34(2)247-253 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào) Chinese Journal of Biological Control 2018 年 4 月 收稿日期： 2017-11-20 基金項(xiàng)目： 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（ 2017YFD0200400）；國(guó)家現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（ CARS-25）；國(guó)家自然科學(xué)基金（ 31572014）；農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金 作者簡(jiǎn)介： 劉貽聰，碩士研究生， E-mail： yicongliu0829163.com； *通信作者，研究員， E-mail： wangshaolicaas.cn。 DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2018.02.011 麗蚜小蜂糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因克隆及其誘導(dǎo)表達(dá) 劉貽聰，張友軍，吳青君，謝 文，王少麗 * （中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所 ， 北京 100081） 摘要： 麗蚜小蜂 Encarsia formosa Gahan是粉虱類害蟲的重要寄生性天敵昆蟲，補(bǔ)充糖分等營(yíng)養(yǎng)可以延長(zhǎng)麗蚜小蜂壽命及增加其產(chǎn)卵量，但對(duì)其糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白基因及其糖誘導(dǎo)表達(dá)尚不清楚。本研究克隆獲得麗蚜小蜂的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 EfST1基因，與其他寄生蜂的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因序列同源性達(dá) 65%以上；進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)熒光定量 qPCR 技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，飼喂不同濃度的葡萄糖溶液均可顯著提高 EfST1 基因的表達(dá)量，且飼喂不同時(shí)間段（ 2 48 h）后，麗蚜小蜂 EfST1基因表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組， 2 h和 48 h處理組間差異不顯著。綜上， EfST1 基因可能與糖分補(bǔ)充及其轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)，該基因誘導(dǎo)表達(dá)受糖分濃度影響小。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究寄生蜂生物防治過(guò)程中補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)及其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 關(guān) 鍵 詞 ： 麗蚜小蜂； 煙 粉虱； CODEHOP；糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因；表達(dá)分析 中圖分類號(hào) ： S476.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1005-9261(2018)02-0247-07 Cloning and Induced Expression of Sugar Transporter Gene in Parasitoid, Encarsia formosa Gahan LIU Yicong, ZHANG Youjun, WU Qingjun, XIE Wen, WANG Shaoli* (Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China) Abstract: Encarsia formosa Gahan is a kind of endoparasitoid world widely used for control of pest whiteflies. Sugar supplement prolong longevity and/or increase their egg production; however, the sugar transporter gene and the induced expression in E. formosa was unclear. In this present study, the sugar transporter gene named EfST1 was cloned; sequence alignment and phylogenetic analysis revealed that EfST1 shared more than 65% homology with other parasitoids. Real-time PCR showed that EfST1 was significantly expressed by feeding different concentrations of glucose. After feeding sugar for different periods (2 48 h) on 10% glucose, EfST1 gene expression was found to be increased compared to the water control. Besides, there were no significant differences between the 2 h and 48 h feeding treatments. In conclusion, the EfST1 gene was probably related to sugar supplement and transportation; and the gene expression induced by different sugar concentrations was not greatly fluctuated. The results will provide a basis for studying the nutrition supplement and transportation mechanism during the biological control of parasitoids. Key words: Encarsia formosa; Bemisa tabaci; CODEHOP; sugar transporter gene; expression analysis 麗蚜小蜂 Encarsia formosa Gahan 是粉虱類害蟲的重要寄生性天敵昆蟲，麗蚜小蜂除了可以取食煙粉虱 Bemisa tabaci 若蟲外，還能以煙粉虱分泌的蜜露及花蜜作為食物來(lái)源。 2004 年，就有報(bào)道稱粉虱分泌的蜜露可以延長(zhǎng)麗蚜小蜂的壽命并促進(jìn)卵子發(fā)育 1。研究表明，寄生蜂補(bǔ)充取食糖分之后其壽命及對(duì)靶標(biāo)生物的寄生率等生物學(xué)特性也有提升 2， Williams 等 3測(cè)定了不同濃度和不同時(shí)間飼喂蔗糖后橄欖果蠅248 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 34 卷 Bactrocera oleae 的寄生蜂 Psyttalia lounsburyi 壽命、糖分?jǐn)z 入量和能量攝取，發(fā)現(xiàn)蔗糖濃度和喂飼時(shí)間對(duì)橄欖果蠅的寄生蜂的壽命有顯著影響，糖分?jǐn)z取量和能量攝取均可以顯著增加。粉虱類害蟲的另一個(gè)寄生蜂 槳角蚜小蜂 Eretmocerus eremicus，麗蚜小蜂和海氏槳角蚜小蜂 Er. hayati Zolnerowich Rose 也可以利用糖類來(lái)延長(zhǎng)壽命和增加生殖率 4,5。 糖分等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入昆蟲體內(nèi)后，通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)再被吸收利用。已經(jīng)證明，刺吸式口器昆蟲煙粉虱 Bemisia tabaci（ Gennadius） 以含有高濃度蔗糖的植株韌皮部汁液為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，主要通過(guò)糖轉(zhuǎn) 運(yùn)蛋白使葡萄糖從腸道內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞 6。褐飛虱 Nilaparvata lugens（ Stål） 體內(nèi)糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因 Nlst6 被干擾后，昆蟲產(chǎn)卵前期顯著性延長(zhǎng)，卵期顯著縮短，卵數(shù)量減少，蟲體變小，脂肪體和卵巢的蛋白質(zhì)含量和卵黃原蛋白基因表達(dá)量的減少，推測(cè)該 Nlst6 基因在褐飛虱生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)卵等方面具有重要作用 7。糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不僅在糖的運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程中起作用，在家蠶 Bombyx mori 中，發(fā)現(xiàn)它們還可作為家蠶核型多角體病毒 BmNPV 感染時(shí)的受體，因?yàn)樘寝D(zhuǎn)運(yùn)蛋白只在易受感染的種群中被調(diào)節(jié) 8。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，豌豆蚜 Acyrthosiphon pisum（ Harris） 基因組中有 19 個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因，目前僅發(fā)現(xiàn) ApST3 和 ApST4 基因承擔(dān)著葡萄糖和果糖的運(yùn)輸 9；而褐飛虱種群中糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的 Nlst16 基因和 Nlst1 基因均在褐飛虱中腸中高表達(dá)，但 Nlst16 基因在褐飛虱取食 2 h 后被誘導(dǎo)表達(dá)升高，但 Nlst1 基因并未受到害蟲取食的誘導(dǎo)而進(jìn)行表達(dá) 10，說(shuō)明生物體內(nèi)有其特定的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因承擔(dān)著糖分的吸收和運(yùn)轉(zhuǎn)。麗蚜小蜂種群繁育過(guò)程中需補(bǔ)充糖分提升其種群擴(kuò)繁效率，但截止目前，尚無(wú)麗蚜小蜂糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因及糖分?jǐn)z入后的表達(dá)等 報(bào)道，限制了對(duì)麗蚜小蜂糖轉(zhuǎn)運(yùn)分子機(jī)理的深入研究，因此克隆麗蚜小蜂糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因序列以及明確其在麗蚜小蜂體內(nèi)的表達(dá)就成為重要基礎(chǔ)。 本研究首先采用 CODEHOP（ Consensus-Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primers）在線軟件 11，在線程序化設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，同源克隆麗蚜小蜂糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因；然后利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)研究該基因在不同濃度糖分及飼喂不同時(shí)間后在麗蚜小蜂成蜂體內(nèi)的表達(dá)譜，研究結(jié)果將為進(jìn)一步明確麗蚜小蜂對(duì)糖分吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制提供堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。 1 材料 與方法 1.1 供試麗蚜小蜂 麗 蚜小蜂蛹由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，在人工氣候箱內(nèi)煙粉虱若蟲上繁育，煙粉虱若蟲飼養(yǎng)在一品紅 Euphorbia pulcherrima 上，培養(yǎng)條件為溫度（ 26± 1） 、 相對(duì)濕度 60% 80%、 光周期 16L:8D。 1.2 軟件與試劑 試驗(yàn)采用在線 CODEHOP（ http:/blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.html/）和 Blockmaker 軟件 （ Fred Hutchinson Cancer Research Center， USA） 。 感受態(tài)細(xì)胞（ Trans1-T1）和 T1 克隆載體（ pEASY-T1）均購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司。 RNA 提取試劑盒 TRIzol 購(gòu)自 Invitrogen 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScript II 和 LA Taq 聚合酶購(gòu)自于北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司（ TaKaRa）； PCR 產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司；熒光定量 PCR 試劑盒為天根生化科技 （ 北京 ） 有限公司生產(chǎn)的熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版 ； DNA Marker 購(gòu)自于北京天根生化生物科技有限公司；葡萄糖購(gòu)自于北京化工廠。 引物合成和序列測(cè)定委托北京擎科生物技術(shù)有限公 司進(jìn)行。 1.3 簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì) 利用 CODEHOP（ Consensus-Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primers）軟件設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。 以麗蠅蛹集金小蜂 Nasonia vitripennis（ Accession No: XP_008203106）為遞交序列，再?gòu)?NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中選取 3 個(gè)代表性的昆蟲糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因序列作為引物設(shè)計(jì)的模板，它們分別是短管赤眼蜂 Trichogramma pretiosum Riley（ Accession No: XP_014233934）、普 通麥莖蜂 Cephus cinctus（ Accession No: XP_015604651）和傳粉榕小蜂 Ceratosolen solmsi marchali（ Accession No: XP_011495920）。以 blockmaker12對(duì)這些序列進(jìn)行塊狀比對(duì)，找出 14 塊無(wú)間隙高度保守的氨基酸序列，最后將比對(duì)結(jié)果遞交到 CodeHop 服務(wù)器進(jìn)行運(yùn)算 13，檢索出幾條昆蟲糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的簡(jiǎn)并引物。檢索主要設(shè)定參數(shù)為 最大核心簡(jiǎn)并度 （ Maximum core degeneracy） ：128；目標(biāo)夾板區(qū)溫度 （ Target clamp temperature） ： 60.0 ，密碼子使用表 （ Codon usage table） : Apis mellifera。依據(jù)簡(jiǎn)并引物簡(jiǎn)并度盡可能小、 Tm 值盡可能高、上下游引物之距離盡可能大等原則選擇引物。 第 2 期 劉貽聰 等 ： 麗蚜小蜂糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因克隆及其誘導(dǎo)表達(dá) 249 1.4 麗蚜小蜂糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因克隆 用 TRIzol 法提取麗蚜小蜂總 RNA，并以 Oligo dT 為引物反轉(zhuǎn)錄 cDNA，以上述設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。隨后 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)選用 Touch-down PCR 法進(jìn)行：首先在 95 條件下預(yù)變性 5 min；然后 94 變性 30 s，從 65 下降到 50 退火 30 s，每個(gè)循環(huán)降低 1 ， 72 延伸 1 min，共 5 個(gè)循環(huán)；隨后再94 變性 30 s， 55 退火 1 min， 72 延伸 1 min，共進(jìn)行 25 個(gè)循環(huán)；最后在 72 延伸 10 min。 PCR 產(chǎn)物在 1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)?；厥漳康臈l帶后與 pEASY-T1 載體連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞， 37 條件下培養(yǎng)過(guò)夜，挑選白斑。經(jīng) M13 通用引物進(jìn)行菌液 PCR 擴(kuò)增，鑒定陽(yáng)性克隆。取陽(yáng)性克隆送交北京擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，采用通用引物 M13 進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果輸 GenBank 進(jìn)行blastx 同源性比較。 1.5 麗蚜小蜂 EfST1 基因 系統(tǒng)進(jìn)化分析 利用 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)已有的昆蟲糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的氨基酸序列：黃翅菜葉蜂 Athalia rosae（ XP_012266479.1）；普通麥莖蜂（ XP_015604651）；紅火蟻 Solenopsis invicta（ XP_011169177.1）；中華蜜蜂 Apis cerana（ XP_016910856.1） ；黃蜂 （ XP_015178798.1） ；蘋果實(shí)蠅繭蜂 Diachasma alloeum（ XP_015108434.1） ；傳粉 榕小蜂 （ XP_011495920.1） ；麗蠅蛹集金小蜂 N. vitripennis（ XP_008203106.1） ；短管赤眼蜂 （ XP_014233934.1） ， 采用 Clustalw 2.0 軟件比較不同物種的 ST 氨基酸序列，并計(jì)算它們之間序列的相似性， 采用 MEGA 6.0 軟件的鄰接法（ Neighbour-Joining）構(gòu)建了麗蚜小蜂 EfST1 序列與其他相近昆蟲 ST 之間的系統(tǒng)進(jìn)化樹。 1.6 麗蚜小蜂 EfST1 基因的誘導(dǎo)表達(dá) 采集初羽化（ 24 h）的麗蚜小蜂雌蜂進(jìn)行葡萄糖飼喂處理。第一，不同時(shí)間處理組，飼喂 10%葡萄糖2、 12、 24、 48 h； 第二，不同 濃度 處理組，小蜂分別飼喂 2 h，飼喂?jié)舛纫来螢?1%、 5%、 10%、 15%、 20%；清水處理作為對(duì)照 。 麗蚜小蜂 EfST1 基因的 mRNA 表達(dá)采用熒光定量 PCR 反應(yīng)測(cè)定，該 PCR 反應(yīng)中所采用引物序列如下：正向： 5-CTTCATCTTCTGCGTGGCTA-3，反向： 5-TCTGTTCGTTCATGCGACGTT-3。PCR 反應(yīng)體系為 5.0 L qPCR Mix， 5 mol/L 正反向引物各 0.5 L， 2.0 L cDNA 模板，用超純水補(bǔ)到 10 L。實(shí) 時(shí)熒光定量 PCR 程序如下： 95 預(yù)變性 3 min； 95 20 s， 60 30 s， 72 35 s， 40 個(gè)循環(huán)。 選擇麗蚜小蜂的 18S rRNA 作為參照基因，引物序列為：正向： 5-ATTCCATGCACACAGTATT CAGG-3，反向： 5-CGGCCCAACTAATATCCCGTC-3。 PCR 反應(yīng)后進(jìn)行熔解曲線分析，以排除非特異性 PCR 產(chǎn)物的污染。每個(gè)試驗(yàn)至少進(jìn)行 4 個(gè)生物學(xué)重復(fù)， 4 個(gè)技術(shù)性重復(fù)。對(duì)所克隆的麗蚜小蜂糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的 mRNA 熒光定量表達(dá)結(jié)果用 ABI 7500 SDS v 1.4 軟件（ Applied Biosystems， USA），采用 2 Ct方法進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄和分析。 2 結(jié)果與分析 2.1 簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)及其 PCR 擴(kuò)增 根據(jù) CODEHOP 程序運(yùn)行結(jié)果，分別選取 3 條上游引物（ ST1-F、 ST2-F 和 ST3-F）和 3 條下游引物（ ST1-R、 ST2-R 和 ST3-R）進(jìn)行配對(duì)及 PCR擴(kuò)增，最后篩選出一對(duì)能夠成功擴(kuò)增出預(yù)期基因片段的簡(jiǎn)并引物。上游引物： 5-TGAGTCCACTGGTT GG ATTCttyg tna cnc c-3；下游引物： 5-AATACA GA CTATAACAAACATGTGCCatyc arc arm a-3。 簡(jiǎn)并引物 PCR 擴(kuò)增后，得到一條高度特異性的PCR 產(chǎn)物，產(chǎn)物大小為 824 bp，與預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致（圖 1）。 2.2 EfST1 基因的 序列 比對(duì)及進(jìn)化樹分析 PCR 產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行 blast 同源性比較， 800 bpM 1 2 3M： DNA Marker ； 12：麗蚜小蜂 RTPCR 擴(kuò)增 RTPCR amplification of E. formosa； 3：空白對(duì)照 Negative control 圖 1 簡(jiǎn)并引物 RT-PCR 擴(kuò)增麗蚜小蜂的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 Fig. 1 Sugar transporter gene in E. formosa by RT-PCR using degenerate primers 250 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 34 卷 發(fā)現(xiàn)所 克隆的麗蚜小蜂 cDNA 序列所編碼的氨基酸序列與 GenBank 上其他糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因具有高度相似性 ，特別是與其他寄生性天敵昆蟲比較結(jié)果表明該基因存在膜翅目昆蟲糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的保守序列 （圖 2），證明 所克隆的 cDNA 序列為麗蚜小蜂糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)序列，命名為 EfST1 基因。 通過(guò)與其 他昆蟲之間構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)不同昆蟲糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因在進(jìn)化上保守性強(qiáng)，相比其他物種而言，麗蚜小蜂 EfST1 序列在系統(tǒng)進(jìn)化上與同屬于膜翅目的短管赤眼蜂的遺傳距離更近，且同源性 高達(dá) 84%（圖 3） 。 C. cinctus (XP_015604651) FFVTPILGSVSDRCRLKQGRRRPFILLLAVGVLIGLILVPNGEGMGYAFGDVPSVTNVTV C. solmsi marchali (XP_011495920.1) FFVTPILGSVSDRCRLKQGRRRPFILLLAIGVLVGLILVPNGESIGYAFGDTS-SNFTM N. vitripennis (XP_008203106.1) FFVTPILGSVSDRCRLKQGRRRPFILLLAIGVLMGLLLVPNGESMGYAFGDTR-MNFTA T. pretiosum (XP_014233934.1) FFVTPLLGSLSDRCRLKQGRRRPFIALLAIGVLMGLILVPNGEGMGYAFGDIQG NYTA E. formosa (EfST1) -VLMGLILVPNGEDLGYSFGDTKS-NFSA C. cinctus (XP_015604651) PHGHRTTATSS-KDDAPMTSSVS-SHSWGIFFTILGTVLLDFDADACQS C. solmsi marchali (XP_011495920.1) GMLHRTTAKTM-GNDSLPPIPPS-SHSWGIIFTILGTVLLDFDADACQS N. vitripennis (XP_008203106.1) ALGHRISGKTA-HNETLPPPPPS-SHSWGIFFTILGTVLLDFDADACQS T. pretiosum (XP_014233934.1) SFIHRITGKTAKVI-SDNATMTTATTTIEPPLVQPSHSWGIFFTILGTVLLDFDADACQS E. formosa (EfST1) RFIHRTTGKATTVIPLNATVAPPPPS-THSWGIFFTILGTVLLDFDADACQS C. cinctus (XP_015604651) PARAYLLDVTVPEDHARGLSTFTIMAGLGGFMGYGLGGINWDATTIGVMLGGHLHATFTL C. solmsi marchali (XP_011495920.1) PARAYLLDVTLPEDHARGLSTFTIMAGLGGFMGYGLGGINWDATSIGIALGGHLHATFTL N. vitripennis (XP_008203106.1) PARAYLLDVTIPEDHAKGLSTFTIMAGLGGFMGYGLGGINWDATAIGVALGGHLHATFTL T. pretiosum (XP_014233934.1) PARAYLLDVTIPEDHARGLSTFTIMAGLGGFMGYGLGGINWDATRIGVALGGHLHAVFTL E. formosa (EfST1) PARAYLLDVTLPEDHARGLSTFTIMAGLGGFMGYGLGGINWDATAIGVALGGHLHATFTL C. cinctus (XP_015604651) ITIIFVICVALTITSFKEIPLEVLERDQYQQLQNQKIAEEQDKDDEREKIANDECTSYGA C. solmsi marchali (XP_011495920.1) ITFIFIICVASTLTSFKEIPLDFIESNEYKQQLQQKLENEQ-RDNEQEKITEEDSITYET N. vitripennis (XP_008203106.1) ITIIFIICVASTLTSFKEIPLDFLESDDCKEQLQRKLEEER-KQNEAEKMIPDESATYGT T. pretiosum (XP_014233934.1) ITFIFIFCVASTLTSFKEIPLVFLESEECQQQLREMAEDKR-RQSESGKIAAEESVTYGT E. formosa (EfST1) ITIIFIFCVASTLTSFKEIPLDFLESEECQKQLQIKIEQER-RMNEQMKPAADGSGTYGT C. cinctus (XP_015604651) LGHESETN-IGKTDDFVLKPLPVEEPVKR-LGAVPMVPDVPAPP-D C. solmsi marchali (XP_011495920.1) GGNESEINSIDNTQEFQMKELS-NEPCK-LGTAPIFPDVQSSV-N N. vitripennis (XP_008203106.1) IGNEQEVDNDVNPEEIPMKPIEQPPPAPRKPGTVPMIPDVQPAP-R T. pretiosum (XP_014233934.1) LGNEQEME-NGEELPMKELP-PQRK-AGAVPMIPDVKSPPPPRPKPPPPAAAGEAS E. formosa (EfST1) LGNDSEIE-AEDIPMKKMP-EKAGVVPIVPEVPLAP- C. cinctus (XP_015604651) CEGSYVNYGFDENP-DANPRATLQEYLFSILYMPHSMRMVCLTNLFCWMAHVCYSLYFTD C. solmsi marchali (XP_011495920.1) LDSRIIESIDDAN-VDPKATIREYLLSILYMPHSMRMVCLTNLCCWMAHVCYSLYFTD N. vitripennis (XP_008203106.1) PADEYTHLGAPASESAPNPKATLQEYLYSILYMPHSMRMVCLTNLCCWMAHVCYSLYFTD T. pretiosum (XP_014233934.1) ADAAEAVILDSDDAAAANPKATLQEYLYSILYMPHSMRMVCLTNLCCWMAHVCYSLYFTD E. formosa (EfST1) -PTTTGEDPE-ANPKASLQEYLYSILYMPH- 注： 相同氨基酸用黑色陰影表示，保守氨基酸替換用灰色陰影表示。 Note: Identical amino acids are shaded in black, and conservative substitutions are shaded in grey. 圖 2 麗蚜小蜂 EfST1 基因與 GenBank 其他昆蟲 ST 基因的氨基酸序列比較 Fig. 2 Comparisons of deduced amino sequences of EfST1 gene in E. formosa and the ST genes in other insects from GenBank 2.3 麗蚜小蜂 EfST1 基因 的 表達(dá)分析 以分別取食不同濃度葡萄糖的麗蚜小蜂及取食 10%葡萄糖不同時(shí)間的麗蚜小蜂 cDNA 為模板，以 18S rRNA 為內(nèi)參基因，采用 qPCR 方法進(jìn)行麗蚜小蜂 EfST1 基因表達(dá)差異分析。發(fā)現(xiàn)飼喂不同濃度葡萄糖的麗蚜小蜂處理組，其 EfST1 基因的表達(dá)量均受到顯著誘導(dǎo)，高于對(duì)照組小蜂的 EfST1 基因表達(dá)量。飼喂 15%和 20%濃度的葡萄糖后，麗蚜小蜂 EfST1 基因的表達(dá)量明顯高于飼喂 1%、 5%和 10%的處理組，但在不同處理組間差異不顯著（圖 4a）。 同時(shí)發(fā)現(xiàn)，以不飼喂葡萄糖的麗蚜小蜂的表達(dá)量作為對(duì)照，飼喂 2、 12、 24、 48 h 葡萄糖后麗蚜小蜂糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 EfST1 基因的表達(dá)量均高于不飼喂葡萄糖的對(duì)照組，從飼喂 2 h 持續(xù)升高至 48 h，說(shuō)明糖分飼喂可誘導(dǎo)該糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，且該誘導(dǎo)作用至少可持續(xù) 2 d（圖 4b）。 第 2 期 劉貽聰 等 ： 麗蚜小蜂糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因克隆及其誘導(dǎo)表達(dá) 251 A t h a l i a r o s a e ( X P _ 0 1 2 2 6 6 4 7 9 . 1 )C e p h u s c i n c t u s ( X P _ 0 1 5 6 0 4 6 5 1 . 1 )S o l e n o p s i s i n v i c t a ( X P _ 0 1 1 1 6 9 1 7 7 . 1 )A p i s c e r a n a ( X P _ 0 1 6 9 1 0 8 5 6 . 1 )P o l i s t e s d o m i n u l a ( X P _ 0 1 5 1 7 8 7 9 8 . 1 )D i a c h a s m a a l l o e u m ( X P _ 0 1 5 1 0 8 4 3 4 . 1 )C e r a t o s o l e n s o l m s i m a r c h a l i ( X P _ 0 1 1 4 9 5 9 2 0 . 1 )N a s o n i a v i t r i p e n n i s ( X P _ 0 0 8 2 0 3 1 0 6 . 1 )T r i c h o g r a m m a p r e t i o s u m ( X P _ 0 1 4 2 3 3 9 3 4 . 1 )E n c a r s i a f o r m o s a ( E f S T 1 )0 . 0 58 46 11 0 06 14 27 27 1圖 3 麗蚜小蜂 EfST1 基因與其他昆蟲的系統(tǒng) 進(jìn)化分析 Fig. 3 Phylogenetic analysis based on EfST1 gene from E. formosa with other insect STs 2 h 1 2 h 2 4 h 4 8 h0 h0 . 00 . 51 . 01 . 52 . 0a baa bab相對(duì)表達(dá)量Relativegeneexpression飼 喂 葡 萄 糖 時(shí) 間 F e e d i n g p e r i o d飼 喂 葡 萄 糖 濃 度 G l u c o s e c o n c e n t r a t i o n1 % 5 % 1 0 % 1 5 % 2 0 %清 水 C K0 . 00 . 51 . 01 . 52 . 02 . 5aa ba baabb相對(duì)表達(dá)量Relativegeneexpressiona注：圖中數(shù)據(jù)為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤；不同小寫字母表示經(jīng) Tukeys HSD 法檢驗(yàn)在 0.05 水平差異顯著。 Note: Data are mean± SE. Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level by Tukeys HSD test. 圖 4 飼喂葡萄糖不同濃度 （ a） 及不同時(shí)間 （ b） 后麗蚜小蜂 EfST1 基因的相對(duì)表達(dá)量 Fig. 4 Relative expression of EfST1 gene in E. formosa after feeding glucose in different concentrations (a) and different periods (b) 3 討論 本文利用 CODEHOP 軟件設(shè)計(jì)麗蚜小蜂的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的擴(kuò)增引物， 其 3和 5端分別為核心簡(jiǎn)并區(qū)和非簡(jiǎn)并性?shī)A板結(jié)構(gòu)，這樣設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)既減少了引物的簡(jiǎn)并度，又提高了退火溫度，保障了最終 RT-PCR擴(kuò)增的成功率及擴(kuò)增 產(chǎn)物的特異性 14。因此通過(guò) CODEHOP 設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，可 通過(guò) PCR 快速準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增出靶標(biāo)物種中預(yù)期的同源基因， 這在 苛求 芽 胞 桿菌 Bacillus fastidious 尿酸酶 以及其他多個(gè)未知基因克隆中也成功應(yīng)用過(guò) 15,16，因此在 生物學(xué)信息較少、基因同源性低的其他物種未知基因的克隆和獲取 中具有明顯優(yōu)勢(shì)，并且會(huì)繼續(xù)發(fā)揮作用 17。 本研究克隆獲得了一個(gè) 824 bp 的麗蚜小蜂糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因片段，與其他已報(bào)道的寄生蜂的序列相似性在 67%以上，而家蠶中糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 BmST5 基因編碼區(qū)全長(zhǎng)序列為 1527 bp，該基因與其他害蟲的 同源蛋白序列相似性 也 在 50%以上 18， 與此相比， 麗蚜小蜂 EfST1 基因功能區(qū)序列與其他寄生蜂 序列 相似性 和 其他昆蟲之間的相似性差異不大 。 家蠶糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 BmST3 克隆后，依據(jù) 家蠶基因組精細(xì)圖譜被定位在 27號(hào)染 色體上 19；而麗蚜小蜂該基因的 全長(zhǎng)序列 有待于進(jìn)一步研究 獲得 ， 將 有助于解析基因結(jié)構(gòu)和典型結(jié)構(gòu)域（例如 Sugar_tr、其他跨膜結(jié)構(gòu)域等） ，為 研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)。 研究發(fā)現(xiàn)，田間給寄生蜂補(bǔ)充糖分可以提高寄生蜂的寄生率及其對(duì)靶標(biāo)害蟲的生物防治效能。以往研 252 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 34 卷 究發(fā)現(xiàn)，采用 5%、 10%和 20%的不同濃度糖分飼喂后，海氏槳角蚜小蜂的壽命高于 不飼喂的 對(duì)照組，飼喂 10%葡萄糖后小蜂壽命高于對(duì)照 5.9 倍，據(jù)此認(rèn)為 10%是寄生蜂室內(nèi)飼養(yǎng)時(shí)糖分補(bǔ)充時(shí)的適宜濃度 5。更高濃度的糖分補(bǔ)充時(shí)，寄生蜂存活率升高，但其取食時(shí)間也會(huì)延長(zhǎng) 3。綜合考慮糖分濃度和取食糖分的時(shí)間，發(fā)現(xiàn)橄欖果蠅的寄生蜂 P. lounsburyi 羽化后 2 3 d 補(bǔ)充糖分，小蜂則會(huì)獲得更多的能量 3，但其取食后對(duì)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的 表達(dá) 影響尚不明確。本研究中，不同濃度葡萄糖飼喂麗蚜小蜂 2 h 后，糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)量均升高，顯著高于對(duì)照組，該糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 EfST1 基因?qū)ζ咸烟欠盅a(bǔ)充反應(yīng)敏感，且該種誘導(dǎo)反應(yīng)至少能持續(xù) 2 d，這種短期誘導(dǎo)響應(yīng)與褐飛虱取食 2 h 后， Nlst16 基因被明顯誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果一致 10，由此推測(cè)該基因可能與麗蚜小蜂體內(nèi)糖吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。 糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因是一個(gè)基因家族，例如褐飛虱 推斷 有 18 個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因（ NlST1-18），或在其中腸中高表達(dá)，或在胚胎時(shí)期高表達(dá)，利用爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)NlST6 與 NlST1 基因 作用方式 類似，都是介導(dǎo)褐飛虱從外界吸取糖分的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因 20；而 家蠶 糖轉(zhuǎn)運(yùn)BmST3 基因的表達(dá)具有組織特異性，在馬氏管中大量表達(dá)，推測(cè)其可能在馬氏管細(xì)胞膜內(nèi)外物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮作用 19。而麗蚜小蜂中的糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因的數(shù)目及在糖轉(zhuǎn)運(yùn)中的關(guān)鍵基因尚不明確。 利用基因芯片數(shù)據(jù)研究果蠅 Drosophila 糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白基因 CG1208，發(fā)現(xiàn)在果蠅組織中該基因表達(dá)與碳水化合物營(yíng)養(yǎng)密切相關(guān)，在碳饑餓時(shí)表達(dá)增加，碳過(guò)量時(shí)則又減少 21；這與本研究中麗蚜小 蜂 10%濃度處理 與其他 濃度 處理組差異不顯 著 的結(jié)果不一致 ， 可能與供試不同昆蟲的種類差異、生理狀態(tài)等不同有關(guān)，具體原因有待于進(jìn)一步研究。 另外 ，該糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)量升高與昆蟲的壽命延長(zhǎng)及產(chǎn)卵量升高的關(guān)系、被誘導(dǎo)高表達(dá)的內(nèi)在機(jī)制等問(wèn)題尚需進(jìn)一步研究。另外，鑒于麗蚜小蜂體內(nèi)糖代謝通路相關(guān)基因的相互作用，我們還需通過(guò)抑制糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)水平（如 RNA 干擾等），從而明確麗蚜小蜂體內(nèi)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的功能。 參 考 文 獻(xiàn) 1 Burger J, Hemerik L, Lenteren J C, et al. Reproduction now or later: optimal host-handling strategies in the whitefly parasitoid Encarsia formosaJ. Oikos, 2004, 106(1): 117-130. 2 王偉 , 劉萬(wàn)學(xué) , 程立生 , 等 . 取食不同糖分對(duì)卵育型寄生蜂潛蠅姬小蜂雌蜂壽命和卵子發(fā)生的影響 J. 昆蟲學(xué)報(bào) , 2012, 55(8): 964-970. 3 Williams III L, Deschodt P, Pointurier O, et al. Sugar concentration and timing of feeding characteristics and survival of a parasitic waspJ. Journal of Insect Physiology, 2015, 79(1): 10-18. 4 Hirose Y, Mitsunaga T, Yano E, et al. Effects of sugars on the longevity of adult females of Eretmocerus eremicus and Encarsia formosa (Hymenoptera: Aphelinidae), parasitoids of Bemisia tabaci and Trialeurodes vaporariorum (Hemiptera: Alye