34(5)738-745 中國生物防治學報 Chinese Journal of Biological Control 2018 年 10 月 收稿日期： 2018-02-26 基金項目：山西農業(yè)大學博士科研啟動基金（ 2013YJ10） ；山西省重點研發(fā)項目（ 201703D221010-2） 作者簡介： 李磊，碩士研究生， E-mails： qstlilei126.com； *通信作者，博士，副教授， E-mails： sxndwmq1973163.com。 DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2018.05.0013 生防菌解淀粉芽胞桿菌 Ht-q6可濕性粉劑的研制及 對番茄病害的田間防效 李 磊，許 敏，王美琴*（山西農業(yè)大學農學院，太谷 030801） 摘要： 為了研制一種高效、安全及無污染的生防菌劑，本文以核桃內生生防菌解淀粉芽胞桿菌 Ht-q6 為材料，通過室內篩選和田間試驗，確定了生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑的最佳助劑配方及對番茄葉霉病和灰霉病的田間防效。結果表明，可濕性粉劑的最佳配方為載體硅藻土（ 85%） 、潤濕劑十二烷基苯磺酸鈉（ 6%） 、分散劑木質素磺酸鈉（ 6%） 、穩(wěn)定劑 KH2PO4（ 1.0%） 、紫外保護劑抗壞血酸（ 1.0%） 。該粉劑芽胞含量 2.28× 1010cfu/g、雜菌率 0.5%、 pH 5.8、細度 93.5%、干燥減量 2.5%、潤濕時間 45 s、懸浮率 85.6%，符合國家標準值，質量合格。同時采用噴霧法測定了不同濃度菌劑對大棚中番茄病害的防治效果，結果表明，稀釋 200× （制劑用量 225 g/667m2）的可濕性粉劑對番茄灰霉病和葉霉病的防效分別為 77.1%和 74.3%，與對照藥劑 75%百菌清的防效相比，葉霉病防效差異不顯著而灰霉病防效差異顯著。該菌劑的研制在生產實踐中為番茄病害提供一條生防途徑。 關 鍵 詞： 解淀粉芽胞桿菌；可濕性粉劑；番茄病害；田間防效 中圖分類號： S476 文獻標識碼： A 文章編號： 1005-9261(2018)05-0738-08 Preparation of Biocontrol Agent Bacillus amyloliquefaciens Ht-q6 Wettable Powder and the Field Control against Tomato Diseases LI Lei, XU Min, WANG Meiqin*(College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China) Abstract: In order to develop biocontrol agent with high efficiency, safety and non-pollution, with the endophytic strain Ht-q6 from walnut as material, the optimal formula of biocontrol bacterium Ht-q6 wettable powder (WP) were screened and its field efficacy on tomato leaf mold and gray mold were determined. The results showed that the best formulation of WP was diatomite (85%) as filler, DBS (6%) as wetting agent, sodium lignosulphonate (6%) as dispersing agent, KH2PO4(1.0%) as stabilizer and acide ascorbique (1.0%) as UV protective. The spore content of the powder was 2.28× 1010cfu/g, the rate of bacteria was 0.5%, the pH value was 5.8, the fineness was 93.5%, the drying loss was 2.5%, wetting time was 45 s, and the suspension rate was 85.6%, which was in line with national standards and quality standards. Field trials with different concentrations of fungicides against tomato gray mold and leaf mold diseases demonstrated that the control effects of WP with the dilution of 200× (dosage: 225 g/667 m2) on both diseases were remarkable, with the efficacies of 77.1% and 74.3%, respectively. The control effect of WP with the dilution of 200× on leaf mold is not significantly different from the control, while that on gray mold is significantly different. The preparation of this bacterium is an effective way to prevent tomato disease in practice. Key words: Bacillus amyloliquefaciens; wettable powder; tomato diseases; field efficiency 第 5 期 李磊等：生防菌解淀粉芽胞桿菌 Ht-q6 可濕性粉劑的研制及對番茄病害的田間防效 739 近年來設施番茄種植給人們的生活帶來了極大的便利，但小環(huán)境氣候特點非常有利于病害的發(fā)生，造成了果實品質和產量的下降，其中葉霉病和灰霉病是番茄上常見的 2 種病害，給番茄生產造成極大的影響1。使用化學藥劑是目前主要的防治手段，防效顯著，但造成的 3R（抗藥性、再猖獗和農藥殘留）問題已經引起人們的高度重視，所以開發(fā)研制新型生物菌劑來替換或減少化學農藥的使用成為農藥界研究的熱點2。植物內生菌以其與環(huán)境相容性好、對人畜和天敵安全、容易在植物體內定殖等優(yōu)點成為較好的生防菌資源。其中芽胞桿菌屬、假單孢菌屬、固氮菌屬、土壤桿菌屬及鏈霉菌屬等是目前國內外研究具有良好防效的生防菌類別3。尤其芽胞桿菌，因其多內生芽胞、抗逆性強、繁殖快、易定殖、產生一些細菌素或毒素等特性，可用來防治多種植物病害4,5，其中枯草芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌、多粘類芽胞桿菌等研究報道的較多6,7，主要集中在室內菌株的篩選、抑菌機理、抑菌物質的提取、分離鑒定以及田間小區(qū)試驗等8-12。國內外已經登記并商品化用于生產中的芽胞桿菌菌劑相對較少，美國有 3 株枯草芽胞桿菌和 1 株解淀粉芽胞桿菌，商品名分別為 Subtilex、 Kodiak、 Serenade 和 Bio Yield，應用到生產中效果較好13,14。國內對于芽胞桿菌也有廣泛的研究，現已登記的微生物殺菌劑劑型種類繁多，有 80 億芽胞 /mL 地衣芽胞桿菌水劑（商品名為爽又多）， 10 億芽胞 /g 枯草芽胞桿菌可濕性粉劑（商品名為百抗）， 0.1 億芽胞 /g 多粘類芽胞桿菌細粒劑（商品名為康地蕾得）等15?？蓾裥苑蹌┫啾扔诜蹌╊w粒，直徑更細、更易濕潤、有效成分含量也較高；與水分散粒劑和緩釋劑相比，又具有低成本優(yōu)勢；較傳統顆粒劑相比，可防治土傳和葉部病害，范圍廣。在已登記微生物殺菌劑劑型中，可濕性粉劑占最大比例 82%， 6%水劑次之，可見可濕性粉劑的優(yōu)勢地位16。 本試驗應用的菌株 Ht-q6 是一株具有廣譜抑菌活性的核桃內生細菌， 經鑒定為解淀粉芽胞桿菌 Bacillus amyloliquefaciens，該菌株的專利號： 201410469787.6； 16S rDNA 序列 NCBI 登陸號： KM015259.1。已對其在植物體內的定殖、抑菌效果及代謝產物活性成分等進行了研究，證實了該菌株具有生防潛能17。本文通過對載體及助劑的懸浮率、濕潤時間、芽胞含量等多因子的測定，確定了最佳配方，研制出了生防菌Ht-q6 可濕性粉劑，并測定了對番茄葉霉病與灰霉病的田間防效。 1 材料與方法 1.1 供試材料 供試菌株 Ht-q6 由山西農業(yè)大學植物病理實驗室提供。固體 NA 培養(yǎng)基：牛肉浸膏 3 g，蛋白胨 5 g，瓊脂粉 15 g，葡萄糖 10 g，蒸餾水 1000 mL， pH 7.0 7.2；優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)液： 1%玉米粉， 0.5%牛肉浸膏，0.02% MgSO4·7H2O， 0.01% KCl， 0.2% NaH2PO4·2H2O， 0.4% Na2HPO4·2H2O， 100 mL 蒸餾水， pH 6.0 7.0。6 種載體：白炭黑，硅藻土，輕質碳酸鈣，膨潤土，高嶺土，滑石粉。 6 種分散劑：三聚磷酸鈉，木質素磺酸鈉，羧甲基纖維素鈉（ CMC-Na），聚乙二醇（ PEG8000），達潤 DY6，達潤 D06。 4 種潤濕劑：十二烷基苯磺酸鈉（ DBS），吐溫- 80，達潤 D317，達潤 DCM-82。 4 種穩(wěn)定劑：碳酸鈣，磷酸鉀，磷酸二氫鉀，羧甲基纖維素鈉（ CMC-Na）。 4 種保護劑：抗壞血酸，羧甲基纖維素（ CMC），糊精，熒光增白劑（ FWA）。儀器設備： SW-CJ-2FD 超凈工作臺（上海博迅實業(yè)有限公司）、 GI54DWS 高壓滅菌鍋（廈門致微儀器有限公司）、 ZWYR-211C 振蕩培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造有限公司）、 GR-240 熱空氣消毒箱（上海博迅實業(yè)有限公司）、 CF-180C 不銹鋼粉碎機（廣州晨雕機械設備有限公司）。 1.2 生防菌 Ht-q6 發(fā)酵液的制備 用接種環(huán)挑取保存的生防菌 Ht-q6，通過平板劃線將其接種于 NA 平板上進行活化培養(yǎng)， 24 h 后將活化菌株接種到優(yōu)化的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液以 75 mL/250 mL 裝瓶，接種量 1%，置于搖床上， 30 、 180 r/min振蕩培養(yǎng) 48 h，得到的懸濁液即為發(fā)酵液。 1.3 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑質量檢測方法 可濕性粉劑的各項指標按照中華人民共和國國家標準進行檢測，其中濕潤時間依據國家標準GB/T5451-2001（ 6）進行；懸浮率測定步驟依據國家標準 GB/T14825-2006（ 4.4）進行；細度測定步驟依據國家標準 GB/T16150-1995（ 2.2）進行； pH 測定步驟依據國家標準 GB/T1601-1993（ 6）進行；穩(wěn)定性測定步驟依據國家標準 GB/T19136-2003（ 2.2）進行；干燥減量測定步驟依據國家標準 GB/T 30361-2013 進行。 740 中 國 生 物 防 治 學 報 第 34 卷 雜菌率的測定：取待測樣品 10 g，加入 90 mL 無菌水的錐形瓶中搖勻溶解，即成 101稀釋液；再用移液槍吸取 1 mL 稀釋液加入裝有 9 mL 無菌水的試管中搖勻，即成 102稀釋液；以此方法連續(xù)稀釋，制成104、 105、 106、 107系列梯度稀釋液，每平板取 100 L 均勻涂布，每個梯度 3 次重復，以無菌水為對照，于 25 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h，挑取平板上目標菌菌落在 30 300 倍的稀釋梯度進行計數，同時計算目標菌以外雜菌數，雜菌率（ %）（雜菌數 /解淀粉芽胞桿菌 Ht-q6 菌數）× 100。 可濕性粉劑的芽胞存活率的測定依據中華人民共和國農業(yè)部標準 NY/T2293.1-2012（ 5.3），采用平板菌落計數法，具體計算方法參考劉盼西等18的方法。 載體最大吸附量測定：分別稱取 6 份 100 g 載體，發(fā)酵液邊倒邊用玻璃棒攪拌，直至攪拌均勻、不凝結成塊，放置不會析出液體，記錄發(fā)酵液用量 v，并計算最大吸附量 H，即 H= v/0.1（ kg/L）。 1.4 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑載體及助劑的篩選 1.4.1 可濕性粉劑載體篩選及母粉制備 參考 1.3 濕潤時間、懸浮率、芽胞含量測定方法，綜合考慮篩選出懸浮率高、濕潤時間短、芽胞含量高、吸附量大、價格便宜的載體；并將發(fā)酵液與最佳載體充分混合，烘干粉碎，制成母粉。 1.4.2 助劑的篩選 參考 1.3 測定各種濕潤劑、分散劑及穩(wěn)定劑（ 2%）添加到母粉中后濕潤時間、懸浮率及對芽胞含量的影響。其中濕潤時間越短，懸浮率越高的助劑對可濕性粉劑的性能較好，同時考慮對芽胞含量的影響，進行數據分析，并設不加助劑的母粉為對照，綜合考慮篩選出最佳潤濕劑、分散劑和穩(wěn)定劑。 紫外保護劑：將抗壞血酸，羧甲基纖維素，糊精，熒光增白劑以 10%添加量與母粉混合、烘干、粉碎，在 254 nm 紫外燈下距離 40 cm 處照射 6、 12、 24 h 后平板涂布法計算芽胞存活率，并設不加保護劑的母粉為對照，同時考慮添加保護劑后對粉劑懸浮率及濕潤時間的影響，綜合考慮篩選出最佳保護劑。 1.4.3 潤濕劑和分散劑配比及用量篩選 將篩選出的最佳潤濕劑和分散劑分別按 1:9、 2:8、 3:7、 4:6、 5:5、6:4、 7:3、 8:2、 9:1 的比例，以 10%的添加量與母粉混合、烘干和粉碎，篩選出潤濕時間短、懸浮率高的配比。將篩選出的最佳潤濕劑和分散劑以最佳配比混合后，再按照 2%、 4%、 6%、 8%、 10%、 12%、 14%、16%的添加量與母粉混合、烘干和粉碎，篩選出潤濕時間短、懸浮率高的用量。 1.5 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑安全性評價 對番茄植株的安全性測定：以培育 50 d 的健康番茄植株（品種為鑫農 1 號）為材料，挑選植株上部新葉與莖稈，用 75%酒精表面消毒后用無菌水沖洗干凈，自然晾干后，用滅菌的接種針針刺扎破番茄葉片與莖稈表皮，用移液槍取生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑 10 倍稀釋液 20 L 滴加在傷口處進行接種，置于室溫下培育 3 d。根部用無菌水沖洗干凈后用滅菌刀片劃長 2 mm 傷口，后浸于 10 倍制劑稀釋液中 1 min，再移栽至無菌土的育苗缽中常規(guī)管理 7 d。每個處理 5 株番茄植株， 3 次重復，以無菌水為對照。分別觀察植株莖、葉與根是否出現萎蔫、變色、腐爛、壞死和畸形等癥狀。 1.6 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑毒理學測定 依據國家安全標準 GB/T 15670-1995，以初成年大鼠和家兔為材料，測試了生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑急性經口毒性、急性經皮毒性及急性皮膚刺激，檢測機構：山西農業(yè)大學動物科學院。 1.7 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑對番茄病害的田間防效試驗 試驗地選擇為山西晉中太谷縣水秀鄉(xiāng)里修村農戶的番茄大棚，番茄品種為鑫農 1 號，定植于 2016 年 12月 16 日。試驗采用田間隨機區(qū)組設計，每小區(qū)面積為 10 m2，番茄 32 株。試驗開始于 2017 年 3 月 5 日，正處在番茄幼果期，病害發(fā)生初期。試驗共設 5 個處理，其中菌株 Ht-q6 可濕性粉劑稀釋 200 倍（制劑用量 225 g/667 m2兌水量 45 L）、 400 倍（制劑用量 112.5 g/667 m2兌水量 45 L）、 600 倍（制劑用量 75 g/667 m2兌水量 45 L）為試驗組， 75%百菌清可濕性粉劑（制劑用量 150 g/667 m2 兌水量 45 L） 500 倍稀釋液為對照藥劑，清水處理為空白對照，每處理 4 次重復。使用電動噴霧器（海燕 3WBD-16，背負式電動噴霧器，工作壓力為 1.0 1.2 MPa，噴孔直徑 1.3 mm），每 7 d 施藥 1 次，共施藥 3 次，最后 1 次施藥 7 d 后調查，即 3 月 26 日。調查方法參考農藥田間藥效試驗準則中“殺菌劑防治蔬菜灰霉病和番茄葉霉病藥效試驗準則”有關內容19，每小區(qū)采用五點取樣，每點調查 3 株，葉霉病每株調查上、中、下 3 個側枝全部葉片，灰霉病調查每株全部果實。并根據病害 分級標準記錄發(fā)病情況。以小區(qū)為整體計算病情指數，按照 第 5 期 李磊等：生防菌解淀粉芽胞桿菌 Ht-q6 可濕性粉劑的研制及對番茄病害的田間防效 741 下列公式計算病情指數和防治效果。 番茄灰霉病果的分級標準， 0 級：無病斑； 1 級：殘留花瓣發(fā)病或柱頭發(fā)??； 3 級：萼片腐爛或柱頭發(fā)病蔓延至果臍部； 5 級：果臍部有浸潤斑無霉層； 7 級：果臍部有浸潤斑有霉層但未擴張到其他部位； 9 級：果臍部有浸潤斑有霉層并已擴張到其他部位。 番茄葉霉病病葉的分級標準， 0 級：無病斑； 1 級：病斑面積占整個葉面積的 5%以下； 3 級：病斑面積占整個葉面積的 6% 10%； 5 級：病斑面積占整個葉面積的 11% 20%； 7 級：病斑面積占整個葉面積的 21% 50%； 9 級：病斑面積占整個葉面積的 51%以上。 病情指數（各級病葉 /果數×該病級值） /（調查總葉 /果數×最高病級值）× 100。防治效果（ %）（對照病情指數處理病情指數）/對照病情指數× 100。 2 結果與分析 2.1 生防菌 Ht-q6 發(fā)酵液的制備 發(fā)酵培養(yǎng)液以 75 mL/250 mL 裝瓶，接種量 1%，置于搖床上， 30 、 180 r/min 速度振蕩 48 h，菌體與芽胞總含量達到最大，為 3.57× 1010 cfu/mL，芽胞占比 56.58%，隨后，菌體與芽胞含量開始趨于穩(wěn)定（圖 1）。 00.51.01.52.02.53.03.54.024 30 36 42 48 54 60 66 720102030405060708090100菌體與芽胞總量 The amount of bacteria and spores芽胞含量 Spores content芽胞百分比 Percentage of spores發(fā)酵時間 Fermentation time (h)數量Amount (×1010cfu/mL)百分比Percentage(%)圖 1 不同發(fā)酵時間生防菌 Ht-q6 菌體與芽胞的含量 Fig. 1 The content of Ht-q6 bacteria and spores of biocontrol bacteria during different fermentation time 2.2 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑載體及助劑的篩選結果 2.2.1 載體的篩選 測試的 6 種載體，白炭黑和硅藻土的懸浮率較好而且差異不顯著，分別為 53.4%和52.7%，硅藻土和高嶺土的潤濕時間分別為 72 和 75 s， 14 d 后芽胞存活率差異不顯著，白炭黑的吸附能力最大，其次為硅藻土（表 1）。因硅藻土與其他載體相比在懸浮率和潤濕時間上與其他處理差異顯著，所以選擇硅藻土為最佳載體。 2.2.2 潤濕劑和分散劑的篩選 在母粉中加入潤濕劑后，十二烷基苯磺酸鈉的懸浮率、潤濕時間和芽胞存活率分別為 65.6%、 28 s 和 89.5%，與其他處理相比差異顯著（表 2）。加入分散劑后，懸浮率相對于母粉對照來說都有提高，其中木質素磺酸鈉的懸浮率與潤濕時間與其他處理相比差異顯著，對芽胞存活率基本無影響（表 3）。綜合考慮選擇十二烷基苯磺酸鈉為最佳潤濕劑，木質素磺酸鈉為最佳分散劑。 2.2.3 潤濕劑和分散劑最佳比例和用量的篩選 潤濕劑和分散劑的不同配比對可濕性粉劑的懸浮率和潤濕時間都有一定影響，隨著十二烷基苯磺酸鈉濃度的增加，懸浮率逐漸升高；隨著分散劑木質素磺酸鈉濃度的降低，潤濕時間逐漸提高，在 5:5 時懸浮率和潤濕時間分別為 76.9%和 41 s，綜合考慮確定十二烷基苯磺酸鈉和木質素磺酸鈉的最佳配比為 5:5。助劑用量為潤濕劑和分散劑共占制劑的百分含量。隨助劑含量的增加懸浮率也在逐漸增加， 潤濕時間不斷延長， 在 12%時懸浮率和潤濕時間分別為 79%和 40 s， 在 14%時懸浮率和潤濕時間分別為 79.2%和 44 s，雖然懸浮率有小幅度的提高但是潤濕時間有大幅度的延長，綜 742 中 國 生 物 防 治 學 報 第 34 卷 表 1 載體對生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑的影響 Table 1 Effects of carrier on Ht-q6 WP 載體 Carrier 懸浮率 Suspension rate (%) 潤濕時間 Wetting time (s) 吸附能力Absorption capacity (kg/L)14 d 芽胞存活率 Spore survival rate at 14 d (%) 白炭黑 Silica 53.4± 4.1 a 117± 1.5 a 3.91 a 85.8 a 滑石粉 Talcum power 47.5± 2.7 b 78± 3.1 d 1.19 c 86.3 a 高嶺土 Kaolin 45.1± 2.7 b c 75± 2.2 e 1.17 c 87.1 a 輕質碳酸鈣 Light calcium carbonate 42.3± 3.5 c 95± 3.0 b 1.05 d 84.1 a 膨潤土 Bentonite 29.5± 3.8 d 89± 2.3 c 1.34 b 86.5 a 硅藻土 Diatomite 52.7± 1.8 a 72± 3.6 f 1.35 b 87.6 a 注：表中數據為平均值± SD，同列數據后不同小寫字母表示經 Duncan 氏新復極差法檢驗在 0.05 水平間差異顯著，下同。 Note: Data were means± SD; Different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 lever by Duncans multiple range test .The same below. 表 2 潤濕劑對生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑的影響 Table 2 Effects of wetting agent on Ht-q6 WP 潤濕劑 Wetting agent 懸浮率 Suspension rate (%) 潤濕時間 Wetting time (s) 14 d 芽胞存活率 Spore survival rate at 14 d (%) 十二烷基苯磺酸鈉 DBS 65.6± 1.8 a 28± 1.9 d 89.5 a 吐溫- 80 Tween-80 60.8± 1.8 bc 30± 2.1 d 88.3 a 達潤 D317 Da run D317 62.4± 1.9 b 33± 3.1 c 89.4 a 達潤 DCM-82 Da run DCM-82 59.6± 1.6 c 45± 2.2 b 76.5 b 對照 CK 53.6± 1.3 d 70± 1.6 a 88.8 a 表 3 分散劑對生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑的影響 Table 3 Effects of dispersant agent on Ht-q6 WP 分散劑 Dispersant agent 懸浮率 Suspension rate (%) 潤濕時間 Wetting time (s) 14 d 芽胞存活率 Spore survival rate at 14 d (%)三聚磷酸鈉 Sodium tripolyphosphate 65.8± 1.7 b 55± 3.2 c 88.3 a 木質素磺酸鈉 Sodium lignosulphonate 73.9± 1.3 a 32± 1.9 f 87.2 a 羧甲基纖維素鈉 Sodium carboxymethyl cellulose 58.7± 0.9 d 75± 3.7 a 87.5 a 聚乙二醇 PEG8000 52.8± 1.3 e 45± 2.9 d 84.2 a 達潤 DY6 Da run DY6 62.5± 1.7 c 63± 2.5 b 88.1 a 達潤 D06 Da run D06 52.8± 1.4 e 39± 1.9 e 88.3 a 對照 CK 51.6± 1.6 e 72± 2.4 a 89.5 a 合考慮，確定 12%為最佳助劑用量（表 4）。 2.2.4 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑穩(wěn)定劑的篩選 KH2PO4的懸浮率和潤濕時間分別為 77.6%和 41 s， K3PO4的懸浮率和潤濕時間分別為 74.3%和 43 s（表 5）。相對于母粉對照 KH2PO4顯著提高了懸浮率，縮短了濕潤時間，綜合考慮芽胞存活率，選擇 KH2PO4為最佳潤濕劑。 2.2.5 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑保護劑的篩選 由表 6 可知，抗壞血酸和羧甲基纖維素的懸浮率最高，分別為 76.2%和 72.5%，與其他保護劑相比差異顯著，兩者的潤濕時間分別為 37 和 41 s。但紫外保護劑主要考慮對芽胞的保護效果，且添加抗壞血酸后芽胞含量在 24 h 內變化不大。所以綜合考慮，確定最佳紫外保護劑為抗壞血酸。 2.3 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑質量檢測結果 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑的芽胞含量為 2.28× 1010 cfu/g，雜菌率為 0.5%， pH 為 5.8，細度為 93.5%，干燥減量為 2.5%，潤濕時間為 45 s，懸浮率為 85.6%，符合國家標準值， Ht-q6 可濕性粉劑質量合格（表 7）。 2.4 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑安全性評價結果 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑對番茄植株的安全性測定結果表明，番茄葉片和莖干的接種針穿刺接種（圖 第 5 期 李磊等：生防菌解淀粉芽胞桿菌 Ht-q6 可濕性粉劑的研制及對番茄病害的田間防效 743 表 4 潤濕劑和分散劑的比例及用量對生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑的影響 Table 4 Effects of proportion of wetting agent and dispersant agent on Ht-q6 WP 十二烷基苯磺酸鈉:木質素磺酸鈉 SDBS:Sodium lignosulphonate 懸浮率 Suspension rate (%)潤濕時間 Wetting time (s) 助劑量 Adjuvant dosage (%)懸浮率 Suspension rate (%) 潤濕時間 Wetting time (s) 1:9 68.4± 2.3 d 39± 1.8 c 2 69.8± 0.9 f 37± 1.6 c 2:8 68.8± 2.4 d 40± 1.8 c 4 72.2± 1.3 e 37± 1.0 c 3:7 69.1± 1.5 d 40± 1.5 c 6 74.5± 3.3d 38± 1.6 bc 4:6 74.9± 2.1 c 41± 1.4 c 8 75.7± 1.9 cd 39± 2.4 bc 5:5 76.9± 1.6 bc 41± 1.3 c 10 76.9± 1.4 bc 39± 2.0 bc 6:4 77.1± 2.1 bc 45± 2.2 b 12 79± 1.5 ab 40± 1.6 b 7:3 77.5± 1.9 bc 46± 1.6 ab 14 79.2± 1.5 ab 44± 1.6 a 8:2 77.9± 1.8 b 47± 2.1 ab 16 79.5± 0.6 a 45± 1.5 a 9:1 80.5± 1.0 a 48± 1.9 a 表 5 穩(wěn)定劑對生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑的影響 Table 5 Effects of stabilizer on Ht-q6 WP 穩(wěn)定劑 Stabilizer agent 懸浮率 Suspension rate (%) 潤濕時間 Wetting time (s) 14 d 芽胞存活率 Spore survival rate (%) 碳酸鈣 CaCO358.7± 2.4 c 49± 2.6 b 80.2 a 磷酸鉀 K3PO474.3± 1.5 b 43± 1.9 c 89.2 a 磷酸二氫鉀 KH2PO477.6± 1.9 a 41± 1.5 c 89.1 a 羧甲基纖素鈉 Sodium carboxymethyl cellulose 60.9± 2.3 c 48± 1.9 b 86.5 a 對照 CK 51.5± 1.7 d 70± 2.6 a 89.7 a 表 6 紫外保護劑對生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑的影響 Table 6 Effects of ultraviolet protectant on Ht-q6 WP 芽胞存活率 Spore survival rate (%) 紫外保護劑 UV protective agent 懸浮率 Suspension rate (%)潤濕時間 Wetting time (s) 0 h 6 h 12 h 24 h 抗壞血酸 Acid ascorbic 76.2± 1.2 a 37± 1.8 d 100 98.2 96.1 95.2 羧甲基纖維素 Carboxymethyl cellulose 72.5± 1.5 b 41± 1.1 c 100 97.1 93.6 90.7 糊精 Dextrin 60.5± 1.3 c 44± 1.6 b 100 99.3 92.1 89.8 熒光增白劑 Fluorescer 58.6± 1.6 c 42± 1.6 bc 100 98.5 90.6 90.1 對照 CK 51.0± 2.0 d 69± 1.6 a 100 95.2 85.5 74.7 表 7 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑質量檢測結果 Table 7 Results of quality inspection of Ht-q6 WP 指標 Index 國家標準值 National standards 實際測定值 Actual value 雜菌率 Rate of mixed bacteria (%) 3 0.5 pH 5.0 8.0 5.8 細度 Fineness (%) 90 93.5 干燥減量 Loss on drying (%) 6 2.潤濕時間 Wetting time (s) 180 45 懸浮率 Suspension rate (%) 70 85.6 2A）培養(yǎng) 3 d 后，和對照組（圖 2B）比較無明顯差異，番茄植株經可濕性粉劑 100×稀釋液浸根處理，移栽后正常生長，無發(fā)病狀況（圖 2C）與對照組（圖 2D）無明顯差異。 2.5 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑毒理學測定結果 急性經口毒性試驗結果表明，對大鼠予經口灌胃之后，沒有出現死亡和明顯的中毒癥狀。存活動物體重 3 d 恢復或增重。試驗結束后處死試驗大鼠，據檢無異常情況。 Ht-q6 可濕性粉劑對雌、雄大鼠急性經口 LD50 3000 mg/kg，屬于低毒性。 744 中 國 生 物 防 治 學 報 第 34 卷 ABCDA： Ht-q6 莖、葉 Stem and leaf； B： CK 莖、葉 Stem and leaf； C： Ht-q6 根 Root； D： CK 根部 Root 圖 2 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑對番茄植株的安全性評價 Fig. 2 Safe evaluation of stain Ht-q6 wettable powder on tomato plant 急性經皮毒性試驗結果表明，給大鼠涂抹試劑之后，沒有出現死亡和明顯的中毒癥狀。存活動物體重3 d 恢復或增重。試驗結束后處死試驗大鼠，據檢無異常情況。 Ht-q6 可濕性粉劑對雌、雄大鼠急性經皮LD50（ 4 h） 2000 mg/kg，屬于低毒性。 急性皮膚刺激試驗結果表明：在試驗周期內，試驗兔的皮膚涂抹部位未出現紅斑、水腫，積分均值為0，按國家“皮膚刺激強度分級”標準評定，可濕性粉劑對試驗兔的皮膚沒有刺激性。 2.6 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑田間防效試驗結果 由表 8 可知，在利用生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑對番茄葉霉病和灰霉病的防治中，稀釋 200×的防效最好，分別為 74.3%和 77.1%，與各自對照藥劑百菌清 72.4%和 69.9%的防效相比，葉霉病防治效果差異不顯著而灰霉病防治效果差異顯著。為了減少化學藥劑的使用，建議在生產實踐中使用稀釋倍數為 200×的可濕性粉劑來預防和控制葉霉病與灰霉病的發(fā)生。 表 8 生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑對番茄葉霉病和灰霉病的防治效果 Table 8 Efficiency of Ht-q6 wettable powder on tomato grey mold and leaf mold 藥劑 Fungicides 稀釋倍數 Treatment times 葉霉病病情指數 Disease index 葉霉病防治效果 Control effect (%) 灰霉病病情指數 Disease index 灰霉病防治效果 Control effect (%) 200× 3.5± 0.12 c 74.3± 1.6 a 2.5± 0.32 d 77.1± 2.6 a 400× 6.1± 0.15 b 54.6± 2.4 b 4.1± 0.12 b 61.5± 1.5 c Ht-q6 800× 7.4± 0.15 a 45.5± 0.5 c 6.4± 0.2 a 40.4± 1.3 d 75%百菌清可濕性粉劑 Chlorothalonil WP 500× 3.7± 0.25 c 72.4± 1.3 a 3.2± 0.15 c 69.9± 1.6 b 空白對照 CK 13.5 10.7 3 討論 通過對載體、濕潤劑、分散劑、穩(wěn)定劑和紫外保護劑的篩選，本文確定了生防菌 Ht-q6 可濕性粉劑的 第 5 期 李磊等：生防菌解淀粉芽胞桿菌 Ht-q6 可濕性粉劑的研制及對番茄病害的田間防效 745 最佳配方。質量檢測結果符合國家標準值，質量合格。本文在解淀粉芽胞桿菌菌劑的劑型上選擇了生物農藥中主流劑型可濕性粉劑，相比于液體制劑更易運輸和貯存，與其他固體制劑如粉劑和顆粒劑相比，顆粒直徑、濕潤性、有效成分等多方面都有提高，防治病害范圍更廣。可濕性粉劑中載體所占比 例最大，對制劑的影響也最大，所以篩選最佳載體是研制可濕性粉劑中最為關鍵的一步。王劍等20制備生防菌 B99-2 可濕性粉劑時，以硅藻土為載體，錢一鑫等21研制解淀粉芽胞桿菌 X17 可濕性粉劑也是以硅藻土為載體，與本文在載體篩選上的結果一致。綜合來看本試驗研制的 H