番茄葉片DNA提取_SSR_PCR反應體系優(yōu)化及引物篩選
分 子植物育種， 2018 年，第 16 卷，第 7 期，第 2230- 2236 頁Molecular Plant Breeding, 2018, Vol.16, No.7, 2230- 2236基金組織：本研究由寧夏回族自治區(qū)農(nóng)業(yè)育種專項 (NXNYYZ20150303)、寧夏大學研究生創(chuàng)新試驗 (GI2017039)和寧夏自治區(qū)農(nóng)業(yè)育種專項 (NXNYYZ20150301)共同資助引用格式： Rui W.J., Wang X.M., Zhang Q.N., Zhang X.Q., Lv Y., Hu X.Y., Gao Y.M., and Li J.S., 2018, DNA extraction, optimizationof SSR-PCR reaction system and primer screening of tomato leaf, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 16(7): 2230-2236(芮文婧 , 王曉敏 , 張倩男 , 張學琴 , 呂原 , 胡學義 , 高艷明 , 李建設 , 2018, 番茄葉片 DNA 提取 、SSR-PCR 反應體系優(yōu)化及引物篩選 ,分子植物育種 , 16(7): 2230-2236)研究報告Research Report番茄葉片 DNA 提取 、SSR-PCR 反應體系優(yōu)化及引物篩選芮文婧1王曉敏1,2,3*張倩男1張學琴1呂原1胡學義3高艷明1,2,3李建設1,2,3*1 寧夏大學農(nóng)學院 , 銀川 , 750021; 2 寧夏設施園藝 (寧夏大學 )技術(shù)創(chuàng)新中心 , 銀川 , 750021; 3 寧夏現(xiàn)代設施園藝工程技術(shù)研究中心 , 銀川 , 750021* 通訊作者 , wangxiaomin_1981163.com; jslinxcnyahoo.com.cn摘 要 為了進一步開發(fā)利用番茄種質(zhì)資源和開展分子標記輔助選擇育種，本研究利用高通量組織研磨機研磨微量葉片，通過改良 CTAB 法快速提取 DNA，并利用 L16(45)正交設計試驗，綜合采用直觀量化分析和方差分析兩種方法，分析 Mg2+、dNTPs、Taq DNA 聚合酶 、引物 、模板 DNA 濃度 5 個因素對番茄 SSR-PCR 擴增的影響，比較不同處理組合擴增效果的差異，最終篩選與驗證最優(yōu)的番茄 SSR-PCR 反應體系，并在此體系下對SSR 引物進行篩選 。結(jié)果表明番茄 SSR-PCR 最佳反應體系 (20L)為 Mg2+3.0 mmol/L、dNTPs0.4 mmol/L、TaqDNA 聚合酶 0.5 U、引物 0.5 mol/L、模板 DNA 40 ng；且利用優(yōu)化后的反應體系，從 540 對 SSR 引物中篩選出 373 對 (占 69.07%)擴增條帶清晰 、多態(tài)性豐富的引物 。該 SSR-PCR 體系的建立為番茄種質(zhì)資源遺傳多樣性分析，品種鑒定及指紋圖譜構(gòu)建等研究提供了一個標準化的程序 。關鍵詞 番茄 , 正交設計 , SSR-PCR, 體系優(yōu)化 , 引物篩選DNA Extraction, Optimization of SSR-PCR Reaction System and PrimerScreening of Tomato LeafRuiWenjing1WangXiaomin1,2,3*ZhangQiannan1ZhangXueqin1Lvyuan1HuXueyi3GaoYanming1,2,3Li Jianshe1,2,3*1 School of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan, 750021; 2 Ningxia Facility Horticulture (Ningxia University) Technology Innovation Center,Yinchuan, 750021; 3 Ningxia Modern Faciliry Horticulture Engineering Technology Research Center, Yinchuan, 750021* Corresponding authors, wangxiaomin_1981163.com; jslinxcnyahoo.com.cnDOI: 10.13271/j.mpb.016.002230Abstract In order to further develop and utilize tomato germplasm resources and carry out molecular marker-assisted selection breeding, few fresh tomato leaves were grinded by high throughput tissue grinding machine, andtotal DNA of tomato were extracted rapidly by a modified CTAB method. A research about the impacts of 5reactionfactors(Mg2+,dNTPs,TaqDNApolymerase,primerconcentrationsandDNAtemplate)onSSR-PCR ampli-fication of tomato was carried out by using an orthogonal experimental design of L16(45), visual quantitative analysisand analysis of variance. The effect of different treatment combinations were compared, the optimized tomatoSSR-PCR reaction system was selected and verified, and the SSR primers were screened under this system. TheresultsshowedthattheoptimalSSR-PCRreaction mixture wasasfollows: 20 Ltotal volume including3.0 mmol/LMg2+, 0.4 mmol/L dNTPs, 0.5 U Taq DNA polymerase, 0.5 mol/L primer, and 40 ng template DNA. 373 pairs ofSSR primers with clear and rich polymorphic bands were screened from 540 pairs of primers (69.07%) using theoptimized reaction system. The establishment of this optimal system for SSR-PCR would provide a standardprotocol for the investigation on genetic diversity analysis of germplasm resources, cultivar identification, and番 茄是全世界廣泛栽培的蔬菜，也是中國主要栽培蔬菜之一，為了明確番茄種質(zhì)資源之間的親緣關系，選育優(yōu)良品種，有必要對番茄種質(zhì)資源進行分類定位，系統(tǒng)分析 。分子標記技術(shù)育種已經(jīng)成為目前番茄育種中極為重要的工具 ?？焖偬崛≈参?DNA 是分子生物學最基本的操作，高質(zhì)高量的 DNA 樣品的獲取是進行 PCR 擴增 、限制性酶切 、遺傳多態(tài)性分析 、分子雜交 、以及基因組學等分子生物學研究的基礎 。因此，獲取高質(zhì)高量的 DNA 顯得極其重要 (李金璐等 , 2013)。由于番茄葉片中含有嚴重影響 DNA提取質(zhì)量的酚類，蛋白和多糖等物質(zhì)，傳統(tǒng)的 DNA提取方法需要用液氮和研缽研磨，反復抽提，在進行大量樣本分析時， DNA 的提取浪費較多時間和樣本，而且也不能很好地去除酚類物質(zhì)，致使 DNA 樣品褐化，對 PCR 的分析結(jié)果造成一定的影響 (王飛等 , 2006)。簡單序列重復 (simple sequence repeats, SSR)，是以 16 個堿基為基本單元的串聯(lián)重復序列，在植物基因組中廣泛分布 (LittandLuty,1989;Tautz,1989)。SSR標記具有許多其他分子標記技術(shù)無法比擬的優(yōu)勢，如包含的信息含量高，分布比較廣泛，呈共顯性遺傳，以孟德爾方式遺傳，操作簡單，特異性強，對 DNA要求低，重復性好等特點 (何仁鋒等 , 2015)。因而近幾年被廣泛的應用到加工番茄 (王柏柯等 , 2014)，茄子(韓洪強 , 2009)，辣椒 (羅玉娣 , 2006)等蔬菜的遺傳多樣性分析，遺傳圖譜的繪制和基因標記等研究領域 。但其反應條件容易受其他因素干擾，從而影響整個實驗的結(jié)果 。目前關于 SSR 體系優(yōu)化的方法有很多種，單因素設計試驗不能考察 PCR 體系中各組分的交互作用，也不能完全保證各組分最佳處理組合后就是最佳反應體系；完全組合設計要做大量的 PCR 擴增工作，試驗周期長，正交設計克服了這些缺陷，能夠很好的建立最優(yōu)反應體系 (王歡歡等 , 2009, 江蘇農(nóng)業(yè)科學 , 2(78): 48-50)。因此，利用正交試驗建立適合番茄的 SSR-PCR 檢測體系是進一步探究番茄分子多態(tài)性與遺傳多樣性的技術(shù)基礎與前提條件 。本研究擬采用一種高質(zhì)量番茄基因組改良 CTAB快速微量提取方法，通過 SSR-PCR 反應體系中 Mg2+、dNTPs、Taq DNA 聚合酶 、引物 、模板 DNA 量五因素四水平 L16(45)正交試驗，以期篩選出的番茄 SSR-PCR反應體系重復性好，穩(wěn)定性高且多態(tài)性豐富，同時利finger printing construction of tomato.Keywords Tomato, Orthogonal design, SSR-PCR, System optimization, Primer screening用優(yōu)化的反應體系進行多態(tài)性引物篩選，以期為番茄種質(zhì)資源遺傳多樣性評價 、親緣關系研究，品種鑒定，系統(tǒng)分類提供科學依據(jù) 。1 結(jié)果與分析1.1 DNA的提取質(zhì)量檢測1.1.1 DNA 濃度和純度的檢測用核酸蛋白檢測儀測得的番茄葉片 DNA 的濃度和純度， DNA 樣品的濃度 A260/A280比值均在 1.82.0之間， A260/A230比值均大于 2.0，研究表明提取的 DNA雜質(zhì)少，純度較好 (表 1)。1.1.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測 (圖 1)提取到的 10 份番茄葉片基因組 DNA (稀釋到 100 ng/L 左右 )，顯示所有序號No.12345678910濃度 (ng/L)Concentration (ng/L)90.10200.30230.10175.50278.00178.60260.00186.21241.21177.74A260/A2801.9221.9371.9231.9661.9291.9471.9211.9311.9561.869A260/A2302.0482.2342.1802.2592.1012.2422.1342.1802.2342.221表 1 10 份番茄 DNA 樣品的濃度和純度Table 1 The concentrations and purities of 10 DNA samples oftomato圖 1 番茄葉片 DNA 的凝膠電泳檢測注 : M: DL2000 DNA marker; 110: 10 份番茄 DNAFigure 1 The electrophoretogram of DNA samples of tomatoNote: M: DL2000 DNA marker; 110: Stand for DNA samples番茄葉片 DNA 提取 、SSR-PCR 反應體系優(yōu)化及引物篩選DNA Extraction, Optimization of SSR-PCR Reaction System and Primer Screening of Tomato Leaf2231分 子植物育種Molecular Plant BreedingDNA 樣品均只有 1 條清晰并且完整的帶，質(zhì)量高，完整性好，能滿足 SSR-PCR 分析的需要 。1.2 正交試驗設計的電泳分析采用 L16(45)正交設計的方法對影響 PCR 擴增結(jié)果的 5 個因素設置 4 個不同的水平，對組成的 16 個不同處理進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示， 16 個不同處理的最終電泳條帶差異明顯 (圖 2)。其中處理11 幾乎看不到擴增條帶，處理 1， 2， 12 和 14 得到的電泳條帶背景顏色相對其他處理較模糊，處理 3 和 13 重復性和穩(wěn)定性差，其余處理條帶數(shù)量豐富，清晰度高 。據(jù)此對 16 個處理的 3 次重復進行獨立打分，計算其平均值，所得結(jié)果依次為： 2.67， 4.00， 7.68， 11.33，6.67， 6.33， 3.33， 4.00， 5.00， 3.33， 1.00， 3.67， 6.33， 3.67，9.00， 9.00。1.2.1 SSR-PCR 正交試驗直觀分析假設各個因素之間不存在交互作用，根據(jù)試驗的打分結(jié)果進行直觀分析，試驗的各個處理的平均值能夠反映各因素對反應體系的影響情況，計算同一影響因素不同水平打分結(jié)果的均值和極差 (表 2)，極差越大，表明該因素對 PCR 擴增結(jié)果的影響越顯著，最終結(jié)果表明引物對番茄 SSR-PCR 反應體系影響最大，各因素影響程度依次為：引物 >Mg2+>dNTPs>Taq酶 >模板 DNA。各因素的最佳水平 (表 2)，即 Mg2+、dNTPs、Taq 酶和引物都以水平 4 最佳，模板 DNA 量以水平 3 最佳，綜合以上結(jié)果分析可以選出最優(yōu)組合 。1.2.2 SSR-PCR 正交試驗設計的方差分析直觀分析不能很好的估計在試驗過程中出現(xiàn)的許多無法避免的誤差 。因此對結(jié)果利用 SPSS 20.0 進行方差分析 (表 3)，結(jié)果表明 Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶 、引物 、模板 DNA 量這 5 個因素對 PCR 擴增圖 2 SSR-PCR 反應體系正交試驗電泳注 : M: DL2000 marker; 116: 16 個處理依次編號 ; A,B,C: 16個處理的 3 次重復Figure 2 Electrophoretogram of tomato by SSR-PCR orthogonaldesignNote: M: DL2000 marker; 116: 16 treatment followed by num-ber; A,B,C: 16 treatment of three replicates水平Levels1234極差RangeMg2+6.4175.0833.2507.0003.750dNTPs5.1674.3335.2507.0002.667Taq 酶Taq polymerase4.7505.8335.0836.6671.333引物Primer3.3333.8336.6677.9174.583模板 DNATemplate DNA4.7505.3336.0005.6671.250因素Factors表 2 番茄 SSR-PCR 正交試驗 L16(45)均值和極差Table 2 The mean and range of SSR-PCR reaction of tomato byan orthogonal design L16(45)結(jié)果影響均十分顯著，方差分析的 PCR 各因素對本體系的影響與直觀分析結(jié)果一樣，引物濃度對擴增影響最大，模板 DNA 對擴增影響最小，最終結(jié)果顯示，誤差對本試驗結(jié)果影響較小，試驗結(jié)果可行 。1.2.3 五因素各水平的綜合優(yōu)化直觀分析和方差分析得出的結(jié)果一致，最后結(jié)果都表明，對番茄 SSR-PCR 擴增影響最大的因素是引物濃度 。研究表明，在 0.20.5 mol/L 范圍內(nèi)， PCR擴增產(chǎn)物隨著引物濃度的增加而增加，引物濃度以0.5 mol/L 為最佳反應水平 。對番茄 SSR-PCR擴增反應影響其次為 Mg2+，本研究表明 Mg2+在 3.0mmol/L，其PCR 擴增的條帶均優(yōu)于其他水平 。dNTPs 濃度是另一個影響番茄 SSR-PCR 的重要因素， dNTPs 濃度大小直接影響 PCR 擴增產(chǎn)物的多少 (圖 2)，當 dNTPs 濃度在 0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L 的時候，都有擴增產(chǎn)物，但以0.4 mmol/L 時最優(yōu) 。2232誤 差來源Source校正模型Corrected model截距InterceptMg2+dNTPTaq 酶Taq Polymerase引物Primer模板 DNATempletDNA誤差Error總計Total校正的總計Corrected total 型平方和SS345.1461 419.18899.72945.22914.062175.89610.229208.6671 973.000553.812自由度DF15133333324847均方MS23.0101419.18833.24315.0764.68758.6323.4106.521-F3.529217.6395.0982.3120.7198.9910.523-顯著性P 值Sig.0.0010.0000.0050.0950.5480.0000.670-表 3 番茄 SSR-PCR 正交實驗方差分析Table 3 Variance analysis for the different factors of SSR-PCRreaction注 : 可決系數(shù) R=0.623 (調(diào)整的可決系數(shù) R=0.447)Note: R squared=0.623 (adjusted R squared=0.447)Taq DNA 聚合酶的活性和用量是 SSR-PCR 反應中重要因子之一，其用量直接影響 PCR 擴增反應的成敗，研究表明，當 Taq DNA 聚合酶用量為 0.5 U和 1.0 U 時 PCR 擴增的產(chǎn)物穩(wěn)定性基本一致，條帶豐富且清晰明亮，但從節(jié)約成本角度考慮， Taq DNA 聚合酶用量為 0.5 U 時，就能保證 PCR 的擴增正常 。在PCR 反應中適宜的模板 DNA 量是保證反應正常進行的前提，模板 DNA 量太多會增加非特異性擴增產(chǎn)物，對 Mg2+的有效濃度產(chǎn)生影響，量少又會導致 PCR擴增得到的電泳條帶太弱或試驗失敗 。本研究表明在20 L 番茄 SSR-PCR 反應體系中模板 DNA 量為40 ng 時， PCR 擴增條帶最優(yōu) 。方差分析結(jié)果顯示，模板 DNA的 F 值小于 P值，表明在 2050ng范圍內(nèi)，模板 DNA 濃度變化對 SSR 擴增幾乎無差異 。綜上所述，篩選出的理論上最優(yōu)的番茄 SSR-PCR反應體系 (20L)為 0.5mol/L 引物 、3.0mmol/LMg2+、0.4mmol/LdNTPs、0.5UTaqDNA聚合酶 、40ngDNA。1.3 最優(yōu)反應體系擴增穩(wěn)定性 、適用性驗證將上述得出的理論最優(yōu)反應體系處理 17 與 16 個處理中打分最高的處理 3 進行比較，并對其結(jié)果 (圖 3)再次打分，處理 3 與處理 17 的平均得分分別為 11.34和 12.67，最終結(jié)果顯示處理 17 的反應體系得分均高于前面所有處理，表明處理 17 擴增效果最佳，為最優(yōu)反應體系 。同時隨機選取 1 份番茄 DNA 樣品，運用前期已篩選出的 ND264- ND267 這 4 對多態(tài)性引物，利用處理 17 反應體系，進行 PCR 擴增檢測多態(tài)性 。4 個引物的電泳條帶均相對清晰 、質(zhì)量較好 (圖 4)。說明該番茄 SSR-PCR 反應體系適用性較強，可以用于番茄的分子生物學研究中 。1.4 SSR-PCR 引物篩選本實驗室選擇處于不同類群的 4 種番茄材料為DNA 為模板，利用最優(yōu) SSR-PCR 體系對收集到的540 個引物進行多態(tài)性篩選，最后成功篩選出 373 對(占 69.07%)目標條帶清晰，多態(tài)性豐富，穩(wěn)定的SSR 引物 。2 討論傳統(tǒng)研缽研磨需要葉片樣本 0.1 g，樣本用量大，研磨時間長 (510 min/ 樣本 )，需液氮，樣本損耗嚴圖 3 SSR-PCR 反應體系正交試驗電泳注 : M: DL2000 marker; 17: 理論最優(yōu)反應體系 ; 3: 16 個處理中打分最高的處理 3Figure 3 Electrophoretogram of tomato by SSR-PCR orthogonaldesignNote: 17: M: DL2000 marker; Theoretical optimal reaction sys-tem; 3: The highest score in 16 treatment is 3圖 4 4 對引物的 SSR-PCR 擴增注 : M: DL2000 marker; ND264ND267 為 4 對 SSR 引物Figure 4 SSR-PCR amplification of four pairs of primersNote: M: DL2000 marker; ND264ND267 are 4 pairs of SSRprimers番茄葉片 DNA 提取 、SSR-PCR 反應體系優(yōu)化及引物篩選DNA Extraction, Optimization of SSR-PCR Reaction System and Primer Screening of Tomato Leaf2233分 子植物育種Molecular Plant Breeding重 。本研究采用的番茄葉片快速微量提取 DNA 的方法利用高通量組織研磨機，僅使用微量的葉片樣本0.02 g，研磨時間僅 3 min/384 個樣本，效率高，無需液氮與苯酚，簡化了步驟，大大節(jié)約了時間，且提取的 DNA 純度與完整性好，濃度高，能夠滿足后續(xù)PCR 需要 。在番茄輔助育種和基因組研究中 SSR 分子標記技術(shù)目前已經(jīng)成為比較成熟和應用廣泛的標記技術(shù)之一， Mg2+、dNTPs、Taq 酶 、引物濃度及模板 DNA 量等因素會對 PCR 擴增結(jié)果產(chǎn)生影響 。因此，建立最優(yōu) SSR-PCR 的反應體系，利用優(yōu)化的反應體系進行多態(tài)性引物篩選是利用 SSR 分子標記進行番茄種質(zhì)資源遺傳多樣性評價 、親緣關系研究，品種鑒定和系統(tǒng)分類的基礎 。有關 SSR-PCR 反應體系優(yōu)化的研究很多 (蘇輝等 , 2009; 龍?zhí)训?, 2016)，不同植物 SSR-PCR反應體系不相同，即使是同一植物，不同研究者也會得出不同結(jié)論，這可能跟儀器 、試劑 、實驗環(huán)境以及操作人員有關，故而篩選出適合自己的 SSR 體系尤為重要 (龍?zhí)训?, 2016)。本研究對影響番茄 SSR-PCR 反應的 5 個因素采用正交試驗設計對 4 個不同水平進行優(yōu)化，建立穩(wěn)定 、重復性好的 SSR-PCR20L 反應體系： 0.5mol/L引物 、3.0 mmol/L Mg2+、0.4 mmol/L dNTPs、0.5 U TaqDNA 聚合酶 、40 ng DNA。同時，從試驗結(jié)果看出，試驗中各個因素對番茄SSR-PCR 體系的影響排序依次為引物 >Mg2+>dNTPs>Taq 酶 >模板 DNA，其中引物濃度相對其他 4 種因素對 PCR 擴增的影響最大，這與趙建濤等 (2014, 黑龍江農(nóng)業(yè)科學 , (12): 15-18)的研究結(jié)果相似；游離的Mg2+對 PCR 擴增效果間接影響，主要通過影響 Taq酶活性，同時影響 DNA 模板和引物退火和解鏈的溫度，進一步影響擴增的真實性和產(chǎn)物的特異性 (吳春燕等 , 2013)。本研究得出的 3.0 mmol/L Mg2+濃度與何仁鋒等 (2015)對藥用菊花 SSR-PCR 反應體系優(yōu)化得到最佳 Mg2+濃度一致 。其次，一般而言， DNA 純度對反應體系影響較大，本研究所用的模板 DNA 純度高，因此在滿足純度的基礎上，適量的模板 DNA 不會對反應體系產(chǎn)生顯著影響 。同時本研究用 1 份番茄種質(zhì)采用 4 對引物對優(yōu)化后的最優(yōu)體系進行驗證，均能獲得清晰穩(wěn)定的擴增，優(yōu)化后的體系為進一步應用于番茄基因定位 、品種鑒定 、遺傳多樣性分析及遺傳圖譜構(gòu)建提供依據(jù) 。另外，本研究利用 SSR-PCR 最優(yōu)體系從收集到的540對 SSR 引物中成功篩選出 373 對 (占 69.07%)穩(wěn)定性好，多態(tài)性高，條帶清晰的 SSR 引物，為下一步 SSR自動毛細管電泳檢測番茄種質(zhì)資源的遺傳多樣性提供幫助 。3 材料與方法3.1 試驗材料與儀器設備以寧夏大學農(nóng)學院園林系蔬菜課題組和寧夏巨豐種苗有限責任公司收集的番茄種質(zhì)資源幼苗為材料，摘取其幼嫩葉片，- 80保存?zhèn)溆?。DNA 提取的試驗選取 10 份材料，引物篩選以番茄形態(tài)標記的聚類結(jié)果為依據(jù) (芮文婧 , 2017, 私人通訊 )，選擇不同類群4 種番茄材料為 DNA 模板，體系優(yōu)化隨機性抽取一份番茄材料為固定 DNA 模板 。SSR 引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成， PCR 所用 dNTPs (10 mmol/L)、Taq DNA 聚合酶 (5 U/L)購自 TaKaRa 公司 、Mg2+(25 mmol/L)、10PCR Buffer、DL2000 marker 均購自Thermorfisher 公司， PCR 儀為 ProFlexTM購自美國Life Technologies (ABI)公司，瓊脂糖凝膠電泳儀為北京六一儀器廠 DYY- 10C 型 。高通量組織研磨機Geno2010，高速離心機 Sigma1- 14，核酸蛋白檢測儀Q6 000，凝膠成像系統(tǒng) Bio Gel Doc XR+。3.2 番茄葉片 DNA 的提取與檢測參照張曉祥等 (2012,中國農(nóng)學通報 ,28(36):46-49)小麥葉片 DNA 的方法，并略作修改，將 600L 提前預冷的 2CTAB 提取液加入 2 mL 的離心管中 (10 gCTAB 溶于去離子水中 , 加入 50 mL 1 mol/L 的 Tris-HCl, 280 mL 2.5 mol/L 的 NaCl, 1 mL - 巰基乙醇和40 mL0.25 mol/L 的 EDTA-Na, 定容至 500 mL)；取番茄幼苗葉片 (1 cm2, 約 0.05 g)放入緩沖液中，加 2 枚直徑為 0.45mm 的小鋼珠，研磨機以 1400strokes/min 速度研磨 2 min；在 65水浴保溫 2030 min，自然條件下冷卻后加入 600 L 氯仿 :異戊醇 (24:1)，充分搖勻后冰上放置 10 min，以 12 000 r/min 的速度離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管；加入與上清液等量的預冷的異丙醇搖勻，在 - 20下保存 30 min，以12 000 r/min 的速度快速離心 10 min；小心緩慢的倒掉上清液，用 300L 70%乙醇連續(xù)洗滌沉淀 3 次，每次高速離心 1 min 后，倒掉上清液乙醇，放于超凈工作臺吹干，加 200 L 1TE 或滅菌的 ddH2O 溶解，- 20保存?zhèn)溆?。利用核酸蛋白檢測儀直接檢測 DNA 的濃度和A260/A280、A260/A230的值 。取 5 L 的 DNA 母液加 1 L上樣緩沖液 Loading Buffer， Gelred 進行染色，上樣于22342%的瓊脂糖，以 DL2000 marker 為標準，在 1TAE的電泳緩沖液中進行水平板電泳， 100 V恒電壓，電泳約 40 min，凝膠成像系統(tǒng)進行拍照檢測 。3.3 SSR-PCR 擴增及體系優(yōu)化Mg2+、dNTPs、Taq DNA 聚合酶 、引物濃度及模板DNA 量會對 PCR 的最終擴增結(jié)果產(chǎn)生影響，為了得到準確 、客觀的 PCR 結(jié)果，首先應該摸索出適宜的PCR 反應條件再進行大量樣本擴增 (周海蘭 ,2016)。采用 L16(45)正交試驗設計，對影響番茄 SSR-PCR 反應體系的 Mg2+、dNTPs、Taq DNA 聚合酶 、引物濃度及模板 DNA 量等 5 個因素設置 4 個不同水平 (表 4;表 5)，總計 16個處理，每個處理 3次重復，擴增體系為 20L，每個處理加不含 Mg2+的 10PCR Buffer 2.0 L，用ddH2O 將 20 L 體系補充完整 。體系優(yōu)化，引物采用 ND547 (CCTTTTTAGGCGTTCCAGA; GTGAATTTAGCTGTGGGGGA)為固定引物， PCR 擴增程序為： 95預變性 5 min 1 個循環(huán)； 95變性 30 s， 55退火 30 s， 72延伸 45 s，進行 35 個循環(huán)；接著 72延伸 10 min， 4保存；用 2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測最終的 PCR 產(chǎn)物， 100 V 恒電壓，電泳 50 min， Bio Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照 。3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理根據(jù)電泳條帶的亮度 、清晰度 、數(shù)量以及背景顏色，參照湛欣等 (2016)的方法對電泳結(jié)果進行綜合打分：電泳條帶最優(yōu)的記滿分 16 分，最差的僅記 1 分 。計算 3 次重復結(jié)果的平均值和每個因素各水平的得分均值與極差 。對電泳結(jié)果進行直觀分析和方差分析；方差分析運用 SPSS 20.0 來計算 。根據(jù) F 值的大小判斷各因素對反應效果的影響，根據(jù)直觀分析和方差分析確定最適反應體系 。表 5 SSR-PCR 正交設計實驗 L16(45)Table 5 L16(45) orthogonal design for SSR-PCR處理Treat-ment12345678910111213141516Mg2+(mmol/L)1.51.51.51.52.02.02.02.02.52.52.52.53.03.03.03.0dNTPs(mmol/L)0.10.20.30.40.10.20.30.40.10.20.30.40.10.20.30.4Taq 酶 (U)Taq DNApolymerase (U)0.250.500.751.000.500.251.000.750.751.000.250.501.000.750.501.00引物 (mol/L)Primer(mol/L)0.20.30.40.50.40.50.20.30.50.40.30.20.30.20.50.4DNA(ng)20304050504030203020504040502030因素Factors表 4 SSR-PCR 反應的因素水平Table 4 Factors and levels of SSR-PCR reaction systems水平Level1234Mg2+(mmol/L)1.52.02.53.0dNTPs(mmol/L)0.10.20.30.4Taq 酶 (U)Taq DNApolymerase (U)0.250.500.751.00引物 (mol/L)Primer(mol/L)0.20.30.40.5DNA(ng)20304050因素Factors3.5 反應體系的穩(wěn)定性驗證及 SSR-PCR 引物篩選對優(yōu)化好的體系，隨機選取 1 份番茄 DNA 樣品，運用已篩選出的 4 對多態(tài)性引物，在已優(yōu)化的 PCR反應體系中進行 PCR 擴增，檢測其多態(tài)性，進而驗證番茄 SSR-PCR 的體系優(yōu)化結(jié)果 。選取四個不同類群的番茄，利用所得最佳的番茄SSR-PCR 反應體系，對從 NCBI 數(shù)據(jù)庫中收集到的540 對番茄 SSR 引物進行多態(tài)性引物篩選，選取穩(wěn)定性高 、重復性好 、多態(tài)性高的引物合成熒光引物，為下一步 SSR 自動毛細管電泳檢測奠定基礎 。作者貢獻芮文婧為本試驗研究的執(zhí)行人，完成數(shù)據(jù)分析和初稿的撰寫；王曉敏和李建設是項目的構(gòu)思者及負責人，并進行論文的修改；胡學義，高艷明指導試驗設計 、數(shù)據(jù)分析；張倩男，張學琴，呂原參與了本試驗的研究執(zhí)行工作和論文校正 。全體作者都閱讀并同意最終的文本 。致謝本研究由寧夏回族自治區(qū)農(nóng)業(yè)育種專項 (NXNY-YZ20150303)、寧夏大學研究生創(chuàng)新試驗 (GI2017039)番茄葉片 DNA 提取 、SSR-PCR 反應體系優(yōu)化及引物篩選DNA Extraction, Optimization of SSR-PCR Reaction System and Primer Screening of Tomato Leaf2235分 子植物育種Molecular Plant Breeding和寧夏自治區(qū)農(nóng)業(yè)育種專項 (NXNYYZ20150301)共同資助 。參考文獻Han H.Q., 2009, Analysisofgenetic diversityofeggplant (Solanummelongena L.) by morphological markers and SSR markers,Thesis for M.S., Shanghai Jiaotong University, Supervisor:Cheng H.Y., pp.1-36 (韓洪強 , 2009, 利用形態(tài)學標記和SSR 分子標記分析茄子種質(zhì)資源遺傳多樣性 , 碩士學位論文 , 上海交通大學 , 導師 : 陳火英 , pp.1-36)He R.F., Feng S.G., Chen Z., Shen X.X., Shen Y.F., Wang Z.,and Wang H.Z., 2015, Optimization and Ppimer screening ofSSR-PCR reaction system in medicinal chrysanthemummorifolium based on orthogonal design, Fenzi ZhiwuYuzhong (Molecular Plant Breeding), 13(2): 367-378 (何仁鋒 , 馮尚國 , 陳喆 , 沈曉霞 , 沈宇峰 , 王志安 , 王慧中 , 2015,藥用菊花 SSR-PCR 反應體系優(yōu)化及引物篩選 , 分子植物育種 , 13(2): 367-378)Li J.L., Wang S., Yu J., Wang L., and Zhou S.L., 2013, Amodified CTAB protocol for plant DNA extraction, ZhiwuXuebao (Chinese Bulletin of Botany), 48(1): 72-78 (李金璐 ,王碩 , 于婧 , 王玲 , 周世良 , 2013, 一種改良的植物 DNA 提取方法 , 植物學報 , 48(1): 72-78)Litt M., and Luty J.A., 1989, A hypervariable microsatelliterevealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeatwithin the cardiac muscle actin gene, Am. 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