2018年第 6期 CHINA PLANT PROTECTION 20 18,VoI. 38.No. 6研 究 報 告 解 淀粉芽孢桿菌 B6 防治 西瓜枯萎病及對西瓜幼苗 抗氧化酶的誘導(dǎo)作用 王 靜 ， 寧燕夏 ， 糟雪云 ， 李 敏 ， 司海麗 ， 楊國平 ， 張 琇 （ 北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 ， 寧夏銀川 750021 ） 摘要 ： 從寧夏中衛(wèi)硒砂瓜連作土壤中分離篩選出一株對尖孢鐮刀菌 （ Fusarium oxysporum f . sp . niveum ） 有抑制作用 的菌株 B6， 研究了其生物防治效果及誘導(dǎo)西瓜幼苗超氧化物岐化酶 （ SOD ） 及過氧化物酶 （ POD ） 的規(guī)律 。 經(jīng)單菌落形 態(tài)鑒定和 16S rDNA 序列分析 ， 拮抗菌株 B6為解淀粉芽孢桿菌 （ Bacillus amyloliquefaciens ）。 拮抗菌株 B6皿內(nèi)抑菌 試驗顯示其能夠抑制尖孢鐮刀菌生長 ， 抑菌率達 50 。 溫室盆栽試驗表明 ， 拮抗菌 B6對西瓜枯萎病的防效達 88.89 。 B6發(fā)酵液澆灌西瓜幼苗 ， 能夠誘導(dǎo)幼苗中 SOD 及 POD 升高 。 尖孢鐮刀菌侵染 B6預(yù)處理幼苗 ， 1h 后幼苗中 SOD 活性達最大值 1 .07 nmol/s ， 6 h 后 POD 活性達最大值 0 .73 nmol/s ，較對照升高更早 ， 活性更強 。 關(guān)鍵詞 ： 解淀粉芽孢桿菌 ； 西瓜枯萎病 ； 抑菌率 ； SOD ； POD 中圖分類號 ： S436.421.13文獻標識碼 ： A 文章編號 ： 1672-6820 （ 2018 ） 06-0005-06 ControI efficiency of Bacillus amyloliquefaciens B6 against watermeIon wiIt and its induction effect on POD and SOD of watermeIon seedIing Wang Jing, Ning Yanxia, Zao Xueyun, Li Min, Si Haili, Yang Guoping, Zhang Xiu （ College of Biological Science and Engineering, North Minzu University, Yinchuan Ningxia 750021, China ） Abstract: A bacterial strain B6 with well inhibition ability to Fusarium oxysporum f. sp. niveum was isolated from soil collected in watermelon field of Zhongwei, Ningxia. The control efficiency and protection enzyme activity of watermelon seedling induced by B6 were detected. B6 strain was identified as Bacillus amyloliquefaciens by 16S rDNA sequence analysis. The tablet confrontation training method showed B6 had high inhibitive effect on F. oxysporum f. sp. niveum with inhibition rate of 50. In addition, the fermentation broth of B6 strain exhibited 88.89 control efficiency against this watermelon disease through root -drenching pot assay. After root -drenching of B6 fermentation, SOD and POD activity of watermelon seedling were increased. Then spore solution of F. oxysporum f. sp. Niveum was treated, and the SOD activity of seedling reached the highest level of 1.07 nmol/s one hour later, and the activity of POD reached the highest level of 0.73 nmol/s after 6 hours. Key words: Bacillus amyloliquefaciens ; Watermelon wilt; inhibition rate; SOD; POD 收稿日期 ： 2017-11-30 ； 修回日期 ： 2018-03-28 基金項目 ： 寧夏高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究項目 （ NGY2016138）； 寧夏科技支撐計劃項目 （ 重大專項 ） 寧科技字 （ 2015 ） 26號 ； 北方民族大學(xué)人 才引進啟動項目 （ 4400302550 ） 作者簡介 ： 王靜 ， 博士 ， 講師 ， 主要從事植物逆境生物學(xué)與分子調(diào)控研究 。 E - mail ： wangjing_imu163 .com 。 5 2018 年第 6 期 CHINA PLANT PROTECTION 20 1 8,VoI. 38 .No. 6 解淀粉芽孢桿菌是一類植物根際益生菌 ， 能夠 促進植物生長 ， 防治土傳病害 ， 是開發(fā)生物防治菌劑 的重要資源 。 我國總耕地面積 1 216.66萬 hm 2 ， 所屬 地區(qū)的氣候 、 地理 、 土壤等自然條件差異大 ， 孕育了 豐富的微生物資源 ， 篩選及合理開發(fā)適宜特定地區(qū) 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的生防菌株 ， 不僅是對微生物菌種資源的 保護 ， 還對農(nóng)業(yè)經(jīng)濟綠色發(fā)展至關(guān)重要 。 土壤中 ， 植物根系分泌營養(yǎng)物質(zhì) ， 多種微生物 互相競爭 ， 與植物共同生長 ， 形成了復(fù)雜的根際系 統(tǒng) 1 。 在根際系統(tǒng)中 ， 微生物的定殖能力決定其能否 發(fā)揮作用 。 一些具有生物防治作用的解淀粉芽孢桿 菌能在番茄 2 、 棉花 3 、 小麥 4 、 白菜 、 煙草 5及香蕉 6 根際成功定殖并能抑制病害發(fā)生 。 解淀粉芽孢桿菌 FZB42 T 是商品化的生物防治菌劑 ， 也是研究生防菌 生防機制及菌株與植物互作的重要材料 。 分析其基 因組序列后發(fā)現(xiàn) 10 的基因參與抗菌素的合成 ， 可 直接抑制土壤中多種病原微生物的生長 7 。 不僅如 此 ， 細胞內(nèi)合成的一些揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物 ， 例如 3-羥基丁酮 、 2-氨基苯甲酸及脂肽等還可作為激活 因子誘導(dǎo)植物產(chǎn)生免疫反應(yīng) 8-9 ， 增強植物對病原微 生物的抗性 。 Chowdhury 等人追蹤研究發(fā)現(xiàn)噴施解 淀粉芽孢桿菌菌劑后幾乎不會影響根際土壤中微生 物群落組成 1 0 。 因此 ， 解淀粉芽孢桿菌是重要的綠色 生防菌劑候選菌株 。 寧夏西瓜長于砂田 ， 富含多種微量元素 ， 是寧夏 地區(qū)傳統(tǒng)特色 優(yōu)勢 產(chǎn)業(yè) 。 連 作地種植 模式使 土壤生 態(tài)環(huán)境惡 化 ， 極易 發(fā)生 嚴 重土傳性病害 1 1 。 西瓜 枯萎 病是 由尖 孢 鐮刀 菌 侵染 所 致 1 2-13 ， 一 旦 發(fā)病 很難控 制 ， 是影響西瓜產(chǎn)量的 主 要因素 之 一 。 B6是 本課題 組 前期從 寧夏中 衛(wèi) 地區(qū)西瓜 連 作多 年 的土壤中篩選 獲得 的菌株 ， 對 尖 孢 鐮刀 菌具有 良好拮 抗作用 。 本文 研究了 該 菌對西瓜 枯萎 病的防治 效果以 及對西瓜 幼 苗 中抗 氧 化 酶 的影響 ， 評價 其生物防治 潛 力 并探討 可能的作用機制 ， 為開發(fā)適宜寧夏砂田耕作區(qū)生物 防治菌劑 奠 定 試驗 基 礎(chǔ) 。 1 材料與方法 1 .1 供試材料 拮 抗菌株 B6分 離 自寧夏中 衛(wèi) 地區(qū)的西瓜 連 作 多 年 的土壤中 ， 致 病菌 尖 孢 鐮刀 菌分 離 自發(fā)病西瓜 根 部 ， 菌株 均由本實驗室 保 存 。 B6于 - 80 凍存 ， 尖 孢 鐮刀 菌于 4 保 存 。 供試 西瓜品種 金城 5號 為寧 夏地區(qū) 主栽 品種 ， 購 自寧夏農(nóng)業(yè) 科學(xué)院 。 1 .2 B6 形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定 皿 內(nèi) 劃線培 養(yǎng) B6單 菌落 ， 進 行 形 態(tài)學(xué) 、 革蘭氏 染 色 觀察 及 16S rDNA 基因序列分析 。 選 擇通 用 引 物 ， 以 B6菌株基因組 DNA 為 模板 ， 擴 增 16S rDNA 序列 ， 回收 PCR 產(chǎn)物 ， 測 序 。 將測 序 結(jié)果輸入 NCBI 數(shù)據(jù)庫 ， 進 行 同源性 比較 ， 并 用 MEGA5 .0軟 件 構(gòu)建 系統(tǒng)發(fā)育 樹 。 1 .3 皿內(nèi)拮抗試驗 將 保 藏 的 尖 孢 鐮刀 菌 轉(zhuǎn) 接 到 PDA 培 養(yǎng)基 平板 上 ， 用 5 mm 滅 菌 打孔器 在病原菌菌落 邊緣打孔 ， 將 菌 餅轉(zhuǎn) 接至 新 的 PDA 平板 中 央 ， 30 靜置培 養(yǎng) 24 h ， 將 菌株 B6點 接在 距離 菌 餅 25 mm 處 ， 每皿 接 4 個點 ， 重復(fù) 3次 。 另點 接 無 菌 水 為 空 白對 照 。 28 靜 置培 養(yǎng) 2 d ， 觀察拮 抗 效果 ， 計算 抑菌 率 1 4 。 抑菌 率 （ ） =（ 對 照 病原菌直 徑 -對 峙拮 抗菌的 病原菌直 徑 ） /對 照 病原菌直 徑 100 1 .4 盆栽防效試驗 將滅 菌土與 尖 孢 鐮刀 菌 按照 301 （ W/V ）（ 尖 孢 鐮刀 菌 濃度 為 1 10 5 cfu/mL ） 比 例 混 合 ， 拌勻 。 將露 白西瓜種子 ， 平鋪 在土 表 面 。 處 理組 ： 每粒 種子 周圍 施 入 1 mL （ 1 10 8 cfu / mL ） B6孢子 懸浮液 ； 對 照 組 ： 施 無 菌 水 。 每盆播 種 6粒露 白種子 ， 每個處 理 各 5 盆 ， 置 于 日光溫室培 養(yǎng) 20 d ， 觀察幼苗 發(fā)病 情況 ， 計 算 病 情指數(shù)和 相對防治 效果 1 5 。 病 情指數(shù) = （ 各級 病 葉數(shù) 各級 代 表數(shù)值 ） / 葉片 總 數(shù) 最高 代 表級值 100 防病 效果 （ ） =（ 對 照 組病 情指數(shù) - 處 理組病 情指數(shù) ） /對 照 組病 情指數(shù) 100 1 .5 B6 對西瓜幼苗 SOD 和 POD 酶活影響分析 取露 白西瓜種子 ， 播 種于育 苗盆 ， 放入日光溫 室培 養(yǎng) 。 待幼苗 長 出 2片真葉 后 ， 處 理組 沿幼苗 根 部 施 入 1 mL （ 1 10 8 cfu/mL ） B6菌 液 ， 對 照 組施 無 菌 水 。 每個處 理 30個 重復(fù) 。 分 別 于施 B6菌 液 及 無 菌 水 的 第 0、 1、 3天和第 5天取幼苗真葉 。 每 次 每 組 取 3個 重復(fù) ， 測 定 葉片 SOD 及 POD 酶 活 。 待 施 入 B6及 無 菌 水 5 d 后 ， 沿 西瓜 幼苗 根 部澆灌尖 孢 鐮 刀 菌孢子 懸液 ， 菌 液濃度 為 1 10 5 cfu/mL 。 分 別 于 6 2018 年第 6 期 CHINA PLANT PROTECTION 20 18 ,VoI. 38 .No. 6 圖 2 菌株 B6 與其他相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹 澆灌病原菌后的 0 、 1、 3、 6、 12 h 和 24 h 取西瓜幼 苗真葉 。 每次每組取 3個重復(fù) ， 測定葉片 SOD 及 POD 酶活 1 6 。 1 .6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用 Excell 軟件進行數(shù)據(jù)處理 、 分析與作圖 。 2 結(jié)果與分析 2 .1 拮抗菌 B6 的鑒定 經(jīng)培養(yǎng) ， 觀察 B6菌株單菌落形態(tài) 。 菌落中間有 突起 ， 邊緣不整齊且干燥 、 不透明 （ 圖 1 a ）。 菌體呈 桿狀 ， 革蘭氏染色為陽性 （ 圖 1 b ）。 37 培養(yǎng) 36 h 后可產(chǎn)生大量芽孢 。 經(jīng) 16S rDNA 基因序列測定 ， 與 GenBank 數(shù)據(jù)庫中其他相似序列進行核酸序列同源 性比較 ， 采用 MEGA 5 .0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 （ 圖 2）。 B6 與解淀粉芽孢桿菌相似度最高 。 2 .2 拮抗菌 B6 皿內(nèi)抑菌效果 正常培養(yǎng) 3 d 的尖孢鐮刀菌 ， 菌落直徑可達 6.5 cm （ 圖 3 a ）。 解淀粉芽孢桿菌 B6與尖孢鐮刀菌共同 培養(yǎng) ， 尖孢鐮刀菌菌落直徑僅為 3.5 cm ， 抑菌率達 50 （ 圖 3 b ）。 B6具有良好的拮抗尖孢鐮刀菌生長 的效果 。 2 .3 拮抗菌株 B6 對尖孢鐮刀菌引起的西瓜枯萎病 的防效 解淀粉芽孢桿菌 B6 對尖孢鐮刀菌引起的西瓜 a. 固體 LB 培養(yǎng)基 b. 革蘭氏染色 （ 1 000 ） 圖 1 拮抗菌株 B6 在固體 LB 培養(yǎng)基上形態(tài)和 革蘭氏染色顯微照片 a b 7 2018 年第 6 期 CHINA PLANT PROTECTION 20 1 8,VoI. 38 .No. 6 B6 CK 圖 4 解淀粉芽孢桿菌 B6 對尖孢鐮刀菌引起的 西瓜枯萎病盆栽試驗防效 枯萎病具有較好的防治效果 （ 圖 4）。 在含有尖孢鐮 刀菌的土壤中 ， 施加 B6 的西瓜幼苗長勢良好 ， 已長 出 3 4片嫩綠真葉 ， 病情指數(shù)為 8.33 0.7； 對照組 （ 無菌水 ） 西瓜幼苗出芽率低 、 且長勢差 ， 發(fā)病嚴重 ， 病情指數(shù)為 75.25 5.8。 B6 菌株的防治效果達 88 .89 。 2 .5 B6 對西瓜幼苗 SOD 及 POD 酶活的影響 施加 B6 后西瓜幼苗中 SOD 及 POD 酶活均呈 現(xiàn)先升高后降低趨勢 ， SOD 酶活在施加 B6 菌液 1 d 達到最大值 0.84 nmol/s ， POD 酶活在施加 B6 菌液 3 d 達最大值 0.35 nmol/s ， 分別如圖 5 a 、 b 所示 。 B6 預(yù)處理的幼苗對尖孢鐮刀菌更敏感 ， 在施加 尖孢鐮刀菌后 SOD 酶活迅速升高 ， 1 h 達到最大值 1.07 nmol/s ， 隨后酶活降低又升高 ， 12 h 達到檢測第 2大值 1.01 nmol/s 。 而未經(jīng) B6 預(yù)處理的幼苗在施加 尖孢鐮刀菌后 ， SOD 酶活在 3 h 達到最大值 0.82 nmol/s ， 隨后酶活逐漸下降 ， 且未出現(xiàn) SOD 酶活再次 升高現(xiàn)象 ， 如圖 5 c 所示 。 經(jīng)過 B6 預(yù)處理的幼苗在 施加尖孢鐮刀菌 1 h 后 ， POD 酶活開始升高 ， 6 h 達 最大值 0.73 nmol/s ， 隨后 ， 酶活逐漸下降 。 而未經(jīng) B6 預(yù)處理的西瓜幼苗在施加尖孢鐮刀菌 3 h 后 POD 酶活開始升高 ， 12 h 達最大值 0.65 nmol/s ， 隨后酶 活逐漸下降 ， 如圖 5 d 所示 。 可見 ， 施加尖孢鐮刀菌 后 ， B6 預(yù)處理的幼苗較對照更早表達 SOD 及 POD ， 且兩種酶活性更強 。 a. 未加拮抗菌的尖孢鐮刀菌 b. 加入拮抗菌 B6 后的尖鏈孢菌 圖 3 解淀粉芽孢桿菌 B6 對尖孢鐮刀菌的抑制效果 a b 8 2018 年第 6 期 CHINA PLANT PROTECTION 20 18 ,VoI. 38 .No. 6 1.2 0.9 0.6 0.3 0 a S O D酶 活 （ n m o l /s ） H2O B6 b 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 P O D酶 活 （ n m o l /s ） H2O B6 0 1 3 5 0 1 3 5 時間 （ d ） 時間 （ d ） c d 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 S O D酶 活 （ n m o l /s ） H2O B6 H2O B6 0.9 0.6 0.3 0 P O D酶 活 （ n m o l /s ） 0 1 3 6 12 24 0 1 3 6 12 24 時間 （ h ） 時間 （ h ） a.施加 B6后 SOD 的變化 b.施加 B6后 POD 的變化 c.施加尖孢鐮刀菌后 SOD 的變化 d.施加尖孢鐮刀菌后 POD 的變化 圖 5 解淀粉芽孢桿菌 B6 對西瓜枯萎病的誘導(dǎo)活性 3 討論 植物根際益生菌是一類能在植物根際定殖并具 有促進植物生長或防控病害能力的有益微生物 1 6 ， 能夠分泌抗菌素直接抑制病原菌生長 ， 可與病原菌 競爭植物表面結(jié)合位點 ， 造成植物與病原菌空間的 隔離 ， 還可通過激活植物免疫系統(tǒng)增強對病原微生 物的抵御能力 1 8 。 目前 ， 已經(jīng)開發(fā)出多種以根際植物 益生菌為主要成分商品化的生防菌劑 。 據(jù)美國市場 研究公司調(diào)查 ， 2013 年全球市場采購生防菌劑耗資 54. 8千萬美元 ， 2019 年預(yù)計將增長到 83 . 7 千萬美 元 ， 生防菌劑對農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展起著越來越重要 的作用 1 9 。 對商品化的解淀粉芽孢桿菌 FZB42 T 的研 究表明 ， 基因組中有 10 個基因簇參與合成抗菌類物 質(zhì) ， 例如環(huán)脂肽 、 聚酮化合物以及高度修飾的細菌素 等 1 0 。 本實驗室前期篩選出的解淀粉芽孢桿菌 B6 不僅在培養(yǎng)皿內(nèi)具有良好的抑制尖孢鐮刀菌生長作 用 ， 且在盆栽試驗中 ， 防治枯萎病效果達 88. 89 ， 具 有極佳商業(yè)推廣及基礎(chǔ)研究價值 。 可根據(jù)已發(fā)表的 研究數(shù)據(jù)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組 、 蛋白質(zhì)組及 HPLC 等多種分 析技術(shù) ， 深入研究 B6防治枯萎病的機制 ， 為其商品 化提供重要的理論支撐 。 植物益生菌發(fā)揮生物防治作用 ， 可通過以下 方式實 現(xiàn) ， 如與病原菌爭 奪 植物的結(jié)合位點 、 合成 生長素類物質(zhì)促進植物生長以及分泌 信號 分 子誘 導(dǎo) 植物 產(chǎn) 生 先天 免疫 反應(yīng) 20 。 在研究 蠟樣 芽 胞 桿 菌 AR156 生防作用時 也得 到 了 類 似 結(jié)果 ， AR156 能夠 誘導(dǎo)擬南芥產(chǎn) 生免疫 反應(yīng) ， 迅速 合成過 氧 化 氫 及防御 相關(guān) 的抗 氧 化酶 SOD 和 POD ， 誘導(dǎo) 抗病 基因 PR1 、 PR2 、 PR5 以及 MPK6 迅速表 達 ， 最終 增 強 擬南芥 對 丁香假單胞 菌的抵抗能力 21 。 有研究 表 明 ， 解淀粉芽孢桿菌通過 次 生 代謝產(chǎn) 物 表 面活 性 素 （ sufactin ） 誘導(dǎo) 植物 產(chǎn) 生 早 期免疫 反應(yīng)并 增強 對病原菌的抵抗能力 22 。 本試驗中 ， 預(yù) 先 施 加 解淀 粉芽孢桿菌 B6， 能夠 誘導(dǎo)西瓜幼苗 SOD 和 POD 酶活 升 高 ， 再 施 加 尖孢鐮刀菌 ， 幼苗 中 SOD 和 POD 酶活 會更早 、 更 強 烈 的 表 達 ， 激發(fā) 幼苗 抵抗病原菌 的 潛 力 。 9 2018 年第 6 期 CHINA PLANT PROTECTION 20 1 8,VoI. 38 .No. 6 參考文獻 1 Kloepper J W ， Leong J ， Teintze M ， et al . 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