中 國(guó) 農(nóng) 學(xué) 通 報(bào) 第 2 3 卷 第 5 期 2 0 0 7 年 5 月h t t p : / / w w w . c a s b . o r g . c n中 國(guó) 農(nóng) 學(xué) 通 報(bào) 第 2 3 卷 第 5 期 2 0 0 7 年 5 月h t t p : / / w w w . c a s b . o r g . c n中 國(guó) 農(nóng) 學(xué) 通 報(bào) 第 2 3 卷 第 5 期 2 0 0 7 年 5 月h t t p : / / w w w . c a s b . o r g . c n中 國(guó) 農(nóng) 學(xué) 通 報(bào) 第 2 3 卷 第 5 期 2 0 0 7 年 5 月h t t p : / / w w w . c a s b . o r g . c n園 藝 園 林 科 學(xué)園 藝 園 林 科 學(xué)雜 種 優(yōu) 勢(shì) 利 用 是 目 前 大 白 菜 育 種 的 重 要 方 法 之一 。 選 育 、 利 用 細(xì) 胞 質(zhì) 雄 性 不 育 系 可 解 決 雜 交 制 種 的人 工 去 雄 不 徹 底 的 問(wèn) 題 ， 確 保 種 子 純 度 ， 并 可 使 制 種成 本 降 低 ， 利 于 優(yōu) 良 品 種 的 推 廣 利 用 ， 因 而 細(xì) 胞 質(zhì) 雄性 不 育 系 在 大 白 菜 雜 種 優(yōu) 勢(shì) 利 用 方 而 具 有 極 其 重 要的 意 義 。 目 前 ， 國(guó) 內(nèi) 外 己 選 育 出 一 些 穩(wěn) 定 的 大 白 菜 細(xì)胞 質(zhì) 雄 性 不 育 系 ， 并 成 功 地 應(yīng) 用 于 新 品 種 的 選 育 。找 到 并 分 離 出 細(xì) 胞 質(zhì) 雄 性 不 育 基 因 是 目 前 科 學(xué)家 們 正 在 探 索 的 課 題 。 與 細(xì) 胞 質(zhì) 雄 性 不 育 基 因 連 鎖 的D N A 標(biāo) 記 為 細(xì) 胞 質(zhì) 雄 性 不 育 基 因 的 定 位 與 克 隆 提 供了 極 具 有 用 的 工 具 。 大 白 菜 細(xì) 胞 質(zhì) 雄 性 不 育 系 與 保 持系 為 近 等 基 因 系 。 本 研 究 根 據(jù) 近 等 基 因 系 分 析 1 原理 ， 應(yīng) 用 R A P D 技 術(shù) 2 鑒 定 了 與 大 白 菜 細(xì) 胞 質(zhì) 雄 性 不育 基 因 相 連 鎖 的 R A P D 標(biāo) 記 以 及 與 保 持 系 中 保 持 基因 相 連 鎖 的 R A P D 標(biāo) 記 ， 并 對(duì) 與 大 白 菜 細(xì) 胞 質(zhì) 雄 性 不育 基 因 相 連 鎖 的 R A P D 標(biāo) 記 進(jìn) 行 了 克 隆 與 序 列 分 析 。1 材 料 與 方 法1 . 1 材 料供 試 材 料 為 1 對(duì) 大 白 菜 胞 質(zhì) 雄 性 不 育 系 及 其 保持 系 ， 即 帶 有 O u g r a 胞 質(zhì) 的 胞 質(zhì) 雄 性 不 育 系 C M S - 2大 白 菜 細(xì) 胞 質(zhì) 雄 性 不 育 特 異 R A P D 標(biāo) 記 的 篩 選林 義 章1, 馮 冬 林1, 陳 文 輝2, 林 碧 英1（1福 建 農(nóng) 林 大 學(xué) 園 藝 學(xué) 院 ， 福 建 福 州 3 5 0 0 0 2 ；2福 州 市 蔬 菜 科 學(xué) 研 究 所 ， 福 建 福 州 3 5 0 0 0 3 ）摘 要 : 根 據(jù) 近 等 基 因 系 分 析 原 理 , 以 大 白 菜 細(xì) 胞 質(zhì) 雄 性 不 育 系 C M S - 2 及 其 保 持 系 B - 2 為 材 料 . 對(duì) 大白 菜 細(xì) 胞 質(zhì) 雄 性 不 育 基 因 及 其 保 持 基 因 進(jìn) 行 R A P D 標(biāo) 記 研 究 。 引 物 S 3 9 1 在 不 育 系 中 有 特 異 性 擴(kuò) 增 ,得 到 一 條 約 7 0 0 b p 的 特 異 片 斷 ; 引 物 S 4 2 5 在 保 持 系 中 有 特 異 性 擴(kuò) 增 , 得 到 一 條 約 6 0 0 b p 的 特 異 片 , 分別 命 名 為 S 3 9 1 - 7 0 0 b p 、 S 4 2 5 - 6 0 0 b p 。 采 用 B l a s t n 進(jìn) 行 核 苷 酸 同 源 序 列 比 較 , 結(jié) 果 發(fā) 現(xiàn) S 3 9 1 - 7 0 0 b p 存 在一 個(gè) 開(kāi) 放 閱 讀 框 架 , 這 一 開(kāi) 放 閱 讀 框 架 與 植 物 葉 綠 體 絲 氨 酸 乙 酰 基 轉(zhuǎn) 移 酶 D N A 部 分 片 段 有 很 高 的 同源 性 ; S 4 2 5 - 6 0 0 b p 是 新 發(fā) 現(xiàn) 的 一 段 D N A 序 列 。 根 據(jù) 測(cè) 序 結(jié) 果 設(shè) 計(jì) 特 異 引 物 , 結(jié) 果 表 明 本 研 究 所 獲 得的 兩 個(gè) 標(biāo) 記 片 斷 都 能 確 定 其 特 異 性 。關(guān) 鍵 詞 : 大 白 菜 ; 細(xì) 胞 質(zhì) 雄 性 不 育 ; R A P D ; 不 育 系中 圖 分 類(lèi) 號(hào) : Q 9 4 6 - 3 3 文 獻(xiàn) 標(biāo) 識(shí) 碼 : AT h e I s o l a t i o n o f S p e c i f i c R A P D M a r k e r R e l a t e d t o C y t o p l a s m i c M a l e S t e r i l i t yL i n e o f C h i n e s e C a b b a g e ( B r a s s i c a c a m p e s t r i s s s p . P e k i n e n s i s )L i n Y i z h a n g1, F e n g D o n g l i n1, C h e n w e n h u i2, L i n B i y i n g1(1C o l l e g e o f H o r t i c u l t u r e , F u j i a n A g r i c u l t u r e a n d F o r e s t r y U n i v e r s i t y , F u z h o u 3 5 0 0 0 2 ;2F u z h o u I n s t i t u t e o f V e g e t a b l e R e s e a r c h , F u z h o u 3 5 0 0 0 3 )A b s t r a c t : A c c o r d i n g t o t h e i s o g e n i c l i n e a n a l y s i s t h e o r y , R A P D a n a l y s i s w a s u n d e r t a k e n i n t h e c y t o p l a s mm a l e s t e r i l e ( C M S ) l i n e C M S - 2 a n d i t s m a i n t a i n e r l i n e B - 2 i n C h i n e s e c a b b a g e . A n d g e t t w o s p e c i a la m p l i f i e d f r a g m e n t o f S 3 9 1 - 7 0 0 b p a n d S 4 2 5 - 6 0 0 b p S e p a r a t e i n s t e r i l e l i n e a n d i t s m a i n t a i n e r l i n e . T h er e s u l t s s h o w e d t h e r e i s a o p e n r e a d i n g f r a m e i n S 3 9 1 - 7 0 0 b p a n d t h e i d e n t i t i e s i s h i g h b e t w e e n S 3 9 1 -7 0 0 b p a n d c h l o r o p l a s t s e r i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e g e n e ； A n d t h e S 4 2 5 - 6 0 0 b p i s a n e w D N A f r a g m e n t .K e y w o r d s : C h i n e s e c a b b a g e , C y t o p l a s m m a l e s t e r i l e , R A P D , M a l e s t e r i l e l i n e基 金 項(xiàng) 目 : 福 建 省 科 技 廳 計(jì) 劃 項(xiàng) 目 “ 十 字 花 科 主 要 蔬 菜 品 種 選 育 和 出 口 蔬 菜 生 產(chǎn) 加 工 標(biāo) 準(zhǔn) 化 安 全 體 系 建 設(shè) ”（ 2 0 0 3 N 0 2 2 ） 。第 一 作 者 簡(jiǎn) 介 : 林 義 章 ， 男 ， 1 9 5 6 年 出 生 ， 副 教 授 ， 碩 士 研 究 生 導(dǎo) 師 ， 福 建 農(nóng) 林 大 學(xué) 設(shè) 施 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 與 工 程 系 主 任 ， 福 建 農(nóng) 林 大 學(xué) 蔬 菜 研 究 所 所 長(zhǎng) ， 從 事 蔬 菜教 學(xué) 和 科 研 工 作 ， T e l ： 0 5 9 1 - 8 3 7 8 9 3 7 9 ， E - m a i l : l y z 2 0 0 3 0 0 7 1 6 3 . c o m 。收 稿 日 期 : 2 0 0 7 - 0 1 - 3 0 ， 修 回 日 期 ： 2 0 0 7 - 0 2 - 2 6 。2 6 7 C h i n e s e A g r i c u l t u r a l S c i e n c e B u l l e t i n V o l . 2 3 N o . 5 2 0 0 7 M a yh t t p : / / w w w . c a s b . o r g . c nC h i n e s e A g r i c u l t u r a l S c i e n c e B u l l e t i n V o l . 2 3 N o . 5 2 0 0 7 M a yh t t p : / / w w w . c a s b . o r g . c nC h i n e s e A g r i c u l t u r a l S c i e n c e B u l l e t i n V o l . 2 3 N o . 5 2 0 0 7 M a yh t t p : / / w w w . c a s b . o r g . c nC h i n e s e A g r i c u l t u r a l S c i e n c e B u l l e t i n V o l . 2 3 N o . 5 2 0 0 7 M a yh t t p : / / w w w . c a s b . o r g . c n及 其 保 持 系 B - 2 ， 由 福 州 市 蔬 菜 科 學(xué) 研 究 所 提 供 。1 . 2 方 法1 . 2 . 1 大 白 菜 總 D N A 的 提 取 種 子 經(jīng) 常 規(guī) 消 毒 播 種后 ， 取 幼 苗 的 幼 嫩 真 葉 ， 大 白 菜 總 D N A 的 提 取 方 法 主要 參 考 江 昌 俊 、 王 永 飛 、 P i c h , U 3 5 等 人 的 方 法 并 稍 作修 改 。1 . 2 . 2 R A P D 分 析 R A P D 反 應(yīng) 在 P C R 擴(kuò) 增 儀 （ G e -n e A m pRP C R S y s t e m 2 7 0 0 ） 上 進(jìn) 行 ， 建 立 了 適 合 于 大 白菜 基 因 組 D N A 的 R A P D 分 析 的 反 應(yīng) 體 系 ： 在 2 5 L反 應(yīng) 體 系 中 ， 5 0 n g 的 模 板 D N A ， 2 . 5 m m o l / L 的 M g2 2 . 5 L ， 2 . 5 m m o l / L d N T P s 1 L ， 1 0 m o l / L 隨 機(jī) 引物 1 L ； 1 . 5 U T a q D N A 聚 合 酶 ； 1 0 b u f f e r 2 . 5 L 。9 4 預(yù) 變 性 5 m i n 后 執(zhí) 行 9 4 3 0 S ， 3 5 4 5 S ， 7 2 7 0 S 4 5 個(gè) 循 環(huán) ， 最 后 7 2 再 延 伸 7 m i n 。 取 8 1 擴(kuò)增 產(chǎn) 物 用 于 1 . 0 % 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 分 析 觀 察 、 攝 像 。1 . 2 . 3 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 的 克 隆 與 D N A 序 列 測(cè) 定 采 用 低 熔點(diǎn) 瓊 脂 糖 法 回 收 R A P D 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 中 的 特 異 片 段 ， 回 收產(chǎn) 物 用 p M D 1 8 - T V e c t o r 載 體 連 接 ， 轉(zhuǎn) 化 E . c o l i D H 5 菌 . 用 X - g a l 和 I P T G 篩 選 重 組 子 ， 并 進(jìn) 行 酶 切 鑒 定 。 將培 養(yǎng) 的 菌 落 ( 經(jīng) 篩 選 確 認(rèn) 含 有 所 需 的 片 段 ) 穿 刺 培 養(yǎng)于 1 . 5 m 1 的 離 心 管 中 ， 將 鑒 定 的 連 接 有 目 的 片 段 的 菌液 送 至 上 海 博 亞 公 司 進(jìn) 行 測(cè) 序 。2 結(jié) 果 與 分 析2 . 1 大 白 菜 細(xì) 胞 質(zhì) 雄 性 不 育 基 因 及 其 保 持 基 因 的R A P D 分 析以 作 者 所 建 立 的 適 于 大 白 菜 R A P D 分 析 的 體 系為 基 礎(chǔ) ， 采 用 1 0 0 個(gè) 隨 機(jī) 引 物 對(duì) 大 白 菜 細(xì) 胞 質(zhì) 雄 性 不育 基 因 以 及 保 持 系 中 的 保 持 基 因 展 開(kāi) 了 R A P D 研 究 。結(jié) 果 表 明 ， 在 引 物 S 3 9 1 的 R A P D 擴(kuò) 增 中 ， 發(fā) 現(xiàn) 不 育 系比 保 持 系 多 了 一 條 帶 ， 大 小 約 為 7 0 0 b p （ 圖 1 ） ， 這 條D N A 擴(kuò) 增 譜 帶 可 能 與 雄 性 不 育 基 因 有 關(guān) ； 引 物 S 4 2 5的 R A P D 擴(kuò) 增 中 ， 發(fā) 現(xiàn) 保 持 系 比 不 育 系 多 了 一 條D N A 譜 帶 ( 圖 2 ) , 其 大 小 約 為 6 0 0 b p ， 這 這 條 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物可 能 與 保 持 系 中 的 保 持 基 因 有 關(guān) 。 在 此 將 這 二 個(gè) 標(biāo) 記分 別 命 名 為 S 3 9 1 - 7 0 0 b p 、 S 4 2 5 - 6 0 0 b p 。2 . 2 特 異 片 斷 的 克 隆R A P D 篩 選 獲 得 的 特 異 片 段 S 3 9 1 - 7 0 0 b p 、S 4 2 5 - 6 0 0 b p 、 經(jīng) 過(guò) 電 泳 ， 在 紫 外 燈 下 回 收 后 重 組 進(jìn)1 . m a i t a i n e r l i n e B - 2 2 . C M S - 2 1 . m a i t a i n e r l i n e B - 2 2 . C M S - 2M : L a m b d a D N A / E c o R H i n d M a r k e r M : L a m b d a D N A / E c o R H i n d M a r k e r圖 1 引 物 S 3 9 1 擴(kuò) 增 的 R A P D 圖 譜 圖 2 引 物 S 4 2 5 擴(kuò) 增 的 R A P D 圖 譜A : R A P D 擴(kuò) 增 S 3 9 1 - 7 0 0 b p 片 斷 A : R A P D 擴(kuò) 增 S 4 2 5 - 6 0 0 b p 片 斷B : E c o R I / H i n d 酶 切 重 組 質(zhì) 粒 C : 重 組 質(zhì) 粒 B : E c o R I H i n d 酶 切 重 組 質(zhì) 粒 C : 重 組 質(zhì) 粒M : L a m b d a D N A / E c o R H i n d M : L a m b d a D N A / E c o R H i n d 圖 3 雙 酶 切 含 S 3 9 1 - 7 0 0 b p 片 斷 的 重 組 質(zhì) 粒 圖 4 雙 酶 切 含 S 4 2 5 - 6 0 0 b p 片 斷 的 重 組 質(zhì) 粒園 藝 園 林 科 學(xué)2 6 8 中 國(guó) 農(nóng) 學(xué) 通 報(bào) 第 2 3 卷 第 5 期 2 0 0 7 年 5 月h t t p : / / w w w . c a s b . o r g . c n中 國(guó) 農(nóng) 學(xué) 通 報(bào) 第 2 3 卷 第 5 期 2 0 0 7 年 5 月h t t p : / / w w w . c a s b . o r g . c n中 國(guó) 農(nóng) 學(xué) 通 報(bào) 第 2 3 卷 第 5 期 2 0 0 7 年 5 月h t t p : / / w w w . c a s b . o r g . c n中 國(guó) 農(nóng) 學(xué) 通 報(bào) 第 2 3 卷 第 5 期 2 0 0 7 年 5 月h t t p : / / w w w . c a s b . o r g . c np M D 1 8 - T V e c t o r ， 提 取 重 組 質(zhì) 粒 。 E c o R I H i n d 雙 酶切 驗(yàn) 證 ， 其 中 一 條 帶 與 R A P D 擴(kuò) 增 所 獲 得 的 特 異 片 斷電 泳 距 離 相 近 ， 表 明 特 異 片 段 克 隆 成 功 ( 圖 3 ， 圖 4 ) 。2 . 3 特 異 片 斷 的 序 列 分 析1 A C T G A A C G C C G G G A G C G T A A A G A G C A A T C A T G C C T A G A T G T A T G T A T A C A A G T T T G T T G A6 1 C C A A A A A T G T C A C A A A G T T T T A T T T A T T T A T T T A T C C G A C C A A A A A A A T T T T A T T T A T T T1 2 1 A T T T A C T T T T T T A C T A A C A T A A G T T T T A T T G T A G T A T G G T T A A G A G A T T T T A T T T C A T A T1 8 1 A A A A T G T T G G C A T A T A A T G T T T A T T A T C T A G T A T T T C T G G C C A A C T C T A G A A A G A A G A A A2 4 1 A T A T T G T C G C C T G T T G T C A G T G T C T T G T C A C C A T A A A G A C G G C T T A T A T C T C T T T C T C T A3 0 1 T T A G A T T A T T T T T A C T T T T T T T G T C T G G T G A A T A T G A A A A C G C G T A A A T T A C G G A A A T A C3 6 1 A G A A G C C T T T T T A G T T C T C A C A T T A T T A T T T T T C T C A A C A T C G A T C A A T G A T T G T T C T C T4 2 1 C T T C T C T C T C T G C G T A A T T T G T C T T C T C A T G C G T G T A A A G A G G T A G A T C C T T C T G A G T T C4 8 1 T T G C A T G G T T C A G G T A C T T C T G T T T T G T T T T G T T T T T T C T T A T T A A C C T G T G T T C T T T C C5 4 1 T T G A A T C A T A C G T C G T G T A A A A G C C T T T T T T T T A T A T T A G T G A T G G G T G C T C G T G G C G T T6 0 1 C A G T2 . 3 . 2 隨 機(jī) 引 物 S 4 2 5 的 擴(kuò) 增 隨 機(jī) 引 物 S 4 2 5 的 序 列為 A C T G A A C G C C ， 特 異 片 斷 S 4 2 5 - 6 0 0 b p 序 列 如 下 ：該 片 斷 總 共 有 6 0 4 個(gè) 堿 基 ， 各 個(gè) 堿 基 數(shù) 為 ： A : 1 5 8個(gè) C : 9 4 個(gè) G : 1 0 0 個(gè) T : 2 5 2 個(gè) ； A : 2 6 . 2 % C : 1 5 . 6 % G :1 6 . 6 % T ： 4 1 . 7 % ； A T = 6 7 . 8 % , G C = 3 2 . 2 % , 將S 4 2 5 - 6 0 0 b p 序 列 采 用 B l a s t n 進(jìn) 行 核 苷 酸 同 源 序 列 比較 ， 結(jié) 果 顯 示 在 G e n e B a n k 中 有 3 1 條 來(lái) 自 于 其 它 生 物的 D N A 序 列 和 S 4 2 5 - 6 0 0 b p 序 列 有 部 分 的 同 源 性 ， 但同 源 性 位 點(diǎn) 片 斷 大 小 在 2 0 3 3 b p 之 間 ， E 值 為1 e - 0 7 8 . 1 > > 1 1 0- 5， 同 源 性 小 ， 這 說(shuō) 明 S 4 2 5 - 6 0 0 b p 是新 發(fā) 現(xiàn) 的 一 段 D N A 序 列 。2 . 4 標(biāo) 記 的 S C A R 轉(zhuǎn) 換根 據(jù) 目 的 片 斷 S 3 9 1 - 7 0 0 b p ， S 2 5 9 - 6 0 0 b p 對(duì) 不 育 系和 保 持 系 單 株 進(jìn) 行 S C A R 轉(zhuǎn) 化 分 析 ， 從 不 育 系 部 分 單株 中 擴(kuò) 增 出 了 特 異 條 帶 ， 大 小 與 目 的 片 段 基 本 一 致 ，而 保 持 系 單 株 則 均 沒(méi) 有 擴(kuò) 增 出 相 應(yīng) 的 特 異 條 帶 ( 圖5 ) ； 根 據(jù) 目 的 片 斷 S 4 2 5 - 6 0 0 b p 對(duì) 不 育 系 和 保 持 系 單 株1 A C G A T G A G C C G T A G G A T G T G T A G T A G A T A A G G A G A C T A A C T A T A T T A C A G G A A A T C A A G T6 1 C A A A G T T A C A A T A A T A A C T G C A A T G C G T C T T A C A T G T G T T G C T T G T C A T A T T A T T A A C C T1 2 1 A A C A A C T T T T T T C G T T A G A C A T G A A C A A A T A T A T A T A G T A C G C A A C A A T T T T A A A A T A A A1 8 1 A T C C A C A C A A A A A A C A T A C T T C A G T T C A G T A A A A G A A T A T T A C T A T T A C T A A G C A T C A T G2 4 1 T T G T C G G T C A G C A C A A G C C G T G G C C A T C T C C T A T A T A A G C T C T G T T C A T C T T C T T C T C C A3 0 1 C A T A A C A G C C A T T C C C T C C T C T C T T C T T C C A A T C A C A A A G A T T C A A T G G C T C C C T G C A T C3 6 1 G A C A C T T T C A G A A C A T G T A A A C C C C A G C T T T C T C A T G A A G A C A A C T C T C G G T T C T G T T A C4 2 1 A T G A A T C T C T T C C G A C C C G T T C A T C T C C C T T C A C G A G C A C C C A T C A C T A A C T C C C T G G A C4 8 1 G G T G G T G A T G T C T G G C T C A A G A T G C T T G A A G A A G C C A A A T C C G A C G T T G A G C A A G A A C C C5 4 1 A T T T T G T C A A G C T A C T A T C A C G C T T C C A T A A C A T C G C A T C C A T C G T T A G G T T C C G C T T T G6 0 1 G C G A A C A T T C T C T C G G T A A A G C T C A G C A C T T T A A C C T T A C C A A G C A A C A C C C T T T T C G A G6 6 1 A G G C T C A T C G T2 . 3 . 1 隨 機(jī) 引 物 S 3 9 1 的 擴(kuò) 增 隨 機(jī) 引 物 S 3 9 1 的 序 列為 A C G A T G A G C C ， 特 異 片 斷 S 3 9 1 - 7 0 0 b p 序 列 如 下 ：該 片 斷 總 共 有 6 7 1 個(gè) 堿 基 ， 各 個(gè) 堿 基 數(shù) 為 ： A : 2 0 2個(gè) C : 1 7 4 個(gè) G : 1 0 4 個(gè) T : 1 9 1 個(gè) ； A : 3 0 . 1 % C : 2 5 . 9 %G : 1 5 . 5 % T ： 2 8 . 5 % ； A T = 5 8 . 6 % , G C = 4 1 . 4 % , 將S 3 9 1 - 7 0 0 序 列 采 用 B l a s t n 進(jìn) 行 核 苷 酸 同 源 序 列 比 較 ，表 明 S 3 9 1 - 7 0 0 b p 在 5 0 1 - 6 7 1 堿 基 間 存 在 一 個(gè) 開(kāi) 放 閱 讀框 架 ， 該 開(kāi) 放 閱 讀 框 架 包 含 1 7 1 堿 基 ， 這 一 開(kāi) 放 閱 讀框 架 與 植 物 葉 綠 體 絲 氨 酸 乙 酰 基 轉(zhuǎn) 移 酶 D N A 部 分 片段 有 很 高 的 同 源 性 。圖 5 不 育 系 和 保 持 系 單 株 擴(kuò) 增 1 - 4為 保 持 系 單 株 , 5 - 1 0 為 不 育 單 株園 藝 園 林 科 學(xué) 2 6 9 C h i n e s e A g r i c u l t u r a l S c i e n c e B u l l e t i n V o l . 2 3 N o . 5 2 0 0 7 M a yh t t p : / / w w w . c a s b . o r g . c nC h i n e s e A g r i c u l t u r a l S c i e n c e B u l l e t i n V o l . 2 3 N o . 5 2 0 0 7 M a yh t t p : / / w w w . c a s b . o r g . c nC h i n e s e A g r i c u l t u r a l S c i e n c e B u l l e t i n V o l . 2 3 N o . 5 2 0 0 7 M a yh t t p : / / w w w . c a s b . o r g . c nC h i n e s e A g r i c u l t u r a l S c i e n c e B u l l e t i n V o l . 2 3 N o . 5 2 0 0 7 M a yh t t p : / / w w w . c a s b . o r g . c n進(jìn) 行 S C A R 轉(zhuǎn) 化 分 析 ， 從 保 持 系 部 分 單 株 中 擴(kuò) 增 出 了特 異 條 帶 ， 大 小 與 目 的 片 段 基 本 一 致 ， 而 不 育 系 單 株則 均 沒(méi) 有 擴(kuò) 增 出 相 應(yīng) 的 特 異 條 帶 （ 圖 6 ） 。3 討 論在 傳 統(tǒng) 的 育 種 工 作 中 ， 對(duì) 目 標(biāo) 性 狀 的 選 擇 主 要 是根 據(jù) 形 態(tài) 標(biāo) 記 進(jìn) 行 的 ， 要 求 時(shí) 間 長(zhǎng) ， 而 且 所 依 賴(lài) 的 表型 性 狀 易 受 到 許 多 環(huán) 境 因 素 的 影 響 ， 不 很 可 靠 。 分 子標(biāo) 記 的 應(yīng) 用 極 大 地 提 高 了 性 狀 選 擇 的 效 率 和 準(zhǔn) 確 性 ，減 少 了 育 種 過(guò) 程 的 盲 目 性 和 周 期 性 6 , 7 。 王 曉 武 等 8 利用 一 個(gè) 青 菜 花 與 顯 性 雄 性 不 育 甘 藍(lán) 材 料 的 回 交 群 體 ，通 過(guò) 對(duì) 3 0 0 個(gè) 隨 機(jī) 引 物 的 篩 選 ， 獲 得 了 一 個(gè) 與 顯 性 雄性 不 育 基 因 連 鎖 距 離 為 8 1 0 c M 的 R A P D 標(biāo) 記O T 1 1 9 0 0 。 蓋 樹(shù) 鵬 等 9 利 用 R A P D 技 術(shù) 獲 得 了 大 蔥 胞質(zhì) 中 與 育 性 連 鎖 的 標(biāo) 記 ， 并 利 用 此 標(biāo) 記 選 育 不 育 系 和保 持 系 ， 減 少 了 自 交 株 數(shù) 和 測(cè) 交 組 合 數(shù) 。 省 時(shí) 省 力 ， 加快 了 選 育 步 伐 。 N . U r a s a k i 等 1 0 人 找 出 一 個(gè) 與 番 木 瓜 性別 相 關(guān) 的 R A P D 標(biāo) 記 P S D M ， 并 將 該 標(biāo) 記 轉(zhuǎn) 化 成S C A R 標(biāo) 記 ， 能 有 效 預(yù) 測(cè) 番 木 瓜 的 性 別 。本 研 究 以 大 白 菜 細(xì) 胞 質(zhì) 雄 性 不 育 系 C M S - 2 及 其保 持 系 B - 2 為 材 料 ， 對(duì) 大 白 菜 細(xì) 胞 質(zhì) 雄 性 不 育 基 因 及其 保 持 基 因 進(jìn) 行 R A P D 標(biāo) 記 研 究 。 引 物 S 3 9 1 在 不 育系 中 有 特 異 性 擴(kuò) 增 ， 引 物 S 4 2 5 在 保 持 系 中 有 特 異 性擴(kuò) 增 ， 這 2 個(gè) 引 物 都 能 有 效 區(qū) 分 開(kāi) 不 育 系 C M S - 2 及其 保 持 系 B - 2 。 對(duì) 得 到 的 大 白 菜 特 有 R A P D 標(biāo) 記 經(jīng) 單株 檢 測(cè) ， 都 能 確 定 其 特 異 性 。 測(cè) 序 后 B l a s t n 表 明 ，S 3 9 1 - 7 0 0 b p 與 葉 綠 體 絲 氨 酸 乙 酰 基 轉(zhuǎn) 移 酶 基 因（ S A T a s e g e n e ） 部 分 序 列 有 8 6 % 的 同 源 性 ， 是 葉 綠 體絲 氨 酸 基 因 可 讀 碼 框 的 一 部 分 。 編 碼 絲 氨 酸 乙 酰 轉(zhuǎn) 移酶 基 因 的 c D N A 從 西 瓜 ， 菠 菜 , 香 蔥 和 克 隆 獲 得 ， 本 試驗(yàn) 首 次 在 大 白 菜 C M S 中 獲 得 S A T a s e g e n e 的 部 分 編碼 。 葉 綠 體 絲 氨 酸 乙 酰 轉(zhuǎn) 移 酶 負(fù) 責(zé) 絲 氨 酸 的 新 陳 代謝 ， 同 時(shí) 絲 氨 酸 乙 酰 轉(zhuǎn) 移 酶 和 半 胱 氨 酸 合 酶 共 同 參 與了 半 胱 氨 酸 生 物 合 成 的 最 后 一 步 生 化 反 應(yīng) 。 S A T a s e的 功 能 參 與 葉 綠 體 和 線(xiàn) 粒 體 中 S 的 代 謝 ， 在 一 定 條 件下 植 物 釋 放 H2S ， 并 在 葉 綠 素 含 量 低 的 葉 綠 體 中 表 現(xiàn)出 相 當(dāng) 高 活 性 ， 其 是 否 是 的 導(dǎo) 致 花 粉 敗 育 的 原 因 之一 ， 還 要 進(jìn) 一 步 的 驗(yàn) 證 。 對(duì) S 4 2 5 - 6 0 0 b p 在 N C B I 數(shù) 據(jù)庫(kù) 中 進(jìn) 行 序 列 比 對(duì) ， 分 析 表 明 該 片 斷 與 A r a b i d o p s i st h a l i a n a 染 色 體 2 的 部 分 序 列 有 一 定 的 同 源 性 ， 推 測(cè)可 能 具 有 相 似 的 編 碼 功 能 。參 考 文 獻(xiàn) 1 P a r a n I , K e s s e l i R , M i c h e l m o r e R . I d e n t i f i c a t i o n o f r e s t r i c t i o nf r a g m e n t l e n g t h p o l y m o r p h i s m a n d r a n d o m a m p l i f i e d p o l y m o r p h i cD N A m a r k e r s l i n k e d t o m i l d e w r e s i s t a n c e g e n e s i n l e t t u c e , u s i n gn e a r i s o g e n i c l i n e s J . G e n o m e , 1 9 9 1 , 3 4 : 1 0 2 1 - 1 0 2 7 . 2 W i l l i a m s J G K , K u b e l i k A R , L i v a k K J , e t a l . D N Ap o l y m o r p h i s m s a m p l i f i e d b y a r b i t r a r y p r i m e r s a r e u s e f u l a s g e n e t i cm a r k e r s J . N u c l e i e : A c i d s R e s e a r c h . 1 9 9 0 , 1 8 : 6 5 3 1 - 6 5 3 5 . 3 江 昌 俊 , 陳 彥 . 分 離 蕓 苔 屬 植 物 基 因 組 D N A 的 一 種 方 法 J . 中 國(guó)油 料 , 1 9 9 5 , 1 7 ( 4 ) : 3 4 - 3 6 . 4 王 永 飛 , 王 鳴 , 鄭 學(xué) 勤 . 大 白 菜 細(xì) 胞 質(zhì) 雄 性 不 育 的 分 子 生 物 學(xué) 研究 J . 遺 傳 , H E R E D I T ( B e i j i n g ) , 2 0 0 2 , 2 4 ( 1 ) : 6 3 - 6