-AGAVPMIPDVKSPPPPRPKPPPPAAAGEAS E. formosa (EfST1) LGNDSEIE-AEDIPMKKMP-EKAGVVPIVPEVPLAP- C. cinctus (XP_015604651) CEGSYVNYGFDENP-DANPRATLQEYLFSILYMPHSMRMVCLTNLFCWMAHVCYSLYFTD C. solmsi marchali (XP_011495920.1) LDSRIIESIDDAN-VDPKATIREYLLSILYMPHSMRMVCLTNLCCWMAHVCYSLYFTD N. vitripennis (XP_008203106.1) PADEYTHLGAPASESAPNPKATLQEYLYSILYMPHSMRMVCLTNLCCWMAHVCYSLYFTD T. pretiosum (XP_014233934.1) ADAAEAVILDSDDAAAANPKATLQEYLYSILYMPHSMRMVCLTNLCCWMAHVCYSLYFTD E. formosa (EfST1) -PTTTGEDPE-ANPKASLQEYLYSILYMPH- 注： 相同氨基酸用黑色陰影表示，保守氨基酸替換用灰色陰影表示。 Note: Identical amino acids are shaded in black, and conservative substitutions are shaded in grey. 圖 2 麗蚜小蜂 EfST1 基因與 GenBank 其他昆蟲 ST 基因的氨基酸序列比較 Fig. 2 Comparisons of deduced amino sequences of EfST1 gene in E. formosa and the ST genes in other insects from GenBank 2.3 麗蚜小蜂 EfST1 基因 的 表達分析 以分別取食不同濃度葡萄糖的麗蚜小蜂及取食 10%葡萄糖不同時間的麗蚜小蜂 cDNA 為模板，以 18S rRNA 為內(nèi)參基因，采用 qPCR 方法進行麗蚜小蜂 EfST1 基因表達差異分析。發(fā)現(xiàn)飼喂不同濃度葡萄糖的麗蚜小蜂處理組，其 EfST1 基因的表達量均受到顯著誘導(dǎo)，高于對照組小蜂的 EfST1 基因表達量。飼喂 15%和 20%濃度的葡萄糖后，麗蚜小蜂 EfST1 基因的表達量明顯高于飼喂 1%、 5%和 10%的處理組，但在不同處理組間差異不顯著（圖 4a）。 同時發(fā)現(xiàn)，以不飼喂葡萄糖的麗蚜小蜂的表達量作為對照，飼喂 2、 12、 24、 48 h 葡萄糖后麗蚜小蜂糖轉(zhuǎn)運蛋白 EfST1 基因的表達量均高于不飼喂葡萄糖的對照組，從飼喂 2 h 持續(xù)升高至 48 h，說明糖分飼喂可誘導(dǎo)該糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達，且該誘導(dǎo)作用至少可持續(xù) 2 d（圖 4b）。 第 2 期 劉貽聰 等 ： 麗蚜小蜂糖轉(zhuǎn)運蛋白基因克隆及其誘導(dǎo)表達 251 A t h a l i a r o s a e ( X P _ 0 1 2 2 6 6 4 7 9 . 1 )C e p h u s c i n c t u s ( X P _ 0 1 5 6 0 4 6 5 1 . 1 )S o l e n o p s i s i n v i c t a ( X P _ 0 1 1 1 6 9 1 7 7 . 1 )A p i s c e r a n a ( X P _ 0 1 6 9 1 0 8 5 6 . 1 )P o l i s t e s d o m i n u l a ( X P _ 0 1 5 1 7 8 7 9 8 . 1 )D i a c h a s m a a l l o e u m ( X P _ 0 1 5 1 0 8 4 3 4 . 1 )C e r a t o s o l e n s o l m s i m a r c h a l i ( X P _ 0 1 1 4 9 5 9 2 0 . 1 )N a s o n i a v i t r i p e n n i s ( X P _ 0 0 8 2 0 3 1 0 6 . 1 )T r i c h o g r a m m a p r e t i o s u m ( X P _ 0 1 4 2 3 3 9 3 4 . 1 )E n c a r s i a f o r m o s a ( E f S T 1 )0 . 0 58 46 11 0 06 14 27 27 1圖 3 麗蚜小蜂 EfST1 基因與其他昆蟲的系統(tǒng) 進化分析 Fig. 3 Phylogenetic analysis based on EfST1 gene from E. formosa with other insect STs 2 h 1 2 h 2 4 h 4 8 h0 h0 . 00 . 51 . 01 . 52 . 0a baa bab相對表達量Relativegeneexpression飼 喂 葡 萄 糖 時 間 F e e d i n g p e r i o d飼 喂 葡 萄 糖 濃 度 G l u c o s e c o n c e n t r a t i o n1 % 5 % 1 0 % 1 5 % 2 0 %清 水 C K0 . 00 . 51 . 01 . 52 . 02 . 5aa ba baabb相對表達量Relativegeneexpressiona注：圖中數(shù)據(jù)為平均值 標準誤；不同小寫字母表示經(jīng) Tukeys HSD 法檢驗在 0.05 水平差異顯著。 Note: Data are mean SE. Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level by Tukeys HSD test. 圖 4 飼喂葡萄糖不同濃度 （ a） 及不同時間 （ b） 后麗蚜小蜂 EfST1 基因的相對表達量 Fig. 4 Relative expression of EfST1 gene in E. formosa after feeding glucose in different concentrations (a) and different periods (b) 3 討論 本文利用 CODEHOP 軟件設(shè)計麗蚜小蜂的糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的擴增引物， 其 3和 5端分別為核心簡并區(qū)和非簡并性夾板結(jié)構(gòu)，這樣設(shè)計的優(yōu)點既減少了引物的簡并度，又提高了退火溫度，保障了最終 RT-PCR擴增的成功率及擴增 產(chǎn)物的特異性 14。因此通過 CODEHOP 設(shè)計簡并引物，可 通過 PCR 快速準確地擴增出靶標物種中預(yù)期的同源基因， 這在 苛求 芽 胞 桿菌 Bacillus fastidious 尿酸酶 以及其他多個未知基因克隆中也成功應(yīng)用過 15,16，因此在 生物學(xué)信息較少、基因同源性低的其他物種未知基因的克隆和獲取 中具有明顯優(yōu)勢，并且會繼續(xù)發(fā)揮作用 17。 本研究克隆獲得了一個 824 bp 的麗蚜小蜂糖轉(zhuǎn)運蛋白基因片段，與其他已報道的寄生蜂的序列相似性在 67%以上，而家蠶中糖轉(zhuǎn)運蛋白 BmST5 基因編碼區(qū)全長序列為 1527 bp，該基因與其他害蟲的 同源蛋白序列相似性 也 在 50%以上 18， 與此相比， 麗蚜小蜂 EfST1 基因功能區(qū)序列與其他寄生蜂 序列 相似性 和 其他昆蟲之間的相似性差異不大 。 家蠶糖轉(zhuǎn)運蛋白基因 BmST3 克隆后，依據(jù) 家蠶基因組精細圖譜被定位在 27號染 色體上 19；而麗蚜小蜂該基因的 全長序列 有待于進一步研究 獲得 ， 將 有助于解析基因結(jié)構(gòu)和典型結(jié)構(gòu)域（例如 Sugar_tr、其他跨膜結(jié)構(gòu)域等） ，為 研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)。 研究發(fā)現(xiàn)，田間給寄生蜂補充糖分可以提高寄生蜂的寄生率及其對靶標害蟲的生物防治效能。以往研 252 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報 第 34 卷 究發(fā)現(xiàn)，采用 5%、 10%和 20%的不同濃度糖分飼喂后，海氏槳角蚜小蜂的壽命高于 不飼喂的 對照組，飼喂 10%葡萄糖后小蜂壽命高于對照 5.9 倍，據(jù)此認為 10%是寄生蜂室內(nèi)飼養(yǎng)時糖分補充時的適宜濃度 5。更高濃度的糖分補充時，寄生蜂存活率升高，但其取食時間也會延長 3。綜合考慮糖分濃度和取食糖分的時間，發(fā)現(xiàn)橄欖果蠅的寄生蜂 P. lounsburyi 羽化后 2 3 d 補充糖分，小蜂則會獲得更多的能量 3，但其取食后對糖轉(zhuǎn)運蛋白的 表達 影響尚不明確。本研究中，不同濃度葡萄糖飼喂麗蚜小蜂 2 h 后，糖轉(zhuǎn)運蛋白表達量均升高，顯著高于對照組，該糖轉(zhuǎn)運蛋白 EfST1 基因?qū)ζ咸烟欠盅a充反應(yīng)敏感，且該種誘導(dǎo)反應(yīng)至少能持續(xù) 2 d，這種短期誘導(dǎo)響應(yīng)與褐飛虱取食 2 h 后， Nlst16 基因被明顯誘導(dǎo)表達的結(jié)果一致 10，由此推測該基因可能與麗蚜小蜂體內(nèi)糖吸收和轉(zhuǎn)運有關(guān)。 糖轉(zhuǎn)運基因是一個基因家族，例如褐飛虱 推斷 有 18 個糖轉(zhuǎn)運基因（ NlST1-18），或在其中腸中高表達，或在胚胎時期高表達，利用爪蟾卵母細胞表達研究發(fā)現(xiàn)NlST6 與 NlST1 基因 作用方式 類似，都是介導(dǎo)褐飛虱從外界吸取糖分的葡萄糖轉(zhuǎn)運基因 20；而 家蠶 糖轉(zhuǎn)運BmST3 基因的表達具有組織特異性，在馬氏管中大量表達，推測其可能在馬氏管細胞膜內(nèi)外物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運中發(fā)揮作用 19。而麗蚜小蜂中的糖轉(zhuǎn)運基因的數(shù)目及在糖轉(zhuǎn)運中的關(guān)鍵基因尚不明確。 利用基因芯片數(shù)據(jù)研究果蠅 Drosophila 糖轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白基因 CG1208，發(fā)現(xiàn)在果蠅組織中該基因表達與碳水化合物營養(yǎng)密切相關(guān)，在碳饑餓時表達增加，碳過量時則又減少 21；這與本研究中麗蚜小 蜂 10%濃度處理 與其他 濃度 處理組差異不顯 著 的結(jié)果不一致 ， 可能與供試不同昆蟲的種類差異、生理狀態(tài)等不同有關(guān)，具體原因有待于進一步研究。 另外 ，該糖轉(zhuǎn)運蛋白的表達量升高與昆蟲的壽命延長及產(chǎn)卵量升高的關(guān)系、被誘導(dǎo)高表達的內(nèi)在機制等問題尚需進一步研究。另外，鑒于麗蚜小蜂體內(nèi)糖代謝通路相關(guān)基因的相互作用，我們還需通過抑制糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達水平（如 RNA 干擾等），從而明確麗蚜小蜂體內(nèi)糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的功能。 參 考 文 獻 1 Burger J, Hemerik L, Lenteren J C, et al. Reproduction now or later: optimal host-handling strategies in the whitefly parasitoid Encarsia formosaJ. Oikos, 2004, 106(1): 117-130. 2 王偉 , 劉萬學(xué) , 程立生 , 等 . 取食不同糖分對卵育型寄生蜂潛蠅姬小蜂雌蜂壽命和卵子發(fā)生的影響 J. 昆蟲學(xué)報 , 2012, 55(8): 964-970. 3 Williams III L, Deschodt P, Pointurier O, et al. Sugar concentration and timing of feeding characteristics and survival of a parasitic waspJ. Journal of Insect Physiology, 2015, 79(1): 10-18. 4 Hirose Y, Mitsunaga T, Yano E, et al. Effects of sugars on the longevity of adult females of Eretmocerus eremicus and Encarsia formosa (Hymenoptera: Aphelinidae), parasitoids of Bemisia tabaci and Trialeurodes vaporariorum (Hemiptera: Alye