2017 年 7 月 第 19 卷 第 7 期 中國現(xiàn)代中藥 Mod Chin Med Jul. 2017 Vol. 19 No. 7中藥農(nóng)業(yè) 基金項(xiàng)目 農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè) ( 農(nóng)業(yè) ) 科研專項(xiàng) ( 20130311) ; 吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目 ( 20150204043N Y)* 通信作者 宋述堯 ， 教授 ， 研究方向 : 設(shè)施園藝工程及蔬菜生態(tài)生理研究 ; E-mail: sysongjlau 126. com;張連學(xué) ， 教授 ， 研究方向 : 藥用植物栽培與加工 ; E-mail: zlx863 163. com人參莖葉總皂苷對黃瓜白粉病菌的活性影響研究楊鶴 ， 宋述堯*， 許永華 ， 盧寶慧 ， 張連學(xué)*( 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院 ， 吉林 長春 130118) 摘要 目的 : 為人參源殺菌劑的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù) 。方法 : 通過洋蔥球莖內(nèi)表皮膜法研究人參莖葉總皂苷對黃瓜白粉病菌孢子萌發(fā)的影響 ， 采用盆栽法研究其對白粉病菌的溫室防效 。結(jié)果 : 人參莖葉總皂苷對白粉病菌孢子萌發(fā)的 EC50為 5. 74 mgmL 1; 溫室防效的 EC50為 23. 51 mgmL 1。結(jié)論 : 人參莖葉總皂苷可抑制黃瓜白粉病菌孢子萌發(fā) ， 溫室防效良好 ， 可進(jìn)一步研發(fā)為中藥殺菌劑 。 關(guān)鍵詞 人參莖葉總皂苷 ; 白粉病菌 ; 孢子萌發(fā) ; 防治效果 ; 殺菌劑Inhibitory Effects of Ginsenosides on Cucumber Powdery Mildew Fungus ( Sphaerotheca fuliginea) ActivityYANG He， SONG Shuyao*， XU Yonghua， LU Baohui， ZHANG Lianxue*( College of Chinese Traditional Medicine， Jilin Agriculture University， Changchun 130118， China) Abstract Objective: This study is aimed to provide scientific basis for using ginsenosides as thefungicide. Methods: In order to evaluate the inhibitory effects of ginsenosides from ginseng stem and leaf on cucumber powderymildew fungus spore germination and its control efficiency in greenhouse， onion bulb inside skin membrane and pot cultivationmethods were employed in this study. esults: The results indicated that ginsenosides from ginseng stem and leaf EC50on pow-dery mildew fungus spore germination and preventive effects in greenhouse were 5. 74 mgmL 1and 23. 51 mgmL 1， respec-tively. Conclusion: Ginsenosides， with the potential for further development of a Chinese herbal fungicide， perform well onsuppression of spore germination and prophylaxis in greenhouse. Keywords ginsenosides from ginseng stem and leaf; Sphaerotheca fuliginea; spore germination; controleffect; fungicidedoi: 10 13313 /j issn 1673-4890 2017 7 019黃瓜白粉病是我國北方露地和保護(hù)地黃瓜種植中發(fā)生和危害較重的病害之一 ， 在黃瓜整個(gè)生長期均可危害 。病原菌屬于子囊菌亞門的白粉病菌 Spha-erotheca fuliginea ( Schlecht) Poll. 。目前大面積種植的高產(chǎn)品種大多缺乏抗病性 ， 長期高劑量施用殺菌農(nóng)藥 ， 使病菌逐步產(chǎn)生了抗藥性 1， 因此在生產(chǎn)實(shí)踐中急需安全有效的防治黃瓜白粉病的新型殺菌劑 。三萜類物質(zhì)是植物在長期進(jìn)化過程中形成的適應(yīng)生態(tài)環(huán)境的物質(zhì) ， 它們具有抵抗真菌 、病毒 、細(xì)菌侵?jǐn)_的作用 2。人參皂苷作為典型的三萜類物質(zhì) ， 是人參的一種重要次生代謝產(chǎn)物 ， 其藥理作用早已得到大眾的認(rèn)可 ， 并且越來越多的研究學(xué)者也關(guān)注到人參皂苷的生態(tài)學(xué)作用 。人參皂苷作為人參 、西洋參的一類主要化感物質(zhì)在人參忌連作問題上被廣泛研究 3， 并有報(bào)道指出人參莖葉總皂苷具有抑菌作用 4。本實(shí)驗(yàn)室比較了人參莖葉總皂苷對于不同植物病原菌的活性 ， 發(fā)現(xiàn)對黃瓜白粉病菌作用顯著 。人參莖葉總皂苷作為天然活性物質(zhì) ， 如果能開發(fā)為植物源農(nóng)藥 ， 用于代替化學(xué)方法作為防治果蔬病害的綠色防治手段 ， 對于環(huán)境保護(hù)和生物安全將具有重要意義 。黃瓜白粉病菌為植物專性寄生菌 ， 只能寄生與之親和的活體 ， 不能在人工培養(yǎng)基上生長 ， 因此以往研究中 ， 很少采用孢子萌發(fā)法評價(jià)藥劑對該菌的活性 。本文采用洋蔥球莖內(nèi)表皮膜法評價(jià)人參莖葉10012017 年 7 月 第 19 卷 第 7 期 中國現(xiàn)代中藥 Mod Chin Med Jul. 2017 Vol. 19 No. 7總皂苷對黃瓜白粉病菌孢子萌發(fā)的影響 ， 并進(jìn)行了人參莖葉總皂苷對白粉病菌的溫室防治效果研究 ，以期研發(fā)一種新型植物源殺菌劑 。1 材料與方法1. 1 材料人參莖葉總皂苷購自吉林省宏久生物科技股份有限公司 ( 紫外檢測總皂苷含量為 81. 7% ) 。白粉病菌孢子采自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院溫室 。供試黃瓜品種為好運(yùn)來 208， 購于山東省寧陽縣蔬春種業(yè)有限公司 。1. 2 方法1. 2. 1 人參總皂苷溶液的制備 將人參莖葉總皂苷用 0. 05% 的吐溫 80 水溶液分別配制成 0. 5， 5，10， 20， 50 mgmL 1的質(zhì)量濃度梯度 ， 現(xiàn)配現(xiàn)用 。1. 2. 2 白粉病菌孢子萌發(fā)試驗(yàn) 采用洋蔥球莖內(nèi)表皮膜法 5研究人參莖葉總皂苷對白粉病菌孢子萌發(fā)的影響 。取溫室中黃瓜上感染的白粉病菌 ， 用去離子水將孢子洗脫 ， 過濾 ， 1000 rpm 離心 5 min， 去上清液 ， 重復(fù) 3 次 。重懸浮孢子至分生孢子含量 1 106個(gè) mL 1。取 1. 2. 1 藥劑和孢子懸浮液按 1 1 混勻并滴到洋蔥表皮膜上 ， 架于盛有淺層無菌水的培養(yǎng)皿中 ，28 加蓋保濕培養(yǎng) ， 每個(gè)處理 3 次重復(fù) ， 以 0. 05%的吐溫 80 水溶液處理為空白對照 。待對照組 70%以上萌發(fā)時(shí)觀察并計(jì)算孢子萌發(fā)率 ， 顯微鏡觀察孢子萌發(fā)情況 ， 每個(gè)處理隨機(jī)觀察 3 個(gè)視野 ， 以每視野下能觀察到的 80 100 個(gè)孢子為記錄對象 ， 記錄孢子總數(shù)和萌發(fā)數(shù) ， 以孢子芽管長于孢子短半徑為萌發(fā) ， 按下式計(jì)算萌發(fā)率和相對抑制率 :萌發(fā)率 =孢子萌發(fā)數(shù)孢子總數(shù)100%校正萌發(fā)率 =處理孢子萌發(fā)率對照孢子萌發(fā)率 100%相對抑制率 =對照孢子萌發(fā)率 校正孢子萌發(fā)率對照孢子萌發(fā)率 100%1. 2. 3 白粉病菌溫室防治試驗(yàn) 采用盆栽法 6研究人參莖葉總皂苷對黃瓜白粉病菌的溫室防治效果 。按照 1. 2. 2 方法配置孢子懸浮液 。取 63 株長勢相同的健康供試黃瓜幼苗 ， 溫室單株栽培 ， 待 5 7 片真葉期時(shí) ， 分為 7 組 。用孢子懸浮液均勻噴霧接種 ，20 23 ， 相對濕度 95% ， 黑暗保濕條件下培養(yǎng)24 h。然后取 1. 2. 1 藥劑均勻噴施于生長點(diǎn)以下第3， 4， 5 片葉正反面至潤濕 ， 以 0. 05% 的吐溫 80水溶液為對照 ， 采用生產(chǎn)上常用的乙嘧唑胺菌酯為陽性對照 ， 每個(gè)處理 3 株 ， 3 次重復(fù) 。在 20 23 ，正常日光溫室 ， 相對濕度 85% 90% 條件下培養(yǎng) 7 d。按表 1 的分級標(biāo)準(zhǔn) 6調(diào)查記錄葉片發(fā)病情況 ， 每處理調(diào)查 10 片葉 ， 按下式計(jì)算病情指數(shù)和防治效率 。病情指數(shù) =( 各病級葉數(shù) 病級 )調(diào)查總?cè)~數(shù) 9100%防治效果 =對照病情指數(shù) 處理病情指數(shù)對照病情指數(shù)100%表 1 黃瓜白粉病病情分級標(biāo)準(zhǔn)病級 發(fā)病程度0 級 無病斑1 級 病斑占葉面積的 5% 以下3 級 病斑占葉面積的 5% 15%5 級 病斑占葉面積的 15% 25%7 級 病斑占葉面積的 25% 50%9 級 病斑占葉面積的 50% 以上1. 2. 5 數(shù)據(jù)分析 采用 SPSS 22. 0 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析 ， 多重比較采用 Duncans 法 。以人參皂苷濃度對數(shù)值和孢子萌發(fā)相對抑制率的幾率值 ， 人參皂苷濃度對數(shù)值和溫室防效幾率值作毒力回歸方程 ， 根據(jù)回歸方程計(jì)算兩次分析的 EC50值及 95% 的置信限 。3 結(jié)果與分析3. 1 白粉病菌孢子萌發(fā)的影響人參莖葉總皂苷對黃瓜白粉病菌孢子萌發(fā)的影響見表 2。結(jié)果顯示 ， 在實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng) ， 隨著藥劑濃度的升高 ， 孢子萌發(fā)率呈顯著降低趨勢 ， 孢子萌發(fā)相對抑制率呈顯著升高趨勢 ， 人參莖葉總皂苷對白粉病菌孢子萌發(fā)有明顯的抑制作用 。當(dāng)人參莖葉總皂苷濃度為 0. 5 50 mgmL 1時(shí) ，通過對濃度對數(shù)與白粉病菌孢子萌發(fā)相對抑制率幾率值作毒力回歸分析 ， 可以進(jìn)一步分析人參莖葉總皂苷對孢子萌發(fā)的抑制效果 。結(jié)果顯示 ， 回歸方程為 Y =0. 956 2X +4. 2742， 相關(guān)系數(shù) r =0. 937， 可知人參莖葉總皂苷對白粉病菌孢子萌發(fā)的抑制作用與其濃度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān) 。得出人參皂苷有效抑菌 濃 度 EC50為 5. 74 mgmL 1， 95% 置 信 限 為3. 58 9. 21 mgmL 1。20012017 年 7 月 第 19 卷 第 7 期 中國現(xiàn)代中藥 Mod Chin Med Jul. 2017 Vol. 19 No. 7表 2 人參莖葉總皂苷對黃瓜白粉病菌孢子萌發(fā)的影響(珋x s， n = 3)藥劑濃度( mgmL 1)萌發(fā)率 ( % ) 校正萌發(fā)率 ( % ) 相對抑制率 ( % )50 8. 00 1. 73f 11. 11 2. 41f 88. 89 2. 41e20 23. 00 0. 58e 31. 94 0. 80e 68. 06 0. 80d10 35. 33 4. 04d 49. 07 3. 24d 50. 92 3. 24c5 46. 00 2. 89c 63. 89 4. 01c 36. 11 4. 01b0. 5 56. 33 2. 33b 78. 24 3. 24b 21. 76 3. 24aCK 72. 33 2. 90a 100a 注 : 表中同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著 ， P 0. 05。3. 2 白粉病菌溫室防治人參莖葉總皂苷對黃瓜白粉病菌溫室防治效果見表 3。結(jié)果顯示 ， 隨著藥劑濃度的升高 ， 黃瓜葉片發(fā)病率和病情指數(shù)均有逐漸降低的趨勢 ， 并且均顯著低于對照組 。防治效果隨藥劑濃度的升高而顯著增強(qiáng) ， 當(dāng)藥劑濃度達(dá)到 10 mgmL 1時(shí) ， 與陽性對照的防治效果相同 ， 高于此濃度的藥劑防治效果均顯著強(qiáng)于陽性對照 。表 3 人參莖葉總皂苷對黃瓜白粉病菌的溫室防治效果(珋x s， n =3)藥劑濃度/mgmL 1發(fā)病率 ( % ) 病情指數(shù) ( % ) 防治效果 ( % )50 5. 00 0e 33. 33 0d 66. 67 0d20 16. 67 3. 33d 48. 15 7. 41c 51. 85 7. 41c10 40. 00 5. 77c 77. 78 0b 22. 22 0b5 46. 67 1. 67c 85. 19 7. 41b 14. 81 7. 41b0. 5 58. 33 1. 67b 100 0a 0aCK 73. 33 1. 67a 100 0a 陽性對照 40. 24 4. 91c 77. 78 0b 22. 22 0b注 : 表中同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著 ， P 0. 05。通過對濃度對數(shù)與防效幾率值作毒力回歸分析 ，回歸方程為 Y = 1. 798 5X + 2. 533 7， 相關(guān)系數(shù) r =0. 993 3， 可知人參莖葉總皂苷對白粉病菌溫室防治效果與其濃度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān) 。得出人參皂苷有效 溫 室 防 治 濃 度 EC50值 為 23. 51 mgmL 1，95% 置信限為 12. 98 42. 58 mgmL 1。4 討論人參莖葉總皂苷對黃瓜白粉病菌孢子萌發(fā)具有明顯的抑制作用 ， 分生孢子的萌發(fā)是白粉病田間流行和再侵染的關(guān)鍵環(huán)節(jié) ， 抑制分生孢子萌發(fā)可以有效控制病害流行 ， 減輕其危害程度 。與室內(nèi)對白粉病菌孢子萌發(fā)的抑制作用相比 ， 受植物自身和溫室環(huán)境的綜合影響 ， 人參莖葉總皂苷抑菌效果明顯降低 ， 但其仍具有明顯的防治效果 ， 且其防治效果與藥劑濃度在一定范圍內(nèi)成正相關(guān) 。植物次生代謝物質(zhì)是植物在長期進(jìn)化過程中與環(huán)境相互作用 ， 通過次級代謝途徑產(chǎn)生的物質(zhì) ， 它們在植物進(jìn)化中起到不可或缺的作用 ， 具有廣泛的生態(tài)學(xué)意義 7。將人參次生代謝產(chǎn)物人參皂苷開發(fā)為植物源農(nóng)藥 ， 無脊柱動(dòng)物毒性或植物毒性 ， 同時(shí)還有一定的保健作用 ， 并有環(huán)境降解迅速且資源豐富 ， 可再生等優(yōu)點(diǎn) 。人參栽培過程中具有季節(jié)脫落現(xiàn)象 ， 人參莖葉往往被棄之地里 ， 但有研究顯示人參葉中總皂苷含量比人參根部含量更高 8。因此本研究選擇人參莖葉皂苷作為試驗(yàn)原料 ， 將廢棄物有效利用 ， 極大降低成本 。前人在人參皂苷抑菌及其有效成分方面也有過研究 4， 本研究得出人參莖葉總皂苷可以抑制白粉病菌孢子萌發(fā) ， 同時(shí)具有良好的溫室防治效果 。因此 ， 可以此研究為基礎(chǔ) ， 進(jìn)一步研究人參皂苷對果蔬類病原真菌生長的抑制作用 ，研發(fā)新型植物源農(nóng)藥潛力巨大 。參考文獻(xiàn) 1 楊小軍 ， 楊立軍 ， 王少南 ， 等 藥劑對黃瓜白粉病菌的生物活性測定 方 法 比 較 J 湖 北 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) ， 2004 ( 3) :71-74 2 譚世強(qiáng) ， 馬琳 ， 許永華 ， 等 植物三萜類物質(zhì)的生態(tài)學(xué)功能研究進(jìn)展 J 人參研究 ， 2015， 27( 3) : 36-38 3 雷鋒杰 ， 張愛華 ， 張秋菊 ， 等 人參 、西洋參化感作用研究進(jìn)展 J 中國中藥雜志 ， 2010， 35( 17) : 2221-2226 4 趙雪淞 ， 王姣 ， 高娟 植物病原真菌對人參皂苷的敏感性 中國第七屆植物化感作用學(xué)術(shù)研討會會議指南及論文摘要集 C 昆明 : 出版者不詳 ， 2014 5 Xu J ， Staiger C J， Hamer J E Inactivation of the mitogen-activated protein kinase Mpsl from the rice blast fungus pre-vents penetration of host cells but allows activation of plantdefense responses J PNAS USA， 1998， 95: 12713-12718 6 NY/T 1156 11-2008， 中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥室內(nèi)生物測定試驗(yàn)準(zhǔn)則殺菌劑第 11 部分 : 防治瓜類白粉病試驗(yàn)盆栽法 S 北京 : 中國農(nóng)業(yè)出版社 ， 2008 7 付佳 ， 王洋 ， 閻秀峰 萜類化合物的生理生態(tài)功能及經(jīng)濟(jì)價(jià)值 J 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) ， 2003， 31( 6) : 59-62 8 Shi W， Wang Y， Li J， et al Investigation of ginsenosides indifferent parts and ages of Panax ginseng J Food Chem ，2007， 102 ( 3) : 664-668( 收稿日期 2017-01-17)3001