園藝學(xué)報， 2018， 45 (7)： 1237 1250. Acta Horticulturae Sinica   doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0824； http： /www. ahs. ac. cn                                                 1237 收稿日期 ： 2018 04 02； 修回日期 ： 2018 07 09   基金項目 ： 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) SRTP 項目；國家自然科學(xué)基金項目（ 31460500）  * 通信作者  Author for correspondence（ E-mail： maojuangsau.edu.cn； Tel： 13659425539）  葡萄 PP2C 家族基因的鑒定與表達分析  何紅紅1，路志浩2，馬宗桓1，梁國平1，馬麗娟1，萬  鵬1，毛  娟1,*（1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，蘭州  730070；2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，武漢  430070）  摘  要： 參考擬南芥（ Arabidopsis thaliana）的 PP2C 基因注冊序列，從葡萄（ Vitis vinifera）全基因組中鑒定得到 PP2C 家族基因 27 個，分為 10 個亞族 A、 C I、 K、 L。編碼氨基酸 181 1 084 個，理論等電點 4.46 8.98。亞細胞定位分析表明，葡萄 PP2C 基因家族主要在細胞質(zhì)、葉綠體和細胞核中表達。二級結(jié)構(gòu)主要以 螺旋和不規(guī)則卷曲為主。葡萄 PP2C 基因芯片表達譜分析發(fā)現(xiàn)，該家族成員在葡萄不同組織中響應(yīng)不同的逆境脅迫。 qRT-PCR 分析表明，葡萄試管苗在 100 和 50 mmol L-1ABA、 10% NaCl和 10% PEG 單獨處理 6 h 后 VvPP2C02 的誘導(dǎo)表達量最高，分別是對照的 11 倍、 8 倍、 14 倍和 13 倍。  關(guān)鍵詞： 葡萄； PP2C 家族；基因克?。换蛐酒磉_譜；實時定量 PCR 中圖分類號： S 663.1        文獻標志碼： A        文章編號： 0513-353X（ 2018） 07-1237-14 Genome-Wide Identification and Expression Analysis of the PP2C Gene Family in Vitis vinifera HE Honghong1， LU Zhihao2， MA Zonghuan1， LIANG Guoping1， MA Lijuan1， WAN Peng1， and MAO Juan1,*（1College of Horticulture， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China；2College of Horticulture and Forestry Sciences， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）  Abstract： In this study， 27 members of the VvPP2C gene family were identified in the whole genome of grapes（ Vitis vinifera L.） ， with reference to Arabidopsis thaliana PP2C gene registration sequence. The VvPP2C genes expression was analyzed by bioinformatics， microarray expression and stress analysis. The results showed that the 27 members of VvPP2C gene family could be divided into 10 subpopulations of A，C I， K， L. The analysis of physicochemical properties showed that the number of amino acids in the VvPP2C gene family was between 181 1 084， and the theoretical pI distribution was between 4.46 8.98. The VvPP2C gene family was mainly expressed in the cytoplasm， chloroplast and nucleus through the subcellular localization analysis. The VvPP2C gene family was mainly composed of -helix and irregular coil in secondary structure analysis. The microarray analysis showed that VvPP2C gene members of the family responded to different stress in different tissues of the grape. The inducible expression of grape plantlets was the highest in 100， 50 mmol L-1ABA， 10% NaCl and 10% PEG， at 11， 8， 14 and 13 times in qRT-PCR analysis， respectively. Keywords： grape； PP2Cs gene family； gene clone； gene chip expression profiling； real-time PCR PP2C（ 2C type protein phopatases）是一類單體絲氨酸 /蘇氨酸殘基蛋白磷酸酶。在真核生物中，  Genome-wide identification and expression analysis of the PP2C gene family in Vitis vinifera. He Honghong， Lu Zhihao， Ma Zonghuan， Liang Guoping， Ma Lijuan， Wan Peng， Mao Juan. 1238                                                                    Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (7)： 1237 1250. PP2C 在脫落酸、茉莉酸、水楊酸等信號傳導(dǎo)途徑中起著重要的調(diào)控作用（閔東紅  等， 2013） 。目前在植物體中發(fā)現(xiàn) 9 種 PP2C 蛋白磷酸酶，包括 ABI1、 ABI2、 HAB1、 HAB2、 AHG1、 AHG3/AtPP2CA、HAI1、 HAI2 和 HAI3（ Bhaskara et al.， 2012； Nakashima & Yamaguchi-Shinozaki， 2013） ，擬南芥中ABI1、 ABI2、 AHG1、 AHG3/AtPP2C-A、 HAB1 及 HAB2 等 PP2C 類蛋白屬于 A 亞族，對 ABA 信號起負調(diào)控作用（ Nakashima & Yamaguchi-Shinozaki， 2013） 。 ABI1 在響應(yīng) ABA 介導(dǎo)的干旱脅迫時起負調(diào)控作用（ Zhang et al.， 2013） ， ZmPP2C 在鹽和干旱脅迫反應(yīng)中是一個負調(diào)控因子（ Mao et al.，2015； Xiang et al.， 2017） ， PP2C 中 G 組的 3 個基因被證明經(jīng)鹽脅迫后上調(diào)表達（ Xue et al.， 2008） 。qRT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)，鹽堿脅迫對 GsPP2C-D 和 AtPP2C-D 有顯著影響（ Chen et al.， 2018） 。蛋白激酶和磷酸酶催化的可逆性蛋白磷酸化在植物細胞脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用（ Cao et al.， 2016） ，在苔蘚中，破壞 PpABI-1A 和 PpABI-1B 會導(dǎo)致其耐受干旱性增強，因為在 ABA 誘導(dǎo)下這兩個 PP2C-As基因會完全重疊（ Komatsu et al.， 2013） 。還有研究表明， ABI1 在不同的組織中表達，包括種子和保護細胞， AHG1 和 AHG3 在細胞核也有表達，并且 AHG3 參與低溫信號傳導(dǎo)并調(diào)節(jié) ABA 的應(yīng)答反應(yīng)（ Umezawa et al.，2009； Banerjee & Roychoudhury， 2017） 。 SAUR 蛋白可以與一些 AtPP2C-D蛋白互作來調(diào)節(jié) PM H+-ATPase 活性（ Spartz et al.， 2014； Li et al.， 2016） 。  植物通過調(diào)節(jié)自身的信號通路，改變相關(guān)基因的表達來適應(yīng)逆境脅迫（ Shang et al.， 2013） ，蛋白質(zhì)的去磷酸化與磷酸化在此過程中均起重要的作用（ Antoni et al.， 2012） 。在擬南芥中有 112 個基因編碼的蛋白磷酸酶，其中有多種能夠響應(yīng)逆境脅迫（ Huang et al.， 2012； Sanchita et al.， 2014） 。PP2C 酶的活性受 Mg2+和 Mn2+調(diào)控 （ Cao et al.， 2016） ， 并且參與植物體內(nèi)的可逆磷酸化 （ Chen et al.，2018） 。大部分植物 PP2C 蛋白包含 3 個基序，即具有保守催化結(jié)構(gòu)域的 C 末端，具有功能各異的膜定位信號序列延伸區(qū)的  N 端和類似受體激酶互作結(jié)構(gòu)域（張冬  等， 2017） 。目前已對谷子（閔東紅  等， 2013） 、水稻（ Singh et al.， 2010） 、擬南芥（ Singh et al.， 2010） 、二穗短柄草（ Cao et al.，2016）等植物中的 PP2C 基因家族成員進行了研究分析。  葡萄基因組測序已完成（ http： /www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/） ，但是葡萄PP2C 家族基因的研究還未見報道。土壤鹽漬化、干旱以及冬季低溫嚴重影響葡萄的生長發(fā)育和產(chǎn)量形成（王艷君  等， 2017） 。本研究中參考擬南芥 PP2C 基因注冊序列，同源克隆出葡萄 PP2C 基因家族成員并進行生物信息學(xué)分析，初步探究該基因家族在葡萄逆境脅迫中的表達特點和響應(yīng)規(guī)律。  1  材料與方法  1.1  材料與處理  試驗于 2016 2017 年進行。試驗材料為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院保存的寶石無核葡萄（ Vitis vinifera）試管苗。將芽的莖段接于 MS 培養(yǎng)基上，置于 LED 白光下培養(yǎng) 35 d，選擇生長情況一致的試管苗用于處理。處理 A： 100 mmol L-1ABA；處理 B： 50 mmol L-1ABA；處理 C： 10% NaCl；處理 D： 10% PEG；以正常生長的試管苗為對照。每個處理 6 瓶，重復(fù) 3 次。將采集稱量的樣品用錫箔紙包裹后迅速置于液氮中速凍，然后放入 80 冰箱中保存。利用 RNA plant 植物 RNA 提取試劑（中科瑞泰）提取葡萄試管苗不同組織總 RNA。  1.2  葡萄 PP2C 家族基因成員鑒定  從已知文獻中得到 80 個擬南芥 PP2C 基因 ID。 在 NCBI 中輸入所有的基因號獲得每個基因?qū)?yīng)何紅紅，路志浩，馬宗桓，梁國平，馬麗娟，萬   鵬，毛   娟 . 葡萄 PP2C 家族基因的鑒定與表達分析 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (7)： 1237 1250.                                                                                  1239 的 CDS 與 Full-length 的序列。將獲得的 CDS 輸入到葡萄基因庫中，獲得葡萄 PP2C 基因組成員信息（ http： /www.ncbi.nlm.nih.gov）。為避免重復(fù)對獲得的所有序列進行 DNAMAN 比對篩選。在葡萄基因庫獲取已知序列的基因號、 CDS 長度、氨基酸數(shù)、等電點、分子量大小等理化性質(zhì)數(shù)據(jù)（ http： / www.genoscope.cns.fr/cgi-bin/blast_server/projet_ML/blast.pl）。  1.3  葡萄 PP2C 基因家族進化、基因結(jié)構(gòu)、 motif 序列及亞細胞定位分析  利用 MEGA5.0 和 clustalx.exe 分析蛋白系統(tǒng)進化關(guān)系；利用 GSDS（ http： /gsds. cbi.pku.edu.cn/）進行基因結(jié)構(gòu)分析 （ Zhang et al.， 2012） ； 采用 http： /meme-suite.org/tools/meme 進行 motif 分析 （ Bailey et al.， 2009）；采用 WoLF PSORT（ http： /www.genscript.com/wolf-psort.html）在線進行亞細胞定位。  1.4  葡萄 PP2C 家族基因芯片表達譜分析  從 NCBI 提供的 GEO（ http： /www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）數(shù)據(jù)庫中下載葡萄 RNASeq 數(shù)據(jù)，登錄號為 GSE31662 和 GSE31594。 GSE31662 數(shù)據(jù)來自赤霞珠葡萄，將軟化的綠色果皮離體培養(yǎng)，在培養(yǎng)皿中加入 0.3 mol L-1蔗糖  + 脫落酸（ ABA）作為處理，未處理的作對照（ CK1） ，每個處理3 次重復(fù)，在處理后的 3 和 10 d 分別進行取樣。 GSE31594 數(shù)據(jù)來自生長在水培滴灌系統(tǒng)中的赤霞珠 ，用 120 mmol L-1（ NaCl CaCl = 10 1）混合液、聚乙二醇（ PEG） 、 5 低溫分別進行處理，未處理的為對照（ CK2） ，每個處理 3 次重復(fù)，前兩個處理分別在 1、 4、 8 和 24 h 采集葉片， 5 處理在 1、 4 和 8 h 采集葉片。  用葡萄 PP2C 核酸序列為探針檢索出序列相同的 Affymetrix GeneChip 16K 基因 ID， 然后提取葡萄 PP2C 基因在各種非生物脅迫下的 RNASeq 數(shù)據(jù)，通過 Excel 對數(shù)據(jù)進行 log2 轉(zhuǎn)換，最后用 HemI制作電子表達熱圖（ heat-map） 。  1.5  實時熒光定量 PCR 將葡萄 PP2C 家族基因的 CDS 序列進行在線引物設(shè)計生工生物工程（上海）股份有限公司網(wǎng)站， 將設(shè)計好的引物 （表 1） 交由該公司合成。 cDNA 合成用 Prime Script RT reagent Kit（ Perfect Real Time）試劑盒（ TaKaRa）。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在 20 下保存?zhèn)溆?。實時熒光定量 PCR（ qRT-PCR）用Bio-Rad iCycler iQ 實時定量 PCR 儀，以葡萄 UBQ 基因為內(nèi)參（許明  等， 2017） ，對葡萄 PP2C 基因家族進行特異性表達分析。擴增體系含 1 L cDNA，上、下游引物各 0.8 L， SYBR 10 L 反應(yīng)MIX， 7 L ddH2O，總 體 系 20 L。反應(yīng)程序為： 95  30 s， 95  5 s， 60  34 s， 95  15 s， 60  60 s， 95  15 s，共 40 個循環(huán)。試驗 3 次重復(fù)。試驗數(shù)據(jù)用 Excel 軟件分析。  表 1  葡萄 PP2C 基因家族表達分析的實時熒光定量引物  Table 1  qRT-PCR primers for expression analysis of PP2C in Vitis vinifera 基因 Gene 上游引物（ 5 3） Forward primer 下游引物（ 5 3） Reverse primer VvPP2C01 GGTCTGGGATGTTTTGAGCA TGAGTTTCCATTCACGAGCA VvPP2C02 ACCGCTATCCTTGTTGGTGA TCAGTTTGGTCTGGCTTGTG VvPP2C03 TCTGTCGGTGGAGGATGAAT GCCAGTCTCTTGGAGCACAT VvPP2C04 CAAGGGTTTGTTATGGGATGA TCCACCTCCTCTGATTCTCCT VvPP2C05 GCATCTGTAGGGGATTCTCG TTCAGCCTTCCAACTTCACC VvPP2C06 GGGTCAGGAGGAGGAAGAAC CAAAGAGGCGAAATCACTCG VvPP2C07 CCCTTCAGTCCTTCATCACC TGGGCAACAACCTCTTCATT VvPP2C08 TGGGTCTTGTGTTTTGGTTG GCTGGATGGCTTTCAATCTC VvPP2C09 CAACACTGAAAGAGGCAGCA TTATCTCCAAAAGCCCGAGA VvPP2C10 ACAAGGTTTGGCGTGTGAA TGAAGGGTTGAGGCAATCTAA VvPP2C11 ATGGGCTATGGGAGAACCTT TCTTTGCCGCTTCCTGTAAT Genome-wide identification and expression analysis of the PP2C gene family in Vitis vinifera. He Honghong， Lu Zhihao， Ma Zonghuan， Liang Guoping， Ma Lijuan， Wan Peng， Mao Juan. 1240                                                                    Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (7)： 1237 1250. 續(xù)表 1 基因 Gene 上游引物（ 5 3） Forward primer 下游引物（ 5 3） Reverse primer VvPP2C12 TCTTTGCCGCTTCCTGTAAT GAAGTCCTCCCCTTTCTTGC VvPP2C13 TTCAAAGTCACCCTCGCAAT AACCCCTCGGTCAATCTTCT VvPP2C14 GGCGGATGTGATAAAGAAGG CGCACCAACTAAACAACAGG VvPP2C15 GACTGGGAAGTGAGGAGTGC GCTGGTGGAGAAGATGGAAC VvPP2C16 CGATGGAATGAGCCAAAGAT TTCTTCAGCCAAAGCCAAAT VvPP2C17 TGGTGTGATTGCTGTTCCTG AACGGTCTGGCTGGAGAGA VvPP2C18 TCACACAACAGCAGCCAGA CCAGGAAGAGGCACACTACAG VvPP2C19 GGTTTGATGGGATTGATTGG CGAGATGGGGAAAGTGAATG VvPP2C20 CGAGATGGGGAAAGTGAATG GAGGACCCTTTGGCTTTTGT VvPP2C21 ATGATTGGGCATTTGAGGAG CACCAGCATTAGCAACAACAAVvPP2C22 TGGATTTTGCCAGGAGAAGA GAAGCACACCACAACAGCAG VvPP2C23 AAGCAACAGTCCAACCCTTC TGTCCGCAATGTCCAAATAA VvPP2C24 CAAGGGTTTGTTATGGGATGA TCCACCTCCTCTGATTCTCCT VvPP2C25 GGCAGATGTTGGTGTTGATG TTCGCTTTTGTGCTTGAGTG VvPP2C26 TTCAAACTGCCCCCTAAGC ACCGCACACTGGCTACTCAT VvPP2C27 GACGATGGCAAGGAAAGAAC TCTGGGGAGAAGCAAATCAC2  結(jié)果與分析  2.1  葡萄 PP2C 家族基因理化性質(zhì)分析  經(jīng)同源克隆得到的 27 條葡萄 PP2C 家族基因，分別命名為 VvPP2C01 VvPP2C27。其分布于葡萄 19 條染色體中的 14 條上，其中 4 號染色體上分布最多，有 5 個，其次是 18 號染色體，有 4 個，1、 9、 11、 12、 13、 14、 19 號染色體上各有 1 個（表 2） 。有兩個基因 VvPP2C04/VvPP2C24 在 6 號  表 2  葡萄  PP2C 基因理化性質(zhì)  Table 2  Physical and chemical property of PP2C in Vitis vinifera 基因  Gene 染色體  定位  Chr 基因登錄號  Gene accession No. 氨基酸數(shù)  Amino acid 分子量 /kD Molecular  weight pI cDNA 全長 /bp FL-cDNA 分子式  Formula 基因全長 /bp Full length  VvPP2C01 12 GSVIVT01030553001 448 49 898.3 5.99 2 050 C2164H3426N624O680S265 701 VvPP2C02 4 GSVIVT01036034001 293 31 524.0 5.05 1 749 C1375H2159N393O444S77 133 VvPP2C03 8 GSVIVT01025802001 660 73 121.3 5.50 2 257 C3252H5110N884O977S2813 155 VvPP2C04 6 GSVIVT01024976001 629 70 525.1 5.62 2 146 C3089H4866N880O970S213 070 VvPP2C05 14 GSVIVT01031195001 431 46 407.0 7.97 1 627 C2039H3286N572O626S187 248 VvPP2C06 4 GSVIVT01019076001 462 50 856.4 6.58 2 784 C2220H3561N637O700S155 190 VvPP2C07 7 GSVIVT01028223001 181 20 610.3 5.44 1 194 C915H1425N253O276S75 158 VvPP2C08 5 GSVIVT01017754001 504 55 318.3 4.87 2 306 C2410H3832N668O774S245 084 VvPP2C09 18 GSVIVT01009035001 284 31 053.1 7.05 1 338 C1351H2162N398O420S113 425 VvPP2C10 8 GSVIVT01025572001 381 42 543.8 8.94 2 008 C1905H3025N535O550S103 132 VvPP2C11 13 GSVIVT01032637001 386 42 793.7 7.73 1 783 C1895H3015N545O565S106 464 VvPP2C12 18 GSVIVT01009518001 430 46 466.7 5.26 2 477 C2032H3238N564O639S219 648 VvPP2C13 3 GSVIVT01023994001 397 43 771.6 8.20 1 593 C1926H3050N572O573S125 033 VvPP2C14 3 GSVIVT01037875001 380 42 324.2 8.98 1 594 C1877H2980N550O547S103 811 VvPP2C15 1 GSVIVT01011853001 428 46 202.9 8.52 1 759 C2006H3270N588O615S234 221 VvPP2C16 9 GSVIVT01016816001 507 54 882.2 4.95 2 734 C2385H3852N674O763S223 592 VvPP2C17 5 GSVIVT01017855001 242 26 337.5 4.46 1 661 C1154H1820N312O374S94 011 VvPP2C18 19 GSVIVT01014860001 433 47 731.8 5.02 1 919 C2090H3298N574O662S2113 337 VvPP2C19 11 GSVIVT01015338001 1 084 120 188.4 5.09 4 300 C5296H8311N1465O1652S3914 665 VvPP2C20 18 GSVIVT01009670001 286 30 635.8 4.95 1 880 C1338H2082N376O438S66 748 VvPP2C21 4 GSVIVT01035977001 358 39 280.1 5.01 1 717 C1704H2676N480O545S2116 175 VvPP2C22 4 GSVIVT01035778001 381 41 845.0 5.21 1 664 C1824H2862N524O571S1810 019 VvPP2C23 8 GSVIVT01034176001 613 68 445.1 5.95 1 885 C3019H4712N846O926S242 649 VvPP2C24 6 GSVIVT01024976001 629 70 525.1 5.62 2 146 C3089H4866N880O970S213 070 VvPP2C25 4 GSVIVT01019004001 332 35 160.0 5.05 2 213 C1534H2395N433O496S1013 995 VvPP2C26 7 GSVIVT01022296001 388 42 433.5 6.43 1 580 C1870H2987N521O566S197 131 VvPP2C27 18 GSVIVT01013399001 360 39 346.9 5.84 1 757 C1713H2730N488O526S244 656 何紅紅，路志浩，馬宗桓，梁國平，馬麗娟，萬   鵬，毛   娟 . 葡萄 PP2C 家族基因的鑒定與表達分析 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (7)： 1237 1250.                                                                                  1241 染色體上緊密連鎖，而且為旁系同源基因，自展值為 90。 VvPP2C 成員編碼氨基酸數(shù)在 181 1 084之間， 即使是同一亞族中不同基因編碼氨基酸數(shù)也存在很大差異； 理論等電點 （ pI） 分布在 4.46 8.98之間，其中編碼堿性氨基酸序列有 7 個，分別是 VvPP2C05、 VvPP2C09、 VvPP2C10、 VvPP2C11、VvPP2C13、 VvPP2C14、 VvPP2C15，且 VvPP2C10、 VvPP2C11、 VvPP2C13、 VvPP2C14 均屬于家族中的 D 亞族。  2.2  葡萄 PP2C 家族基因多序列比對及其進化分析  葡萄 PP2C 家族基因在 N 端保守性差，但是在 C 端具有較強的保守性，含有共同的結(jié)構(gòu)亞域，推測其在功能上具有相似性。為進一步了解其進化特性，對擬南芥和葡萄 PP2C 家族基因（ AtPP2C和 VvPP2C）采用鄰接法（ Neighbor-Joining， NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過構(gòu)建聚類樹將其分為 12 個亞族（ A L） ，其中  B亞族和 J 亞族只含有 AtPP2C 基因，其余 10 個亞族（ A、 C I、 K、 L）都含有 AtPP2C 和 VvPP2C 基因（圖 1） ?？梢缘弥咸雅c擬南芥基因家族并不趨向于分別類聚。  圖 1  擬南芥和葡萄 PP2C 基因進化樹  Fig. 1  The unrooted phylogenetic tree of PP2C gene in Arabidopsis and grape Genome-wide identification and expression analysis of the PP2C gene family in Vitis vinifera. He Honghong， Lu Zhihao， Ma Zonghuan， Liang Guoping， Ma Lijuan， Wan Peng， Mao Juan. 1242                                                                    Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (7)： 1237 1250. 2.3  葡萄 PP2C 家族基因結(jié)構(gòu)分析  葡萄 PP2C 家族基因序列長度分布在 2 645 14 665 bp 之間。除 VvPP2C03 和 VvPP2C19 外，其余包含外顯子 3 10 個；而且除 L 亞族外，其余亞族中包含外顯子數(shù)相近，差值不超過 4 個。尤其是 E 亞族中的 3 個成員，均包含 6 個外顯子。但是，即使在相同亞族內(nèi)，氨基酸序列上外顯子的分布位置相差較大，序列長度各異，保守性差，無明顯規(guī)律（圖 2） 。推測每個亞族之間，在潛在的功能上會有一定的差異。  圖 2  葡萄 PP2C 家族基因結(jié)構(gòu)  Fig. 2  Structures of PP2C gene family in grape 2.4  葡萄 PP2C 家族基因 motif 序列分析  在葡萄 PP2C 家族基因中共找到了 15 個 motif（表 3）。  如圖 3 所示，除 VvPP2C07 外，其余 26 個 VvPP2C 均包含 motif1、 motif2、 motif8。 motif12、motif13、 motif15 主要分布于 C 亞族中的 VvPP2C04 和 VvPP2C24 上。 motif3、 motif7、 motif9 主要分布于 C 和 D 亞族中的部分成員。 motif5、 motif6 除 K 亞族外，其他亞族的 VvPP2C 中均有分布。motif10 僅分布于 D 亞族。 motif14 主要分布于 A、 G、 H 亞族。分析發(fā)現(xiàn) C 亞族包含的 motif 最多，K 亞族包含的 motif 最少。  何紅紅，路志浩，馬宗桓，梁國平，馬麗娟，萬   鵬，毛   娟 . 葡萄 PP2C 家族基因的鑒定與表達分析 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (7)： 1237 1250.                                                                                  1243 表 3  葡萄  PP2C 蛋白氨基酸保守序列  Table 3  Conserved motifs of PP2C proteins in grape 保守基序編號  Conserved motif 長度 /bp Length 氨基酸保守序列  Amino acid conserved sequence motif1 29 RLSPEDEFLILASDGLWDVLSNZEAVDIV motif2 1 VVJICGRTLYVANVGDSRAVL motif3 50 PRGDPAQHLVEEALFRAAKKRGMDYHELLKIPRGDRRHYHDDITVIVISL motif4 21 EPDGTFFGVYDGHGGPDAADFmotif5 KGGLAVSRAIGDGYLKQPKVN motif6 21 GVAIQLSVDHKPNCEEERERI motif7 41 HSDVLDVJSKALRATEESFLSJVDKQVMERPZJASVGSCVL motif8 11 PDDITVVVVDI motif9 21 FRIDYVGTSPYJSCEPSLYVH motif10 29 LLWYKDLGQHVNGDFSMAVIQANNLLEDQ motif11 21 KNLQAAQGKKGEDRVLMVVSE motif12 50 CFTGEGGARRRQDISVLISDPLDEGLGHSFCYIRPDQSRLSSSKVHSEET motif13 41 WDDKHESNPRKKGKNSKNKYKGAAKKWEENQRRWKCEWDRE motif14 41 LPFIVEDEEWPQAJPRALVAAFVKTDIAFQEASSTSGTSAT motif15 50 TSFTSIPLQPIPRNWMNSGPIPGSPLEKSSTDQFQRSYSHGGFAFRPRSR 圖 3  葡萄 PP2C 家族 motif（ 1 15）分析  Fig. 3  Motif analysis of PP2C gene family in grape 2.5  葡萄 PP2C 家族基因亞細胞定位預(yù)測和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析  葡萄 PP2C 基因家族集中在細胞質(zhì)、葉綠體和細胞核中表達（表 4） 。在線粒體、液泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞膜和細胞基質(zhì)中有少量表達，在細胞骨架和過氧化物酶體中均不表達，只有 VvPP2C12 在高爾基體中表達。推測，其表達部位的不同可能與其執(zhí)行的功能有關(guān)。  Genome-wide identification and expression analysis of the PP2C gene family in Vitis vinifera. He Honghong， Lu Zhihao， Ma Zonghuan， Liang Guoping， Ma Lijuan， Wan Peng， Mao Juan. 1244                                                                    Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (7)： 1237 1250. 二級結(jié)構(gòu)分析表明：葡萄 PP2C 家族基因編碼的 27 個蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要以 螺旋和不規(guī)則卷曲為主（表 5）。  表 4  葡萄  PP2C 基因亞細胞定位預(yù)測  Table 4  Subcellular location prediction of PP2C gene in grape 基因  Gene 細胞質(zhì)  Cytoplasm  葉綠體  Chloroplast  細胞核  Nucleus  線粒體  Mitochondria  過氧化物酶體  Peroxisome  細胞骨架  Cytoskeleton  VvPP2C01  10.5  2.5  VvPP2C02 5 2 5    VvPP2C03 2 9 2    VvPP2C04 1 2 9 1  Vv