34(5)738-745 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào) Chinese Journal of Biological Control 2018 年 10 月 收稿日期： 2018-02-26 基金項(xiàng)目：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金（ 2013YJ10） ；山西省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（ 201703D221010-2） 作者簡(jiǎn)介： 李磊，碩士研究生， E-mails： qstlilei126.com； *通信作者，博士，副教授， E-mails： sxndwmq1973163.com。 DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2018.05.0013 生防菌解淀粉芽胞桿菌 Ht-q6可濕性粉劑的研制及 對(duì)番茄病害的田間防效 李 磊，許 敏，王美琴*（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，太谷 030801） 摘要： 為了研制一種高效、安全及無(wú)污染的生防菌劑，本文以核桃內(nèi)生生防菌解淀粉芽胞桿菌 Ht-q6 為材料，通過(guò)室內(nèi)篩選和田間試驗(yàn)，確定了生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑的最佳助劑配方及對(duì)番茄葉霉病和灰霉病的田間防效。結(jié)果表明，可濕性粉劑的最佳配方為載體硅藻土（ 85%） 、潤(rùn)濕劑十二烷基苯磺酸鈉（ 6%） 、分散劑木質(zhì)素磺酸鈉（ 6%） 、穩(wěn)定劑 KH2PO4（ 1.0%） 、紫外保護(hù)劑抗壞血酸（ 1.0%） 。該粉劑芽胞含量 2.28 1010cfu/g、雜菌率 0.5%、 pH 5.8、細(xì)度 93.5%、干燥減量 2.5%、潤(rùn)濕時(shí)間 45 s、懸浮率 85.6%，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)值，質(zhì)量合格。同時(shí)采用噴霧法測(cè)定了不同濃度菌劑對(duì)大棚中番茄病害的防治效果，結(jié)果表明，稀釋 200 （制劑用量 225 g/667m2）的可濕性粉劑對(duì)番茄灰霉病和葉霉病的防效分別為 77.1%和 74.3%，與對(duì)照藥劑 75%百菌清的防效相比，葉霉病防效差異不顯著而灰霉病防效差異顯著。該菌劑的研制在生產(chǎn)實(shí)踐中為番茄病害提供一條生防途徑。 關(guān) 鍵 詞： 解淀粉芽胞桿菌；可濕性粉劑；番茄病害；田間防效 中圖分類(lèi)號(hào)： S476 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1005-9261(2018)05-0738-08 Preparation of Biocontrol Agent Bacillus amyloliquefaciens Ht-q6 Wettable Powder and the Field Control against Tomato Diseases LI Lei, XU Min, WANG Meiqin*(College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China) Abstract: In order to develop biocontrol agent with high efficiency, safety and non-pollution, with the endophytic strain Ht-q6 from walnut as material, the optimal formula of biocontrol bacterium Ht-q6 wettable powder (WP) were screened and its field efficacy on tomato leaf mold and gray mold were determined. The results showed that the best formulation of WP was diatomite (85%) as filler, DBS (6%) as wetting agent, sodium lignosulphonate (6%) as dispersing agent, KH2PO4(1.0%) as stabilizer and acide ascorbique (1.0%) as UV protective. The spore content of the powder was 2.28 1010cfu/g, the rate of bacteria was 0.5%, the pH value was 5.8, the fineness was 93.5%, the drying loss was 2.5%, wetting time was 45 s, and the suspension rate was 85.6%, which was in line with national standards and quality standards. Field trials with different concentrations of fungicides against tomato gray mold and leaf mold diseases demonstrated that the control effects of WP with the dilution of 200 (dosage: 225 g/667 m2) on both diseases were remarkable, with the efficacies of 77.1% and 74.3%, respectively. The control effect of WP with the dilution of 200 on leaf mold is not significantly different from the control, while that on gray mold is significantly different. The preparation of this bacterium is an effective way to prevent tomato disease in practice. Key words: Bacillus amyloliquefaciens; wettable powder; tomato diseases; field efficiency 第 5 期 李磊等：生防菌解淀粉芽胞桿菌 Ht-q6 可濕性粉劑的研制及對(duì)番茄病害的田間防效 739 近年來(lái)設(shè)施番茄種植給人們的生活帶來(lái)了極大的便利，但小環(huán)境氣候特點(diǎn)非常有利于病害的發(fā)生，造成了果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量的下降，其中葉霉病和灰霉病是番茄上常見(jiàn)的 2 種病害，給番茄生產(chǎn)造成極大的影響1。使用化學(xué)藥劑是目前主要的防治手段，防效顯著，但造成的 3R（抗藥性、再猖獗和農(nóng)藥殘留）問(wèn)題已經(jīng)引起人們的高度重視，所以開(kāi)發(fā)研制新型生物菌劑來(lái)替換或減少化學(xué)農(nóng)藥的使用成為農(nóng)藥界研究的熱點(diǎn)2。植物內(nèi)生菌以其與環(huán)境相容性好、對(duì)人畜和天敵安全、容易在植物體內(nèi)定殖等優(yōu)點(diǎn)成為較好的生防菌資源。其中芽胞桿菌屬、假單孢菌屬、固氮菌屬、土壤桿菌屬及鏈霉菌屬等是目前國(guó)內(nèi)外研究具有良好防效的生防菌類(lèi)別3。尤其芽胞桿菌，因其多內(nèi)生芽胞、抗逆性強(qiáng)、繁殖快、易定殖、產(chǎn)生一些細(xì)菌素或毒素等特性，可用來(lái)防治多種植物病害4,5，其中枯草芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌、多粘類(lèi)芽胞桿菌等研究報(bào)道的較多6,7，主要集中在室內(nèi)菌株的篩選、抑菌機(jī)理、抑菌物質(zhì)的提取、分離鑒定以及田間小區(qū)試驗(yàn)等8-12。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)登記并商品化用于生產(chǎn)中的芽胞桿菌菌劑相對(duì)較少，美國(guó)有 3 株枯草芽胞桿菌和 1 株解淀粉芽胞桿菌，商品名分別為 Subtilex、 Kodiak、 Serenade 和 Bio Yield，應(yīng)用到生產(chǎn)中效果較好13,14。國(guó)內(nèi)對(duì)于芽胞桿菌也有廣泛的研究，現(xiàn)已登記的微生物殺菌劑劑型種類(lèi)繁多，有 80 億芽胞 /mL 地衣芽胞桿菌水劑（商品名為爽又多）， 10 億芽胞 /g 枯草芽胞桿菌可濕性粉劑（商品名為百抗）， 0.1 億芽胞 /g 多粘類(lèi)芽胞桿菌細(xì)粒劑（商品名為康地蕾得）等15?？蓾裥苑蹌┫啾扔诜蹌╊w粒，直徑更細(xì)、更易濕潤(rùn)、有效成分含量也較高；與水分散粒劑和緩釋劑相比，又具有低成本優(yōu)勢(shì)；較傳統(tǒng)顆粒劑相比，可防治土傳和葉部病害，范圍廣。在已登記微生物殺菌劑劑型中，可濕性粉劑占最大比例 82%， 6%水劑次之，可見(jiàn)可濕性粉劑的優(yōu)勢(shì)地位16。 本試驗(yàn)應(yīng)用的菌株 Ht-q6 是一株具有廣譜抑菌活性的核桃內(nèi)生細(xì)菌， 經(jīng)鑒定為解淀粉芽胞桿菌 Bacillus amyloliquefaciens，該菌株的專(zhuān)利號(hào)： 201410469787.6； 16S rDNA 序列 NCBI 登陸號(hào)： KM015259.1。已對(duì)其在植物體內(nèi)的定殖、抑菌效果及代謝產(chǎn)物活性成分等進(jìn)行了研究，證實(shí)了該菌株具有生防潛能17。本文通過(guò)對(duì)載體及助劑的懸浮率、濕潤(rùn)時(shí)間、芽胞含量等多因子的測(cè)定，確定了最佳配方，研制出了生防菌Ht-q6 可濕性粉劑，并測(cè)定了對(duì)番茄葉霉病與灰霉病的田間防效。 1 材料與方法 1.1 供試材料 供試菌株 Ht-q6 由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。固體 NA 培養(yǎng)基：牛肉浸膏 3 g，蛋白胨 5 g，瓊脂粉 15 g，葡萄糖 10 g，蒸餾水 1000 mL， pH 7.0 7.2；優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)液： 1%玉米粉， 0.5%牛肉浸膏，0.02% MgSO47H2O， 0.01% KCl， 0.2% NaH2PO42H2O， 0.4% Na2HPO42H2O， 100 mL 蒸餾水， pH 6.0 7.0。6 種載體：白炭黑，硅藻土，輕質(zhì)碳酸鈣，膨潤(rùn)土，高嶺土，滑石粉。 6 種分散劑：三聚磷酸鈉，木質(zhì)素磺酸鈉，羧甲基纖維素鈉（ CMC-Na），聚乙二醇（ PEG8000），達(dá)潤(rùn) DY6，達(dá)潤(rùn) D06。 4 種潤(rùn)濕劑：十二烷基苯磺酸鈉（ DBS），吐溫- 80，達(dá)潤(rùn) D317，達(dá)潤(rùn) DCM-82。 4 種穩(wěn)定劑：碳酸鈣，磷酸鉀，磷酸二氫鉀，羧甲基纖維素鈉（ CMC-Na）。 4 種保護(hù)劑：抗壞血酸，羧甲基纖維素（ CMC），糊精，熒光增白劑（ FWA）。儀器設(shè)備： SW-CJ-2FD 超凈工作臺(tái)（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）、 GI54DWS 高壓滅菌鍋（廈門(mén)致微儀器有限公司）、 ZWYR-211C 振蕩培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造有限公司）、 GR-240 熱空氣消毒箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）、 CF-180C 不銹鋼粉碎機(jī)（廣州晨雕機(jī)械設(shè)備有限公司）。 1.2 生防菌 Ht-q6 發(fā)酵液的制備 用接種環(huán)挑取保存的生防菌 Ht-q6，通過(guò)平板劃線(xiàn)將其接種于 NA 平板上進(jìn)行活化培養(yǎng)， 24 h 后將活化菌株接種到優(yōu)化的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液以 75 mL/250 mL 裝瓶，接種量 1%，置于搖床上， 30 、 180 r/min振蕩培養(yǎng) 48 h，得到的懸濁液即為發(fā)酵液。 1.3 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑質(zhì)量檢測(cè)方法 可濕性粉劑的各項(xiàng)指標(biāo)按照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)，其中濕潤(rùn)時(shí)間依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5451-2001（ 6）進(jìn)行；懸浮率測(cè)定步驟依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB/T14825-2006（ 4.4）進(jìn)行；細(xì)度測(cè)定步驟依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB/T16150-1995（ 2.2）進(jìn)行； pH 測(cè)定步驟依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB/T1601-1993（ 6）進(jìn)行；穩(wěn)定性測(cè)定步驟依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB/T19136-2003（ 2.2）進(jìn)行；干燥減量測(cè)定步驟依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB/T 30361-2013 進(jìn)行。 740 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 34 卷 雜菌率的測(cè)定：取待測(cè)樣品 10 g，加入 90 mL 無(wú)菌水的錐形瓶中搖勻溶解，即成 101稀釋液；再用移液槍吸取 1 mL 稀釋液加入裝有 9 mL 無(wú)菌水的試管中搖勻，即成 102稀釋液；以此方法連續(xù)稀釋?zhuān)瞥?04、 105、 106、 107系列梯度稀釋液，每平板取 100 L 均勻涂布，每個(gè)梯度 3 次重復(fù)，以無(wú)菌水為對(duì)照，于 25 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h，挑取平板上目標(biāo)菌菌落在 30 300 倍的稀釋梯度進(jìn)行計(jì)數(shù)，同時(shí)計(jì)算目標(biāo)菌以外雜菌數(shù)，雜菌率（ %）（雜菌數(shù) /解淀粉芽胞桿菌 Ht-q6 菌數(shù)） 100。 可濕性粉劑的芽胞存活率的測(cè)定依據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn) NY/T2293.1-2012（ 5.3），采用平板菌落計(jì)數(shù)法，具體計(jì)算方法參考劉盼西等18的方法。 載體最大吸附量測(cè)定：分別稱(chēng)取 6 份 100 g 載體，發(fā)酵液邊倒邊用玻璃棒攪拌，直至攪拌均勻、不凝結(jié)成塊，放置不會(huì)析出液體，記錄發(fā)酵液用量 v，并計(jì)算最大吸附量 H，即 H= v/0.1（ kg/L）。 1.4 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑載體及助劑的篩選 1.4.1 可濕性粉劑載體篩選及母粉制備 參考 1.3 濕潤(rùn)時(shí)間、懸浮率、芽胞含量測(cè)定方法，綜合考慮篩選出懸浮率高、濕潤(rùn)時(shí)間短、芽胞含量高、吸附量大、價(jià)格便宜的載體；并將發(fā)酵液與最佳載體充分混合，烘干粉碎，制成母粉。 1.4.2 助劑的篩選 參考 1.3 測(cè)定各種濕潤(rùn)劑、分散劑及穩(wěn)定劑（ 2%）添加到母粉中后濕潤(rùn)時(shí)間、懸浮率及對(duì)芽胞含量的影響。其中濕潤(rùn)時(shí)間越短，懸浮率越高的助劑對(duì)可濕性粉劑的性能較好，同時(shí)考慮對(duì)芽胞含量的影響，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并設(shè)不加助劑的母粉為對(duì)照，綜合考慮篩選出最佳潤(rùn)濕劑、分散劑和穩(wěn)定劑。 紫外保護(hù)劑：將抗壞血酸，羧甲基纖維素，糊精，熒光增白劑以 10%添加量與母粉混合、烘干、粉碎，在 254 nm 紫外燈下距離 40 cm 處照射 6、 12、 24 h 后平板涂布法計(jì)算芽胞存活率，并設(shè)不加保護(hù)劑的母粉為對(duì)照，同時(shí)考慮添加保護(hù)劑后對(duì)粉劑懸浮率及濕潤(rùn)時(shí)間的影響，綜合考慮篩選出最佳保護(hù)劑。 1.4.3 潤(rùn)濕劑和分散劑配比及用量篩選 將篩選出的最佳潤(rùn)濕劑和分散劑分別按 1:9、 2:8、 3:7、 4:6、 5:5、6:4、 7:3、 8:2、 9:1 的比例，以 10%的添加量與母粉混合、烘干和粉碎，篩選出潤(rùn)濕時(shí)間短、懸浮率高的配比。將篩選出的最佳潤(rùn)濕劑和分散劑以最佳配比混合后，再按照 2%、 4%、 6%、 8%、 10%、 12%、 14%、16%的添加量與母粉混合、烘干和粉碎，篩選出潤(rùn)濕時(shí)間短、懸浮率高的用量。 1.5 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑安全性評(píng)價(jià) 對(duì)番茄植株的安全性測(cè)定：以培育 50 d 的健康番茄植株（品種為鑫農(nóng) 1 號(hào)）為材料，挑選植株上部新葉與莖稈，用 75%酒精表面消毒后用無(wú)菌水沖洗干凈，自然晾干后，用滅菌的接種針針刺扎破番茄葉片與莖稈表皮，用移液槍取生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑 10 倍稀釋液 20 L 滴加在傷口處進(jìn)行接種，置于室溫下培育 3 d。根部用無(wú)菌水沖洗干凈后用滅菌刀片劃長(zhǎng) 2 mm 傷口，后浸于 10 倍制劑稀釋液中 1 min，再移栽至無(wú)菌土的育苗缽中常規(guī)管理 7 d。每個(gè)處理 5 株番茄植株， 3 次重復(fù)，以無(wú)菌水為對(duì)照。分別觀察植株莖、葉與根是否出現(xiàn)萎蔫、變色、腐爛、壞死和畸形等癥狀。 1.6 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑毒理學(xué)測(cè)定 依據(jù)國(guó)家安全標(biāo)準(zhǔn) GB/T 15670-1995，以初成年大鼠和家兔為材料，測(cè)試了生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑急性經(jīng)口毒性、急性經(jīng)皮毒性及急性皮膚刺激，檢測(cè)機(jī)構(gòu)：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院。 1.7 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑對(duì)番茄病害的田間防效試驗(yàn) 試驗(yàn)地選擇為山西晉中太谷縣水秀鄉(xiāng)里修村農(nóng)戶(hù)的番茄大棚，番茄品種為鑫農(nóng) 1 號(hào)，定植于 2016 年 12月 16 日。試驗(yàn)采用田間隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每小區(qū)面積為 10 m2，番茄 32 株。試驗(yàn)開(kāi)始于 2017 年 3 月 5 日，正處在番茄幼果期，病害發(fā)生初期。試驗(yàn)共設(shè) 5 個(gè)處理，其中菌株 Ht-q6 可濕性粉劑稀釋 200 倍（制劑用量 225 g/667 m2兌水量 45 L）、 400 倍（制劑用量 112.5 g/667 m2兌水量 45 L）、 600 倍（制劑用量 75 g/667 m2兌水量 45 L）為試驗(yàn)組， 75%百菌清可濕性粉劑（制劑用量 150 g/667 m2 兌水量 45 L） 500 倍稀釋液為對(duì)照藥劑，清水處理為空白對(duì)照，每處理 4 次重復(fù)。使用電動(dòng)噴霧器（海燕 3WBD-16，背負(fù)式電動(dòng)噴霧器，工作壓力為 1.0 1.2 MPa，噴孔直徑 1.3 mm），每 7 d 施藥 1 次，共施藥 3 次，最后 1 次施藥 7 d 后調(diào)查，即 3 月 26 日。調(diào)查方法參考農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則中“殺菌劑防治蔬菜灰霉病和番茄葉霉病藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則”有關(guān)內(nèi)容19，每小區(qū)采用五點(diǎn)取樣，每點(diǎn)調(diào)查 3 株，葉霉病每株調(diào)查上、中、下 3 個(gè)側(cè)枝全部葉片，灰霉病調(diào)查每株全部果實(shí)。并根據(jù)病害 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記錄發(fā)病情況。以小區(qū)為整體計(jì)算病情指數(shù)，按照 第 5 期 李磊等：生防菌解淀粉芽胞桿菌 Ht-q6 可濕性粉劑的研制及對(duì)番茄病害的田間防效 741 下列公式計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。 番茄灰霉病果的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)， 0 級(jí)：無(wú)病斑； 1 級(jí)：殘留花瓣發(fā)病或柱頭發(fā)??； 3 級(jí)：萼片腐爛或柱頭發(fā)病蔓延至果臍部； 5 級(jí)：果臍部有浸潤(rùn)斑無(wú)霉層； 7 級(jí)：果臍部有浸潤(rùn)斑有霉層但未擴(kuò)張到其他部位； 9 級(jí)：果臍部有浸潤(rùn)斑有霉層并已擴(kuò)張到其他部位。 番茄葉霉病病葉的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)， 0 級(jí)：無(wú)病斑； 1 級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積的 5%以下； 3 級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積的 6% 10%； 5 級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積的 11% 20%； 7 級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積的 21% 50%； 9 級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積的 51%以上。 病情指數(shù)（各級(jí)病葉 /果數(shù)該病級(jí)值） /（調(diào)查總?cè)~ /果數(shù)最高病級(jí)值） 100。防治效果（ %）（對(duì)照病情指數(shù)處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù) 100。 2 結(jié)果與分析 2.1 生防菌 Ht-q6 發(fā)酵液的制備 發(fā)酵培養(yǎng)液以 75 mL/250 mL 裝瓶，接種量 1%，置于搖床上， 30 、 180 r/min 速度振蕩 48 h，菌體與芽胞總含量達(dá)到最大，為 3.57 1010 cfu/mL，芽胞占比 56.58%，隨后，菌體與芽胞含量開(kāi)始趨于穩(wěn)定（圖 1）。 00.51.01.52.02.53.03.54.024 30 36 42 48 54 60 66 720102030405060708090100菌體與芽胞總量 The amount of bacteria and spores芽胞含量 Spores content芽胞百分比 Percentage of spores發(fā)酵時(shí)間 Fermentation time (h)數(shù)量Amount (1010cfu/mL)百分比Percentage(%)圖 1 不同發(fā)酵時(shí)間生防菌 Ht-q6 菌體與芽胞的含量 Fig. 1 The content of Ht-q6 bacteria and spores of biocontrol bacteria during different fermentation time 2.2 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑載體及助劑的篩選結(jié)果 2.2.1 載體的篩選 測(cè)試的 6 種載體，白炭黑和硅藻土的懸浮率較好而且差異不顯著，分別為 53.4%和52.7%，硅藻土和高嶺土的潤(rùn)濕時(shí)間分別為 72 和 75 s， 14 d 后芽胞存活率差異不顯著，白炭黑的吸附能力最大，其次為硅藻土（表 1）。因硅藻土與其他載體相比在懸浮率和潤(rùn)濕時(shí)間上與其他處理差異顯著，所以選擇硅藻土為最佳載體。 2.2.2 潤(rùn)濕劑和分散劑的篩選 在母粉中加入潤(rùn)濕劑后，十二烷基苯磺酸鈉的懸浮率、潤(rùn)濕時(shí)間和芽胞存活率分別為 65.6%、 28 s 和 89.5%，與其他處理相比差異顯著（表 2）。加入分散劑后，懸浮率相對(duì)于母粉對(duì)照來(lái)說(shuō)都有提高，其中木質(zhì)素磺酸鈉的懸浮率與潤(rùn)濕時(shí)間與其他處理相比差異顯著，對(duì)芽胞存活率基本無(wú)影響（表 3）。綜合考慮選擇十二烷基苯磺酸鈉為最佳潤(rùn)濕劑，木質(zhì)素磺酸鈉為最佳分散劑。 2.2.3 潤(rùn)濕劑和分散劑最佳比例和用量的篩選 潤(rùn)濕劑和分散劑的不同配比對(duì)可濕性粉劑的懸浮率和潤(rùn)濕時(shí)間都有一定影響，隨著十二烷基苯磺酸鈉濃度的增加，懸浮率逐漸升高；隨著分散劑木質(zhì)素磺酸鈉濃度的降低，潤(rùn)濕時(shí)間逐漸提高，在 5:5 時(shí)懸浮率和潤(rùn)濕時(shí)間分別為 76.9%和 41 s，綜合考慮確定十二烷基苯磺酸鈉和木質(zhì)素磺酸鈉的最佳配比為 5:5。助劑用量為潤(rùn)濕劑和分散劑共占制劑的百分含量。隨助劑含量的增加懸浮率也在逐漸增加， 潤(rùn)濕時(shí)間不斷延長(zhǎng)， 在 12%時(shí)懸浮率和潤(rùn)濕時(shí)間分別為 79%和 40 s， 在 14%時(shí)懸浮率和潤(rùn)濕時(shí)間分別為 79.2%和 44 s，雖然懸浮率有小幅度的提高但是潤(rùn)濕時(shí)間有大幅度的延長(zhǎng)，綜 742 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 34 卷 表 1 載體對(duì)生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑的影響 Table 1 Effects of carrier on Ht-q6 WP 載體 Carrier 懸浮率 Suspension rate (%) 潤(rùn)濕時(shí)間 Wetting time (s) 吸附能力Absorption capacity (kg/L)14 d 芽胞存活率 Spore survival rate at 14 d (%) 白炭黑 Silica 53.4 4.1 a 117 1.5 a 3.91 a 85.8 a 滑石粉 Talcum power 47.5 2.7 b 78 3.1 d 1.19 c 86.3 a 高嶺土 Kaolin 45.1 2.7 b c 75 2.2 e 1.17 c 87.1 a 輕質(zhì)碳酸鈣 Light calcium carbonate 42.3 3.5 c 95 3.0 b 1.05 d 84.1 a 膨潤(rùn)土 Bentonite 29.5 3.8 d 89 2.3 c 1.34 b 86.5 a 硅藻土 Diatomite 52.7 1.8 a 72 3.6 f 1.35 b 87.6 a 注：表中數(shù)據(jù)為平均值 SD，同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示經(jīng) Duncan 氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)在 0.05 水平間差異顯著，下同。 Note: Data were means SD; Different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 lever by Duncans multiple range test .The same below. 表 2 潤(rùn)濕劑對(duì)生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑的影響 Table 2 Effects of wetting agent on Ht-q6 WP 潤(rùn)濕劑 Wetting agent 懸浮率 Suspension rate (%) 潤(rùn)濕時(shí)間 Wetting time (s) 14 d 芽胞存活率 Spore survival rate at 14 d (%) 十二烷基苯磺酸鈉 DBS 65.6 1.8 a 28 1.9 d 89.5 a 吐溫- 80 Tween-80 60.8 1.8 bc 30 2.1 d 88.3 a 達(dá)潤(rùn) D317 Da run D317 62.4 1.9 b 33 3.1 c 89.4 a 達(dá)潤(rùn) DCM-82 Da run DCM-82 59.6 1.6 c 45 2.2 b 76.5 b 對(duì)照 CK 53.6 1.3 d 70 1.6 a 88.8 a 表 3 分散劑對(duì)生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑的影響 Table 3 Effects of dispersant agent on Ht-q6 WP 分散劑 Dispersant agent 懸浮率 Suspension rate (%) 潤(rùn)濕時(shí)間 Wetting time (s) 14 d 芽胞存活率 Spore survival rate at 14 d (%)三聚磷酸鈉 Sodium tripolyphosphate 65.8 1.7 b 55 3.2 c 88.3 a 木質(zhì)素磺酸鈉 Sodium lignosulphonate 73.9 1.3 a 32 1.9 f 87.2 a 羧甲基纖維素鈉 Sodium carboxymethyl cellulose 58.7 0.9 d 75 3.7 a 87.5 a 聚乙二醇 PEG8000 52.8 1.3 e 45 2.9 d 84.2 a 達(dá)潤(rùn) DY6 Da run DY6 62.5 1.7 c 63 2.5 b 88.1 a 達(dá)潤(rùn) D06 Da run D06 52.8 1.4 e 39 1.9 e 88.3 a 對(duì)照 CK 51.6 1.6 e 72 2.4 a 89.5 a 合考慮，確定 12%為最佳助劑用量（表 4）。 2.2.4 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑穩(wěn)定劑的篩選 KH2PO4的懸浮率和潤(rùn)濕時(shí)間分別為 77.6%和 41 s， K3PO4的懸浮率和潤(rùn)濕時(shí)間分別為 74.3%和 43 s（表 5）。相對(duì)于母粉對(duì)照 KH2PO4顯著提高了懸浮率，縮短了濕潤(rùn)時(shí)間，綜合考慮芽胞存活率，選擇 KH2PO4為最佳潤(rùn)濕劑。 2.2.5 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑保護(hù)劑的篩選 由表 6 可知，抗壞血酸和羧甲基纖維素的懸浮率最高，分別為 76.2%和 72.5%，與其他保護(hù)劑相比差異顯著，兩者的潤(rùn)濕時(shí)間分別為 37 和 41 s。但紫外保護(hù)劑主要考慮對(duì)芽胞的保護(hù)效果，且添加抗壞血酸后芽胞含量在 24 h 內(nèi)變化不大。所以綜合考慮，確定最佳紫外保護(hù)劑為抗壞血酸。 2.3 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑的芽胞含量為 2.28 1010 cfu/g，雜菌率為 0.5%， pH 為 5.8，細(xì)度為 93.5%，干燥減量為 2.5%，潤(rùn)濕時(shí)間為 45 s，懸浮率為 85.6%，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)值， Ht-q6 可濕性粉劑質(zhì)量合格（表 7）。 2.4 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑安全性評(píng)價(jià)結(jié)果 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑對(duì)番茄植株的安全性測(cè)定結(jié)果表明，番茄葉片和莖干的接種針穿刺接種（圖 第 5 期 李磊等：生防菌解淀粉芽胞桿菌 Ht-q6 可濕性粉劑的研制及對(duì)番茄病害的田間防效 743 表 4 潤(rùn)濕劑和分散劑的比例及用量對(duì)生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑的影響 Table 4 Effects of proportion of wetting agent and dispersant agent on Ht-q6 WP 十二烷基苯磺酸鈉:木質(zhì)素磺酸鈉 SDBS:Sodium lignosulphonate 懸浮率 Suspension rate (%)潤(rùn)濕時(shí)間 Wetting time (s) 助劑量 Adjuvant dosage (%)懸浮率 Suspension rate (%) 潤(rùn)濕時(shí)間 Wetting time (s) 1:9 68.4 2.3 d 39 1.8 c 2 69.8 0.9 f 37 1.6 c 2:8 68.8 2.4 d 40 1.8 c 4 72.2 1.3 e 37 1.0 c 3:7 69.1 1.5 d 40 1.5 c 6 74.5 3.3d 38 1.6 bc 4:6 74.9 2.1 c 41 1.4 c 8 75.7 1.9 cd 39 2.4 bc 5:5 76.9 1.6 bc 41 1.3 c 10 76.9 1.4 bc 39 2.0 bc 6:4 77.1 2.1 bc 45 2.2 b 12 79 1.5 ab 40 1.6 b 7:3 77.5 1.9 bc 46 1.6 ab 14 79.2 1.5 ab 44 1.6 a 8:2 77.9 1.8 b 47 2.1 ab 16 79.5 0.6 a 45 1.5 a 9:1 80.5 1.0 a 48 1.9 a 表 5 穩(wěn)定劑對(duì)生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑的影響 Table 5 Effects of stabilizer on Ht-q6 WP 穩(wěn)定劑 Stabilizer agent 懸浮率 Suspension rate (%) 潤(rùn)濕時(shí)間 Wetting time (s) 14 d 芽胞存活率 Spore survival rate (%) 碳酸鈣 CaCO358.7 2.4 c 49 2.6 b 80.2 a 磷酸鉀 K3PO474.3 1.5 b 43 1.9 c 89.2 a 磷酸二氫鉀 KH2PO477.6 1.9 a 41 1.5 c 89.1 a 羧甲基纖素鈉 Sodium carboxymethyl cellulose 60.9 2.3 c 48 1.9 b 86.5 a 對(duì)照 CK 51.5 1.7 d 70 2.6 a 89.7 a 表 6 紫外保護(hù)劑對(duì)生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑的影響 Table 6 Effects of ultraviolet protectant on Ht-q6 WP 芽胞存活率 Spore survival rate (%) 紫外保護(hù)劑 UV protective agent 懸浮率 Suspension rate (%)潤(rùn)濕時(shí)間 Wetting time (s) 0 h 6 h 12 h 24 h 抗壞血酸 Acid ascorbic 76.2 1.2 a 37 1.8 d 100 98.2 96.1 95.2 羧甲基纖維素 Carboxymethyl cellulose 72.5 1.5 b 41 1.1 c 100 97.1 93.6 90.7 糊精 Dextrin 60.5 1.3 c 44 1.6 b 100 99.3 92.1 89.8 熒光增白劑 Fluorescer 58.6 1.6 c 42 1.6 bc 100 98.5 90.6 90.1 對(duì)照 CK 51.0 2.0 d 69 1.6 a 100 95.2 85.5 74.7 表 7 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果 Table 7 Results of quality inspection of Ht-q6 WP 指標(biāo) Index 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)值 National standards 實(shí)際測(cè)定值 Actual value 雜菌率 Rate of mixed bacteria (%) 3 0.5 pH 5.0 8.0 5.8 細(xì)度 Fineness (%) 90 93.5 干燥減量 Loss on drying (%) 6 2.潤(rùn)濕時(shí)間 Wetting time (s) 180 45 懸浮率 Suspension rate (%) 70 85.6 2A）培養(yǎng) 3 d 后，和對(duì)照組（圖 2B）比較無(wú)明顯差異，番茄植株經(jīng)可濕性粉劑 100稀釋液浸根處理，移栽后正常生長(zhǎng)，無(wú)發(fā)病狀況（圖 2C）與對(duì)照組（圖 2D）無(wú)明顯差異。 2.5 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑毒理學(xué)測(cè)定結(jié)果 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)大鼠予經(jīng)口灌胃之后，沒(méi)有出現(xiàn)死亡和明顯的中毒癥狀。存活動(dòng)物體重 3 d 恢復(fù)或增重。試驗(yàn)結(jié)束后處死試驗(yàn)大鼠，據(jù)檢無(wú)異常情況。 Ht-q6 可濕性粉劑對(duì)雌、雄大鼠急性經(jīng)口 LD50 3000 mg/kg，屬于低毒性。 744 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 34 卷 ABCDA： Ht-q6 莖、葉 Stem and leaf； B： CK 莖、葉 Stem and leaf； C： Ht-q6 根 Root； D： CK 根部 Root 圖 2 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑對(duì)番茄植株的安全性評(píng)價(jià) Fig. 2 Safe evaluation of stain Ht-q6 wettable powder on tomato plant 急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，給大鼠涂抹試劑之后，沒(méi)有出現(xiàn)死亡和明顯的中毒癥狀。存活動(dòng)物體重3 d 恢復(fù)或增重。試驗(yàn)結(jié)束后處死試驗(yàn)大鼠，據(jù)檢無(wú)異常情況。 Ht-q6 可濕性粉劑對(duì)雌、雄大鼠急性經(jīng)皮LD50（ 4 h） 2000 mg/kg，屬于低毒性。 急性皮膚刺激試驗(yàn)結(jié)果表明：在試驗(yàn)周期內(nèi)，試驗(yàn)兔的皮膚涂抹部位未出現(xiàn)紅斑、水腫，積分均值為0，按國(guó)家“皮膚刺激強(qiáng)度分級(jí)”標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定，可濕性粉劑對(duì)試驗(yàn)兔的皮膚沒(méi)有刺激性。 2.6 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑田間防效試驗(yàn)結(jié)果 由表 8 可知，在利用生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑對(duì)番茄葉霉病和灰霉病的防治中，稀釋 200的防效最好，分別為 74.3%和 77.1%，與各自對(duì)照藥劑百菌清 72.4%和 69.9%的防效相比，葉霉病防治效果差異不顯著而灰霉病防治效果差異顯著。為了減少化學(xué)藥劑的使用，建議在生產(chǎn)實(shí)踐中使用稀釋倍數(shù)為 200的可濕性粉劑來(lái)預(yù)防和控制葉霉病與灰霉病的發(fā)生。 表 8 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑對(duì)番茄葉霉病和灰霉病的防治效果 Table 8 Efficiency of Ht-q6 wettable powder on tomato grey mold and leaf mold 藥劑 Fungicides 稀釋倍數(shù) Treatment times 葉霉病病情指數(shù) Disease index 葉霉病防治效果 Control effect (%) 灰霉病病情指數(shù) Disease index 灰霉病防治效果 Control effect (%) 200 3.5 0.12 c 74.3 1.6 a 2.5 0.32 d 77.1 2.6 a 400 6.1 0.15 b 54.6 2.4 b 4.1 0.12 b 61.5 1.5 c Ht-q6 800 7.4 0.15 a 45.5 0.5 c 6.4 0.2 a 40.4 1.3 d 75%百菌清可濕性粉劑 Chlorothalonil WP 500 3.7 0.25 c 72.4 1.3 a 3.2 0.15 c 69.9 1.6 b 空白對(duì)照 CK 13.5 10.7 3 討論 通過(guò)對(duì)載體、濕潤(rùn)劑、分散劑、穩(wěn)定劑和紫外保護(hù)劑的篩選，本文確定了生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑的 第 5 期 李磊等：生防菌解淀粉芽胞桿菌 Ht-q6 可濕性粉劑的研制及對(duì)番茄病害的田間防效 745 最佳配方。質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)值，質(zhì)量合格。本文在解淀粉芽胞桿菌菌劑的劑型上選擇了生物農(nóng)藥中主流劑型可濕性粉劑，相比于液體制劑更易運(yùn)輸和貯存，與其他固體制劑如粉劑和顆粒劑相比，顆粒直徑、濕潤(rùn)性、有效成分等多方面都有提高，防治病害范圍更廣?？蓾裥苑蹌┲休d體所占比 例最大，對(duì)制劑的影響也最大，所以篩選最佳載體是研制可濕性粉劑中最為關(guān)鍵的一步。王劍等20制備生防菌 B99-2 可濕性粉劑時(shí)，以硅藻土為載體，錢(qián)一鑫等21研制解淀粉芽胞桿菌 X17 可濕性粉劑也是以硅藻土為載體，與本文在載體篩選上的結(jié)果一致。綜合來(lái)看本試驗(yàn)研制的 H