葡萄PP2C家族基因的鑒定與表達(dá)分析.pdf
<p>園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (7)： 1237 1250. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0824； http： /www. ahs. ac. cn 1237 收稿日期 ： 2018 04 02； 修回日期 ： 2018 07 09 基金項(xiàng)目 ： 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) SRTP 項(xiàng)目；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ 31460500） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： maojuangsau.edu.cn； Tel： 13659425539） 葡萄 PP2C 家族基因的鑒定與表達(dá)分析 何紅紅1，路志浩2，馬宗桓1，梁國(guó)平1，馬麗娟1，萬(wàn) 鵬1，毛 娟1,*（1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，蘭州 730070；2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，武漢 430070） 摘 要： 參考擬南芥（ Arabidopsis thaliana）的 PP2C 基因注冊(cè)序列，從葡萄（ Vitis vinifera）全基因組中鑒定得到 PP2C 家族基因 27 個(gè)，分為 10 個(gè)亞族 A、 C I、 K、 L。編碼氨基酸 181 1 084 個(gè)，理論等電點(diǎn) 4.46 8.98。亞細(xì)胞定位分析表明，葡萄 PP2C 基因家族主要在細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和細(xì)胞核中表達(dá)。二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以 螺旋和不規(guī)則卷曲為主。葡萄 PP2C 基因芯片表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，該家族成員在葡萄不同組織中響應(yīng)不同的逆境脅迫。 qRT-PCR 分析表明，葡萄試管苗在 100 和 50 mmol · L-1ABA、 10% NaCl和 10% PEG 單獨(dú)處理 6 h 后 VvPP2C02 的誘導(dǎo)表達(dá)量最高，分別是對(duì)照的 11 倍、 8 倍、 14 倍和 13 倍。 關(guān)鍵詞： 葡萄； PP2C 家族；基因克??；基因芯片表達(dá)譜；實(shí)時(shí)定量 PCR 中圖分類(lèi)號(hào)： S 663.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 0513-353X（ 2018） 07-1237-14 Genome-Wide Identification and Expression Analysis of the PP2C Gene Family in Vitis vinifera HE Honghong1， LU Zhihao2， MA Zonghuan1， LIANG Guoping1， MA Lijuan1， WAN Peng1， and MAO Juan1,*（1College of Horticulture， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China；2College of Horticulture and Forestry Sciences， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China） Abstract： In this study， 27 members of the VvPP2C gene family were identified in the whole genome of grapes（ Vitis vinifera L.） ， with reference to Arabidopsis thaliana PP2C gene registration sequence. The VvPP2C genes expression was analyzed by bioinformatics， microarray expression and stress analysis. The results showed that the 27 members of VvPP2C gene family could be divided into 10 subpopulations of A，C I， K， L. The analysis of physicochemical properties showed that the number of amino acids in the VvPP2C gene family was between 181 1 084， and the theoretical pI distribution was between 4.46 8.98. The VvPP2C gene family was mainly expressed in the cytoplasm， chloroplast and nucleus through the subcellular localization analysis. The VvPP2C gene family was mainly composed of -helix and irregular coil in secondary structure analysis. The microarray analysis showed that VvPP2C gene members of the family responded to different stress in different tissues of the grape. The inducible expression of grape plantlets was the highest in 100， 50 mmol · L-1ABA， 10% NaCl and 10% PEG， at 11， 8， 14 and 13 times in qRT-PCR analysis， respectively. Keywords： grape； PP2Cs gene family； gene clone； gene chip expression profiling； real-time PCR PP2C（ 2C type protein phopatases）是一類(lèi)單體絲氨酸 /蘇氨酸殘基蛋白磷酸酶。在真核生物中， Genome-wide identification and expression analysis of the PP2C gene family in Vitis vinifera. He Honghong， Lu Zhihao， Ma Zonghuan， Liang Guoping， Ma Lijuan， Wan Peng， Mao Juan. 1238 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (7)： 1237 1250. PP2C 在脫落酸、茉莉酸、水楊酸等信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起著重要的調(diào)控作用（閔東紅 等， 2013） 。目前在植物體中發(fā)現(xiàn) 9 種 PP2C 蛋白磷酸酶，包括 ABI1、 ABI2、 HAB1、 HAB2、 AHG1、 AHG3/AtPP2CA、HAI1、 HAI2 和 HAI3（ Bhaskara et al.， 2012； Nakashima & Yamaguchi-Shinozaki， 2013） ，擬南芥中ABI1、 ABI2、 AHG1、 AHG3/AtPP2C-A、 HAB1 及 HAB2 等 PP2C 類(lèi)蛋白屬于 A 亞族，對(duì) ABA 信號(hào)起負(fù)調(diào)控作用（ Nakashima & Yamaguchi-Shinozaki， 2013） 。 ABI1 在響應(yīng) ABA 介導(dǎo)的干旱脅迫時(shí)起負(fù)調(diào)控作用（ Zhang et al.， 2013） ， ZmPP2C 在鹽和干旱脅迫反應(yīng)中是一個(gè)負(fù)調(diào)控因子（ Mao et al.，2015； Xiang et al.， 2017） ， PP2C 中 G 組的 3 個(gè)基因被證明經(jīng)鹽脅迫后上調(diào)表達(dá)（ Xue et al.， 2008） 。qRT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)，鹽堿脅迫對(duì) GsPP2C-D 和 AtPP2C-D 有顯著影響（ Chen et al.， 2018） 。蛋白激酶和磷酸酶催化的可逆性蛋白磷酸化在植物細(xì)胞脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用（ Cao et al.， 2016） ，在苔蘚中，破壞 PpABI-1A 和 PpABI-1B 會(huì)導(dǎo)致其耐受干旱性增強(qiáng)，因?yàn)樵?ABA 誘導(dǎo)下這兩個(gè) PP2C-As基因會(huì)完全重疊（ Komatsu et al.， 2013） 。還有研究表明， ABI1 在不同的組織中表達(dá)，包括種子和保護(hù)細(xì)胞， AHG1 和 AHG3 在細(xì)胞核也有表達(dá)，并且 AHG3 參與低溫信號(hào)傳導(dǎo)并調(diào)節(jié) ABA 的應(yīng)答反應(yīng)（ Umezawa et al.，2009； Banerjee & Roychoudhury， 2017） 。 SAUR 蛋白可以與一些 AtPP2C-D蛋白互作來(lái)調(diào)節(jié) PM H+-ATPase 活性（ Spartz et al.， 2014； Li et al.， 2016） 。 植物通過(guò)調(diào)節(jié)自身的信號(hào)通路，改變相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)適應(yīng)逆境脅迫（ Shang et al.， 2013） ，蛋白質(zhì)的去磷酸化與磷酸化在此過(guò)程中均起重要的作用（ Antoni et al.， 2012） 。在擬南芥中有 112 個(gè)基因編碼的蛋白磷酸酶，其中有多種能夠響應(yīng)逆境脅迫（ Huang et al.， 2012； Sanchita et al.， 2014） 。PP2C 酶的活性受 Mg2+和 Mn2+調(diào)控 （ Cao et al.， 2016） ， 并且參與植物體內(nèi)的可逆磷酸化 （ Chen et al.，2018） 。大部分植物 PP2C 蛋白包含 3 個(gè)基序，即具有保守催化結(jié)構(gòu)域的 C 末端，具有功能各異的膜定位信號(hào)序列延伸區(qū)的 N 端和類(lèi)似受體激酶互作結(jié)構(gòu)域（張冬 等， 2017） 。目前已對(duì)谷子（閔東紅 等， 2013） 、水稻（ Singh et al.， 2010） 、擬南芥（ Singh et al.， 2010） 、二穗短柄草（ Cao et al.，2016）等植物中的 PP2C 基因家族成員進(jìn)行了研究分析。 葡萄基因組測(cè)序已完成（ http： /www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/） ，但是葡萄PP2C 家族基因的研究還未見(jiàn)報(bào)道。土壤鹽漬化、干旱以及冬季低溫嚴(yán)重影響葡萄的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量形成（王艷君 等， 2017） 。本研究中參考擬南芥 PP2C 基因注冊(cè)序列，同源克隆出葡萄 PP2C 基因家族成員并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，初步探究該基因家族在葡萄逆境脅迫中的表達(dá)特點(diǎn)和響應(yīng)規(guī)律。 1 材料與方法 1.1 材料與處理 試驗(yàn)于 2016 2017 年進(jìn)行。試驗(yàn)材料為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院保存的寶石無(wú)核葡萄（ Vitis vinifera）試管苗。將芽的莖段接于 MS 培養(yǎng)基上，置于 LED 白光下培養(yǎng) 35 d，選擇生長(zhǎng)情況一致的試管苗用于處理。處理 A： 100 mmol · L-1ABA；處理 B： 50 mmol · L-1ABA；處理 C： 10% NaCl；處理 D： 10% PEG；以正常生長(zhǎng)的試管苗為對(duì)照。每個(gè)處理 6 瓶，重復(fù) 3 次。將采集稱(chēng)量的樣品用錫箔紙包裹后迅速置于液氮中速凍，然后放入 80 冰箱中保存。利用 RNA plant 植物 RNA 提取試劑（中科瑞泰）提取葡萄試管苗不同組織總 RNA。 1.2 葡萄 PP2C 家族基因成員鑒定 從已知文獻(xiàn)中得到 80 個(gè)擬南芥 PP2C 基因 ID。 在 NCBI 中輸入所有的基因號(hào)獲得每個(gè)基因?qū)?yīng)何紅紅，路志浩，馬宗桓，梁國(guó)平，馬麗娟，萬(wàn) 鵬，毛 娟 . 葡萄 PP2C 家族基因的鑒定與表達(dá)分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (7)： 1237 1250. 1239 的 CDS 與 Full-length 的序列。將獲得的 CDS 輸入到葡萄基因庫(kù)中，獲得葡萄 PP2C 基因組成員信息（ http： /www.ncbi.nlm.nih.gov）。為避免重復(fù)對(duì)獲得的所有序列進(jìn)行 DNAMAN 比對(duì)篩選。在葡萄基因庫(kù)獲取已知序列的基因號(hào)、 CDS 長(zhǎng)度、氨基酸數(shù)、等電點(diǎn)、分子量大小等理化性質(zhì)數(shù)據(jù)（ http： / www.genoscope.cns.fr/cgi-bin/blast_server/projet_ML/blast.pl）。 1.3 葡萄 PP2C 基因家族進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)、 motif 序列及亞細(xì)胞定位分析 利用 MEGA5.0 和 clustalx.exe 分析蛋白系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系；利用 GSDS（ http： /gsds. cbi.pku.edu.cn/）進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析 （ Zhang et al.， 2012） ； 采用 http： /meme-suite.org/tools/meme 進(jìn)行 motif 分析 （ Bailey et al.， 2009）；采用 WoLF PSORT（ http： /www.genscript.com/wolf-psort.html）在線(xiàn)進(jìn)行亞細(xì)胞定位。 1.4 葡萄 PP2C 家族基因芯片表達(dá)譜分析 從 NCBI 提供的 GEO（ http： /www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載葡萄 RNASeq 數(shù)據(jù)，登錄號(hào)為 GSE31662 和 GSE31594。 GSE31662 數(shù)據(jù)來(lái)自赤霞珠葡萄，將軟化的綠色果皮離體培養(yǎng)，在培養(yǎng)皿中加入 0.3 mol · L-1蔗糖 + 脫落酸（ ABA）作為處理，未處理的作對(duì)照（ CK1） ，每個(gè)處理3 次重復(fù)，在處理后的 3 和 10 d 分別進(jìn)行取樣。 GSE31594 數(shù)據(jù)來(lái)自生長(zhǎng)在水培滴灌系統(tǒng)中的赤霞珠 ，用 120 mmol · L-1（ NaCl CaCl = 10 1）混合液、聚乙二醇（ PEG） 、 5 低溫分別進(jìn)行處理，未處理的為對(duì)照（ CK2） ，每個(gè)處理 3 次重復(fù)，前兩個(gè)處理分別在 1、 4、 8 和 24 h 采集葉片， 5 處理在 1、 4 和 8 h 采集葉片。 用葡萄 PP2C 核酸序列為探針檢索出序列相同的 Affymetrix GeneChip 16K 基因 ID， 然后提取葡萄 PP2C 基因在各種非生物脅迫下的 RNASeq 數(shù)據(jù)，通過(guò) Excel 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行 log2 轉(zhuǎn)換，最后用 HemI制作電子表達(dá)熱圖（ heat-map） 。 1.5 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 將葡萄 PP2C 家族基因的 CDS 序列進(jìn)行在線(xiàn)引物設(shè)計(jì)生工生物工程（上海）股份有限公司網(wǎng)站， 將設(shè)計(jì)好的引物 （表 1） 交由該公司合成。 cDNA 合成用 Prime Script RT reagent Kit（ Perfect Real Time）試劑盒（ TaKaRa）。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在 20 下保存?zhèn)溆谩?shí)時(shí)熒光定量 PCR（ qRT-PCR）用Bio-Rad iCycler iQ 實(shí)時(shí)定量 PCR 儀，以葡萄 UBQ 基因?yàn)閮?nèi)參（許明 等， 2017） ，對(duì)葡萄 PP2C 基因家族進(jìn)行特異性表達(dá)分析。擴(kuò)增體系含 1 L cDNA，上、下游引物各 0.8 L， SYBR 10 L 反應(yīng)MIX， 7 L ddH2O，總 體 系 20 L。反應(yīng)程序?yàn)椋?95 30 s， 95 5 s， 60 34 s， 95 15 s， 60 60 s， 95 15 s，共 40 個(gè)循環(huán)。試驗(yàn) 3 次重復(fù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用 Excel 軟件分析。 表 1 葡萄 PP2C 基因家族表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量引物 Table 1 qRT-PCR primers for expression analysis of PP2C in Vitis vinifera 基因 Gene 上游引物（ 5 3） Forward primer 下游引物（ 5 3） Reverse primer VvPP2C01 GGTCTGGGATGTTTTGAGCA TGAGTTTCCATTCACGAGCA VvPP2C02 ACCGCTATCCTTGTTGGTGA TCAGTTTGGTCTGGCTTGTG VvPP2C03 TCTGTCGGTGGAGGATGAAT GCCAGTCTCTTGGAGCACAT VvPP2C04 CAAGGGTTTGTTATGGGATGA TCCACCTCCTCTGATTCTCCT VvPP2C05 GCATCTGTAGGGGATTCTCG TTCAGCCTTCCAACTTCACC VvPP2C06 GGGTCAGGAGGAGGAAGAAC CAAAGAGGCGAAATCACTCG VvPP2C07 CCCTTCAGTCCTTCATCACC TGGGCAACAACCTCTTCATT VvPP2C08 TGGGTCTTGTGTTTTGGTTG GCTGGATGGCTTTCAATCTC VvPP2C09 CAACACTGAAAGAGGCAGCA TTATCTCCAAAAGCCCGAGA VvPP2C10 ACAAGGTTTGGCGTGTGAA TGAAGGGTTGAGGCAATCTAA VvPP2C11 ATGGGCTATGGGAGAACCTT TCTTTGCCGCTTCCTGTAAT Genome-wide identification and expression analysis of the PP2C gene family in Vitis vinifera. He Honghong， Lu Zhihao， Ma Zonghuan， Liang Guoping， Ma Lijuan， Wan Peng， Mao Juan. 1240 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (7)： 1237 1250. 續(xù)表 1 基因 Gene 上游引物（ 5 3） Forward primer 下游引物（ 5 3） Reverse primer VvPP2C12 TCTTTGCCGCTTCCTGTAAT GAAGTCCTCCCCTTTCTTGC VvPP2C13 TTCAAAGTCACCCTCGCAAT AACCCCTCGGTCAATCTTCT VvPP2C14 GGCGGATGTGATAAAGAAGG CGCACCAACTAAACAACAGG VvPP2C15 GACTGGGAAGTGAGGAGTGC GCTGGTGGAGAAGATGGAAC VvPP2C16 CGATGGAATGAGCCAAAGAT TTCTTCAGCCAAAGCCAAAT VvPP2C17 TGGTGTGATTGCTGTTCCTG AACGGTCTGGCTGGAGAGA VvPP2C18 TCACACAACAGCAGCCAGA CCAGGAAGAGGCACACTACAG VvPP2C19 GGTTTGATGGGATTGATTGG CGAGATGGGGAAAGTGAATG VvPP2C20 CGAGATGGGGAAAGTGAATG GAGGACCCTTTGGCTTTTGT VvPP2C21 ATGATTGGGCATTTGAGGAG CACCAGCATTAGCAACAACAAVvPP2C22 TGGATTTTGCCAGGAGAAGA GAAGCACACCACAACAGCAG VvPP2C23 AAGCAACAGTCCAACCCTTC TGTCCGCAATGTCCAAATAA VvPP2C24 CAAGGGTTTGTTATGGGATGA TCCACCTCCTCTGATTCTCCT VvPP2C25 GGCAGATGTTGGTGTTGATG TTCGCTTTTGTGCTTGAGTG VvPP2C26 TTCAAACTGCCCCCTAAGC ACCGCACACTGGCTACTCAT VvPP2C27 GACGATGGCAAGGAAAGAAC TCTGGGGAGAAGCAAATCAC2 結(jié)果與分析 2.1 葡萄 PP2C 家族基因理化性質(zhì)分析 經(jīng)同源克隆得到的 27 條葡萄 PP2C 家族基因，分別命名為 VvPP2C01 VvPP2C27。其分布于葡萄 19 條染色體中的 14 條上，其中 4 號(hào)染色體上分布最多，有 5 個(gè)，其次是 18 號(hào)染色體，有 4 個(gè)，1、 9、 11、 12、 13、 14、 19 號(hào)染色體上各有 1 個(gè)（表 2） 。有兩個(gè)基因 VvPP2C04/VvPP2C24 在 6 號(hào) 表 2 葡萄 PP2C 基因理化性質(zhì) Table 2 Physical and chemical property of PP2C in Vitis vinifera 基因 Gene 染色體 定位 Chr 基因登錄號(hào) Gene accession No. 氨基酸數(shù) Amino acid 分子量 /kD Molecular weight pI cDNA 全長(zhǎng) /bp FL-cDNA 分子式 Formula 基因全長(zhǎng) /bp Full length VvPP2C01 12 GSVIVT01030553001 448 49 898.3 5.99 2 050 C2164H3426N624O680S265 701 VvPP2C02 4 GSVIVT01036034001 293 31 524.0 5.05 1 749 C1375H2159N393O444S77 133 VvPP2C03 8 GSVIVT01025802001 660 73 121.3 5.50 2 257 C3252H5110N884O977S2813 155 VvPP2C04 6 GSVIVT01024976001 629 70 525.1 5.62 2 146 C3089H4866N880O970S213 070 VvPP2C05 14 GSVIVT01031195001 431 46 407.0 7.97 1 627 C2039H3286N572O626S187 248 VvPP2C06 4 GSVIVT01019076001 462 50 856.4 6.58 2 784 C2220H3561N637O700S155 190 VvPP2C07 7 GSVIVT01028223001 181 20 610.3 5.44 1 194 C915H1425N253O276S75 158 VvPP2C08 5 GSVIVT01017754001 504 55 318.3 4.87 2 306 C2410H3832N668O774S245 084 VvPP2C09 18 GSVIVT01009035001 284 31 053.1 7.05 1 338 C1351H2162N398O420S113 425 VvPP2C10 8 GSVIVT01025572001 381 42 543.8 8.94 2 008 C1905H3025N535O550S103 132 VvPP2C11 13 GSVIVT01032637001 386 42 793.7 7.73 1 783 C1895H3015N545O565S106 464 VvPP2C12 18 GSVIVT01009518001 430 46 466.7 5.26 2 477 C2032H3238N564O639S219 648 VvPP2C13 3 GSVIVT01023994001 397 43 771.6 8.20 1 593 C1926H3050N572O573S125 033 VvPP2C14 3 GSVIVT01037875001 380 42 324.2 8.98 1 594 C1877H2980N550O547S103 811 VvPP2C15 1 GSVIVT01011853001 428 46 202.9 8.52 1 759 C2006H3270N588O615S234 221 VvPP2C16 9 GSVIVT01016816001 507 54 882.2 4.95 2 734 C2385H3852N674O763S223 592 VvPP2C17 5 GSVIVT01017855001 242 26 337.5 4.46 1 661 C1154H1820N312O374S94 011 VvPP2C18 19 GSVIVT01014860001 433 47 731.8 5.02 1 919 C2090H3298N574O662S2113 337 VvPP2C19 11 GSVIVT01015338001 1 084 120 188.4 5.09 4 300 C5296H8311N1465O1652S3914 665 VvPP2C20 18 GSVIVT01009670001 286 30 635.8 4.95 1 880 C1338H2082N376O438S66 748 VvPP2C21 4 GSVIVT01035977001 358 39 280.1 5.01 1 717 C1704H2676N480O545S2116 175 VvPP2C22 4 GSVIVT01035778001 381 41 845.0 5.21 1 664 C1824H2862N524O571S1810 019 VvPP2C23 8 GSVIVT01034176001 613 68 445.1 5.95 1 885 C3019H4712N846O926S242 649 VvPP2C24 6 GSVIVT01024976001 629 70 525.1 5.62 2 146 C3089H4866N880O970S213 070 VvPP2C25 4 GSVIVT01019004001 332 35 160.0 5.05 2 213 C1534H2395N433O496S1013 995 VvPP2C26 7 GSVIVT01022296001 388 42 433.5 6.43 1 580 C1870H2987N521O566S197 131 VvPP2C27 18 GSVIVT01013399001 360 39 346.9 5.84 1 757 C1713H2730N488O526S244 656 何紅紅，路志浩，馬宗桓，梁國(guó)平，馬麗娟，萬(wàn) 鵬，毛 娟 . 葡萄 PP2C 家族基因的鑒定與表達(dá)分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (7)： 1237 1250. 1241 染色體上緊密連鎖，而且為旁系同源基因，自展值為 90。 VvPP2C 成員編碼氨基酸數(shù)在 181 1 084之間， 即使是同一亞族中不同基因編碼氨基酸數(shù)也存在很大差異； 理論等電點(diǎn) （ pI） 分布在 4.46 8.98之間，其中編碼堿性氨基酸序列有 7 個(gè)，分別是 VvPP2C05、 VvPP2C09、 VvPP2C10、 VvPP2C11、VvPP2C13、 VvPP2C14、 VvPP2C15，且 VvPP2C10、 VvPP2C11、 VvPP2C13、 VvPP2C14 均屬于家族中的 D 亞族。 2.2 葡萄 PP2C 家族基因多序列比對(duì)及其進(jìn)化分析 葡萄 PP2C 家族基因在 N 端保守性差，但是在 C 端具有較強(qiáng)的保守性，含有共同的結(jié)構(gòu)亞域，推測(cè)其在功能上具有相似性。為進(jìn)一步了解其進(jìn)化特性，對(duì)擬南芥和葡萄 PP2C 家族基因（ AtPP2C和 VvPP2C）采用鄰接法（ Neighbor-Joining， NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，通過(guò)構(gòu)建聚類(lèi)樹(shù)將其分為 12 個(gè)亞族（ A L） ，其中 B亞族和 J 亞族只含有 AtPP2C 基因，其余 10 個(gè)亞族（ A、 C I、 K、 L）都含有 AtPP2C 和 VvPP2C 基因（圖 1） ?？梢缘弥?，葡萄與擬南芥基因家族并不趨向于分別類(lèi)聚。 圖 1 擬南芥和葡萄 PP2C 基因進(jìn)化樹(shù) Fig. 1 The unrooted phylogenetic tree of PP2C gene in Arabidopsis and grape Genome-wide identification and expression analysis of the PP2C gene family in Vitis vinifera. He Honghong， Lu Zhihao， Ma Zonghuan， Liang Guoping， Ma Lijuan， Wan Peng， Mao Juan. 1242 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (7)： 1237 1250. 2.3 葡萄 PP2C 家族基因結(jié)構(gòu)分析 葡萄 PP2C 家族基因序列長(zhǎng)度分布在 2 645 14 665 bp 之間。除 VvPP2C03 和 VvPP2C19 外，其余包含外顯子 3 10 個(gè)；而且除 L 亞族外，其余亞族中包含外顯子數(shù)相近，差值不超過(guò) 4 個(gè)。尤其是 E 亞族中的 3 個(gè)成員，均包含 6 個(gè)外顯子。但是，即使在相同亞族內(nèi)，氨基酸序列上外顯子的分布位置相差較大，序列長(zhǎng)度各異，保守性差，無(wú)明顯規(guī)律（圖 2） 。推測(cè)每個(gè)亞族之間，在潛在的功能上會(huì)有一定的差異。 圖 2 葡萄 PP2C 家族基因結(jié)構(gòu) Fig. 2 Structures of PP2C gene family in grape 2.4 葡萄 PP2C 家族基因 motif 序列分析 在葡萄 PP2C 家族基因中共找到了 15 個(gè) motif（表 3）。 如圖 3 所示，除 VvPP2C07 外，其余 26 個(gè) VvPP2C 均包含 motif1、 motif2、 motif8。 motif12、motif13、 motif15 主要分布于 C 亞族中的 VvPP2C04 和 VvPP2C24 上。 motif3、 motif7、 motif9 主要分布于 C 和 D 亞族中的部分成員。 motif5、 motif6 除 K 亞族外，其他亞族的 VvPP2C 中均有分布。motif10 僅分布于 D 亞族。 motif14 主要分布于 A、 G、 H 亞族。分析發(fā)現(xiàn) C 亞族包含的 motif 最多，K 亞族包含的 motif 最少。 何紅紅，路志浩，馬宗桓，梁國(guó)平，馬麗娟，萬(wàn) 鵬，毛 娟 . 葡萄 PP2C 家族基因的鑒定與表達(dá)分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (7)： 1237 1250. 1243 表 3 葡萄 PP2C 蛋白氨基酸保守序列 Table 3 Conserved motifs of PP2C proteins in grape 保守基序編號(hào) Conserved motif 長(zhǎng)度 /bp Length 氨基酸保守序列 Amino acid conserved sequence motif1 29 RLSPEDEFLILASDGLWDVLSNZEAVDIV motif2 1 VVJICGRTLYVANVGDSRAVL motif3 50 PRGDPAQHLVEEALFRAAKKRGMDYHELLKIPRGDRRHYHDDITVIVISL motif4 21 EPDGTFFGVYDGHGGPDAADFmotif5 KGGLAVSRAIGDGYLKQPKVN motif6 21 GVAIQLSVDHKPNCEEERERI motif7 41 HSDVLDVJSKALRATEESFLSJVDKQVMERPZJASVGSCVL motif8 11 PDDITVVVVDI motif9 21 FRIDYVGTSPYJSCEPSLYVH motif10 29 LLWYKDLGQHVNGDFSMAVIQANNLLEDQ motif11 21 KNLQAAQGKKGEDRVLMVVSE motif12 50 CFTGEGGARRRQDISVLISDPLDEGLGHSFCYIRPDQSRLSSSKVHSEET motif13 41 WDDKHESNPRKKGKNSKNKYKGAAKKWEENQRRWKCEWDRE motif14 41 LPFIVEDEEWPQAJPRALVAAFVKTDIAFQEASSTSGTSAT motif15 50 TSFTSIPLQPIPRNWMNSGPIPGSPLEKSSTDQFQRSYSHGGFAFRPRSR 圖 3 葡萄 PP2C 家族 motif（ 1 15）分析 Fig. 3 Motif analysis of PP2C gene family in grape 2.5 葡萄 PP2C 家族基因亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 葡萄 PP2C 基因家族集中在細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和細(xì)胞核中表達(dá)（表 4） 。在線(xiàn)粒體、液泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞膜和細(xì)胞基質(zhì)中有少量表達(dá)，在細(xì)胞骨架和過(guò)氧化物酶體中均不表達(dá)，只有 VvPP2C12 在高爾基體中表達(dá)。推測(cè)，其表達(dá)部位的不同可能與其執(zhí)行的功能有關(guān)。 Genome-wide identification and expression analysis of the PP2C gene family in Vitis vinifera. He Honghong， Lu Zhihao， Ma Zonghuan， Liang Guoping， Ma Lijuan， Wan Peng， Mao Juan. 1244 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (7)： 1237 1250. 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明：葡萄 PP2C 家族基因編碼的 27 個(gè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以 螺旋和不規(guī)則卷曲為主（表 5）。 表 4 葡萄 PP2C 基因亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) Table 4 Subcellular location prediction of PP2C gene in grape 基因 Gene 細(xì)胞質(zhì) Cytoplasm 葉綠體 Chloroplast 細(xì)胞核 Nucleus 線(xiàn)粒體 Mitochondria 過(guò)氧化物酶體 Peroxisome 細(xì)胞骨架 Cytoskeleton VvPP2C01 10.5 2.5 VvPP2C02 5 2 5 VvPP2C03 2 9 2 VvPP2C04 1 2 9 1 Vv</p>
京公網(wǎng)安備 11010502048994號(hào)
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