33(3)427-432               中國生物防治學(xué)報  Chinese Journal of Biological Control                    2017 年 6 月  收稿日期： 2016-11-30 基金項目：甘肅省國際科技合作專項（ 1604WKCA010） ；甘肅省農(nóng)牧廳生物技術(shù)專項（ GNSW-2013-19） ；國家重點研發(fā)計劃（ 2016YFD0201112）  作者簡介：盧幸蓉，碩士研究生， E-mail： Luxingrong589126.com； *通信作者，教授， E-mail： xublgsau.edu.cn。 DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2017.03.019 黃瓜白粉病菌拮抗真菌鑒定及生防效果評價 盧幸蓉，陳大為，張樹武，劉  佳，徐秉良*（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院 /甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室，蘭州  730070）  摘要： 本文對黃瓜白粉病菌 Sphaerotheca fuliginea 拮抗真菌進行了篩選和鑒定及防治效果的評價。結(jié)果表明，從侵染黃瓜葉片的白粉病菌菌落邊緣組織中共分離獲得 21 個菌株，其中菌株 JK13 對白粉病菌具有較高的拮抗活性。菌株 JK13 發(fā)酵液處理白粉菌孢子 48 h 后，其對孢子萌發(fā)抑制率為 89.93%；發(fā)酵液處理發(fā)病的離體葉片和盆栽幼苗 7 d 后，其防治效果分別為 88.02%和 76.34%。利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)鑒定該菌為腐皮鐮刀菌 Fusarium solani。  關(guān)   鍵   詞： 黃瓜白粉??；拮抗真菌；鑒定；生物防治 中圖分類號： S476   文獻標識碼： A    文章編號： 1005-9261(2017)03-0427-06 Identification of Antagonistic Fungus against Sphaerotheca fuliginea and Evaluation of Its Biocontrol Efficacy  LU Xingrong, CHEN Dawei, ZHANG Shuwu, LIU Jia, XU Bingliang*(College of Plant Protection, Gansu Agricultural University/Bio-control Engineering Laboratory of Crop Diseases and Pests of Gansu Province, Lanzhou 730070, China) Abstracts: The antagonistic fungus against the pathogen Sphaerotheca fuliginea were isolated and assessed in this paper. The resulted showed that 21 strains of antagonistic fungus were isolated from the edge of cucumber tissue infected by S. fuliginea. Among all the isolated strains, the strain JK-13 presented the highest control efficacy in vitro and greenhouse experiments. The inhibitory rate on S. fuliginea spores germination was 83.93% after treated by strain JK-13 fermentation broth for 48 h. The control efficacy of strain JK-13 fermentation broth on S. fuliginea were 88.02% and 76.34% after treated for 7 d by leaf disc and pot experiments, respectively. Based on the morphological characteristic and molecular identification, the strain JK-13 was identified as Fusarium solani. Key words: cucumber powdery mildew; antagonistic fungus; identification; biological control  白粉病是黃瓜栽培過程中常見病害之一，在全國各地均有發(fā)生，尤其北方溫室和大棚內(nèi)最易發(fā)生。因白粉病影響葉片的光合作用，對黃瓜生長后期造成很大的產(chǎn)量損失，發(fā)病嚴重時可引起 50%的產(chǎn)量損失，甚至造成絕產(chǎn)1。隨著溫室黃瓜栽培面積的逐年增加，黃瓜白粉病的危害也更加廣泛。目前，黃瓜白粉病的防治主要依靠殺菌劑和抗病品種并結(jié)合一些簡單的農(nóng)業(yè)措施，但是隨著殺菌劑長時間的大量使用，白粉病菌對很多藥劑都產(chǎn)生了不同程度的抗性，防治效果開始大幅降低，同時，化學(xué)殺菌劑的長期大量使用對環(huán)境造成嚴重的污染，危害人畜健康。鑒于化學(xué)防治的不足，迫使人們尋求黃瓜白粉病新的防治措施。因此，具有環(huán)境友好、安全等特性的生物防治藥劑已成為國內(nèi)外黃瓜白粉病防治研究的新趨勢2。  楊春林等3研究表明，哈茨木霉 Trichoderma harzianum TH30 對黃瓜白粉病具有良好的生物防治效果，可有效控制黃瓜白粉病在田間擴展，相對防效達 69.9% 78.8%，且對供試植株安全；孫睿揆等4從土壤中分離篩選出短小芽胞桿菌 Bacillus pumilus 對辣椒白粉病菌 Oidiopsis sicula 的防治效果達 60.8%；伊艷428             中  國  生  物  防  治  學(xué)  報    第 33 卷  杰等5從小麥莖葉組織中分離到拮抗真菌鐮孢霉屬 Fusarium sp.和曲霉屬 Aspergillus sp.對小麥白粉病菌Blumeria graminis 防治效果分別為 82.14%和 88.49%。然而，目前有關(guān)黃瓜白粉病菌拮抗真菌鑒定及生防效果評價等方面的研究報道較少。因此，本研究從侵染黃瓜葉片的白粉病菌菌落邊緣組織進行拮抗真菌的分離、篩選和鑒定，并通過室內(nèi)和盆栽測定了拮抗菌株對黃瓜白粉病的防治效果，旨在為今后黃瓜白粉病的生物防治奠定基礎(chǔ)。  1  材料與方法  1.1  供試材料  黃瓜白粉病菌 Sphaerotheca fuliginea 由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院病理學(xué)實驗室提供。供試黃瓜品種新春四號（感病品種），由山東省寧陽縣新華研種子公司提供。  1.2  黃瓜白粉病菌拮抗菌株分離、純化及單孢分離  將室內(nèi)已發(fā)白粉病的黃瓜葉片經(jīng)無菌水沖洗干凈后晾干，并在無菌條件下將黃瓜葉片白粉病菌菌落邊緣組織處切成 0.5 cm2的小塊用 75%酒精進行消毒處理，然后，將切取的組織接種于馬鈴薯培養(yǎng)基（ PDA）進行拮抗真菌的分離，并置于 28 的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 7 10 d 后，待平板培養(yǎng)基上組織邊緣有菌絲長出后，在無菌條件下，進行單孢分離6，將菌種產(chǎn)生的孢子用無菌水洗脫并稀釋至每 10 L 懸浮液中有 1個孢子。滴在滅菌的載玻片上，在顯微鏡下檢查。將只有 1 個孢子的懸浮液，移植到 PDA 培養(yǎng)基上， 7 d后獲得純化菌株，編號，并保存?zhèn)溆谩? 1.3  白粉病菌分生孢子懸浮液及其拮抗真菌發(fā)酵液制備  在超凈工作臺上用毛筆輕輕將黃瓜植株葉片上新鮮的分生孢子刷于盛有 0.5% SDS 水溶液的燒杯中，混勻后在 10 10 顯微鏡下鏡檢，配成孢子濃度為 1 107孢子 /mL 的分生孢子懸浮液。  分離獲得的黃瓜白粉病菌拮抗菌株經(jīng) PDA 培養(yǎng)基活化后，打取菌餅（ d 0.5 cm）接種于裝有 60 mL PDB 培養(yǎng)基三角瓶（ 150 mL）中，于 28 、 180 r/min 搖瓶培養(yǎng) 3 d 后，取上清液經(jīng) 0.22 m 微孔過濾器過濾，收集發(fā)酵濾液（原液）， 4 保存?zhèn)溆谩? 1.4  初篩試驗  采用孢子萌發(fā)抑制法7。將直徑為 0.5 cm 滅菌的瓊脂培養(yǎng)基放入預(yù)先制備好的各菌株發(fā)酵原液中浸泡24 h 后置于載玻片之上，以無菌水浸泡的培養(yǎng)基作為對照，然后將待測的黃瓜白粉病菌孢子懸浮液（ 1107孢子 /mL） 20 L 加入到該瓊脂培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)皿中保濕，置于 25 和 16 h 光照、相對濕度為 80%的人工氣候箱中培養(yǎng) 48 h，鏡檢并計算孢子萌發(fā)抑制率，并將篩選出抑制效果較好的菌株作為復(fù)篩試驗的供試菌株。試驗每個處理和對照均重復(fù) 5 次。  1.5  復(fù)篩試驗  采用葉圓盤法8和室內(nèi)盆栽的方法。（ 1）采集長勢相同的健康黃瓜葉片，在超凈工作臺上，將葉片用無菌水沖洗干凈后， 在 0.1%升汞溶液中浸泡 60 s， 再放入 75%的酒精中消毒 30 s， 取出后用無菌水沖洗 34 次，待葉片晾干后，用打孔器將健葉打成直徑為 1.5 cm 的葉圓盤，在各供試菌株發(fā)酵原液中浸濕，后在無菌條件下晾干，置于鋪滿脫脂棉（在 50 mg/L 的苯并咪唑溶液浸濕）的無菌培養(yǎng)皿中。用移液槍接種分生孢子懸浮液（ 1 107孢子 /mL） 10 L 于葉圓盤，置于 25 和 16 h 光照、相對濕度為 85%的人工氣候箱中培養(yǎng)。每個處理 5 個重復(fù)，以無菌水為空白對照，并每天滴加營養(yǎng)液保持葉圓盤的濕潤， 7 d 后統(tǒng)計病情指數(shù)。（ 2）各供試菌株的發(fā)酵原液噴施在 4 葉期健康的黃瓜幼苗上，每盆 3 株，共噴 50 mL。 24 h 后接種白粉孢子懸浮液（ 1 107孢子 /mL），共 20 mL。每個處理 5 盆， 3 次重復(fù)，以無菌水作為對照， 7 d 后統(tǒng)計病情指數(shù)。葉圓盤法和室內(nèi)盆栽法葉面病情分級標準一致。  黃瓜白粉病葉面病情分級標準9： 0 級，葉片無病斑； 1 級，葉片病斑面積占整個葉面積的 5%以下； 3級，病斑面積占整個葉面積的 5% 15%； 5 級，病斑面積占整個葉面積的 15% 25%； 7 級，病斑面積占整個葉面積的 26% 50%； 9 級，病斑面積占整個葉面積的 51% 75%； 11 級，病斑面積占整個葉面積的76%以上。  病情指數(shù) （各級病葉數(shù)各級代表值） /（調(diào)查總?cè)~數(shù)發(fā)病最高級代表值） 100；防治效果（ %）  第 3 期               盧幸蓉等：黃瓜白粉病菌拮抗真菌鑒定及生防效果評價  429 （對照病情指數(shù)處理病情指數(shù)） /對照病情指數(shù) 100。  1.6  菌株 JK13 室內(nèi)防病效果測定  分別利用 JK13 發(fā)酵液原液和 10 倍、 100 倍和 1000 倍稀釋液噴施于四葉期健康的幼苗上， 每盆 3 株，共噴 50 mL， 24 h 后接種白粉病菌孢子懸浮液（ 1 107孢子 /mL），共 20 mL。每個處理 5 盆， 3 次重復(fù)，以無菌水作為對照， 7 d 后統(tǒng)計病情指數(shù)。  1.7  菌株 JK13 對黃瓜白粉菌孢子拮抗機制  采用離體葉片法進行試驗，方法同 15。經(jīng)菌株 JK13 發(fā)酵原液處理過的離體葉片，接種白粉菌后 5 d取樣，并用直徑為 0.5 cm 打孔器切下葉盤，按水合氯醛組織透明染色法6制樣后，處理 2 d 后在顯微鏡下觀察拍照，以無菌水作為對照。  1.8  菌株 JK13 鑒定  菌株鑒定采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合。形態(tài)學(xué)鑒定參考真菌鑒定手冊10，根據(jù)菌落的生長特性、顏色、菌絲的形態(tài)特征、孢子的形態(tài)、大小等進行鑒定。  分子生物學(xué)鑒定：采用 CTAB 法11提取菌株基因組 DNA，采用真菌通用引物 ITSF（ 5TCCGTAG GTGAACCTGCGG3）和 ITSR（ 5TCCTCCGCTTATTGATATGC3）12進行 ITS 序列擴增， PCR 擴增產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司純化并測序，利用 Blastn（ http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/）與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對，獲得相近菌株 rDNAITS 序列，利用 Clustalx 1.8 按照最高同源性的原則進行排序，采用 MEGA 5.0 軟件 Neighborjoining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并采用自舉法（ bootstrap）對系統(tǒng)發(fā)育樹進行檢驗，重復(fù) 1000 次。  1.9  數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析  數(shù)據(jù)采用 Excel 2007 軟件進行統(tǒng)計分析和作圖， 并采用 SPSS 19.0 軟件和 Duncan 氏新復(fù)極差法進行多重比較（ P 0.05）。  2  結(jié)果與分析  2.1  拮抗真菌分離及其對孢子萌發(fā)的影響  根據(jù)菌落形態(tài)和顏色等特性，從已發(fā)病葉片病健交界處共分離純化到 21 株真菌，編號分別為 JK1JK21。孢子萌發(fā)抑制結(jié)果表明，抑制率在 50%以上有 4 個菌株，分別為 JK11、 JK13、 JK18 和 JK21，其抑制率分別為 85.80%、 89.93%、 65.63%和 58.83%，其中 JK13 抑制率最高（表 1）。  表 1  不同拮抗真菌對黃瓜白粉病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用  Table 1  The inhibitory effect of different strains on the spore germination of S. fuliginea 菌株  Strains 抑制率  Inhibitory efficiency (%) 菌株  Strains 抑制率  Inhibitory efficiency (%) JK13 89.93 0.83 a JK12 39.97 0.29 de JK11 85.80 0.49 a JK4 38.87 0.83 de JK18 65.63 0.41 b JK9 38.73 0.34 de JK21 58.83 0.94 bc JK15 36.57 0.52 de JK6 47.20 0.18 cd JK14 34.83 0.17 de JK8 44.63 0.34 cd JK2 34.00 0.44 de JK20 43.80 0.61 cde JK10 32.90 0.17 de JK16 41.77 0.47 de JK7 27.53 0.63 ef JK5 40.43 0.88 de JK3 27.17 0.82 ef JK19 40.10 0.15 de JK1 15.20 0.32 f   JK17 40.03 0.18 de CK 13.27 0.52 f 注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表示在 0. 05 水平上差異顯著。下同。 CK 為無菌水。  Note: Data in the same column followed by different letters were significantly different at 0.05 level. The same as below. CK was sterile water. 430             中  國  生  物  防  治  學(xué)  報    第 33 卷  2.2  離體試驗防治效果  對孢子萌發(fā)抑制試驗篩選的 4 株真菌 JK11、 JK13、 JK18 和 JK21 進行離體葉片防治效果測定表明， 4 個菌株對白粉病均有一定的防治效果，且差異顯著，其中 JK13 防治效果最佳，防效為 88.02%（表2），另經(jīng) JK13 發(fā)酵液處理過的葉片病斑數(shù)量明顯低于對照（圖 1）。  JK13 CK圖 1  葉圓盤法測定菌株 JK-13 對黃瓜白粉病防治效果  Fig. 1  The control effect of entophytic fungi JK-13 on cucumber powdery mildew by leaf disc 2.3  室內(nèi)盆栽試驗防治效果  對孢子萌發(fā)抑制試驗篩選出的 4 株真菌 JK11、 JK13、 JK18 和 JK21 進行室內(nèi)盆栽防治效果試驗，結(jié)果表明 4 株真菌處理后黃瓜幼苗的病情指數(shù)分別為 40.55、 20.18、 51.90、 46.84， 與對照之間存在顯著差異。其中菌株 JK13 對黃瓜白粉病室內(nèi)盆栽防治最佳為 76.34%，菌株 JK18 防治效果最差為 39.16%（表 3）。  表 2  4 株真菌對黃瓜白粉病離體葉片防治效果  Table 2  The control effect of four entophytic fungi strains on cucumber powdery mildew  菌株  Strains 病情指數(shù)  Disease index 防治效果  Control efficacy (%) JK11 34.93 0.23 d 59.99 0.55 b JK13 10.47 0.55 e 88.02 0.61 a JK18 49.19 0.25 c 43.68 0.47 c JK21 57.56 0.48 b 34.08 0.97 d CK 87.35 0.38 a 表 3  4 株真菌對黃瓜白粉病室內(nèi)盆栽防治效果  Table 3  The control effect of four entophytic fungi strains on cucumber powdery mildew in greenhouse 菌株  Strains 病情指數(shù)  Disease index 防治效果  Control efficacy (%) JK11 40.55 0.59 d 52.46 0.57 b JK13 20.18 0.40 e 76.34 0.40 a JK18 51.90 0.78 b 39.16 0.82 d JK21 46.84 0.77 c 45.09 0.76 c CK 85.31 0.23 a 2.4  菌株 JK13 的鑒定  菌株 JK13 在 PDA 培養(yǎng)基上 25 培養(yǎng)，氣生菌絲薄絨狀，白至淺灰色；背面無色，有時產(chǎn)生藍或綠色的色素圈；在 PDA 培養(yǎng)基上小型分生孢子數(shù)量多，呈卵形或腎形，直徑（ 5.5 14.5） m（ 2.04.0） m；大型分生孢子馬特型； 1 6 層隔膜，（ 7.0 56.0）（ 2.5 5.0） m；厚垣孢子呈球形，單生、對生或串生，直徑 5 12 m；產(chǎn)孢細胞長筒形，單瓶梗，大多數(shù)瓶梗長于 45 m。腐皮鐮刀菌菌落較平坦，全緣呈圓形，灰白色、淡藍色或藍褐色，有時可見清晰的圈帶。菌絲稀疏至厚密，呈稀絨狀。大型分生孢子產(chǎn)于分生孢子座上或氣生菌絲單生瓶梗上，直或彎曲，多為不等邊紡錘形， l 5 隔， 3 隔居多，呈馬特型。小型分生孢子，孢子卵形或腎形，前期數(shù)量較多，以假頭狀著生于產(chǎn)孢細胞上， 0 1隔膜。厚垣孢子產(chǎn)自氣生菌絲短側(cè)生分枝的頂端，或在大型分生孢子中形成，進而初步鑒定菌株 JK13為腐皮鐮刀菌 Fusarium solani10。  菌株 JK-13 經(jīng) rDNA-ITS 序列通用真菌引物 PCR 擴增后，經(jīng)測序并通過利用 Blastn 對該序列和GenBank 中已登錄的 rDNA-ITS 序列進行同源性比較，該菌與腐皮鐮刀同源性均在 99%以上，將比對結(jié)果中相似性較高菌株序列與供試拮抗菌的序列一起用 DNASTAR 軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹（圖 2）。通過分子生  第 3 期               盧幸蓉等：黃瓜白粉病菌拮抗真菌鑒定及生防效果評價  431 圖 2  基于 18s rDNA 序列構(gòu)建菌株 JK13 系統(tǒng)發(fā)育樹  Fig. 2  Structuring phylogenetic tree of entophytic fungi strains based on 18s rDNA-ITS sequences homology 物學(xué)鑒定結(jié)果并結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征，確定該菌為腐皮鐮刀菌。  2.5  菌株 JK13 對室內(nèi)盆栽黃瓜白粉病的防治效果評價  經(jīng)上述孢子萌發(fā)抑制試驗、葉圓盤法和室內(nèi)盆栽防治試驗后，獲得對黃瓜白粉病有顯著防治效果的菌株 JK13。不同稀釋倍數(shù)的菌株 JK13 發(fā)酵液對黃瓜白粉病均有一定的防治效果，隨著稀釋倍數(shù)的增大，防治效果依次降低，菌株 JK13 發(fā)酵液原液對黃瓜白粉病防治效果最好，達 77.97%（表 4）。  2.6  菌株 JK13 對黃瓜白粉病菌的拮抗機制  通過水合氯醛組織透明染色處理以后，經(jīng)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，用菌株 JK13 發(fā)酵液原液處理后的白粉病菌分生孢子不萌發(fā)或停止萌發(fā)，分生孢子及分生孢子梗出現(xiàn)皺縮，而對照中白粉病菌分生孢子正常生長（圖 3）。  表 4  菌株 JK13 對黃瓜白粉病的室內(nèi)防治效果  Table 4  The control efficacy of entophytic fungi JK13 on cucumber powdery mildew in greenhouse 稀釋倍數(shù)  Dilution 病情指數(shù)  Disease index 防治效果  Control efficacy (%) 原液  Stock solution 17.98 0.15 e 77.97 0.24 a 10 22.02 0.21 d 69.31 0.47 b 100 40.96 0.81 c 49.77 0.63 c 1000 77.63 0.59 b 4.77 0.13 d CK 81.53 0.59 a A： CK； B：菌株 Strain JK13 圖 3  顯微鏡觀察菌株 JK13 對黃瓜白粉病菌孢子形態(tài)的影響  Fig. 3  Microscope observation on the effects of strain JK-13 on the spore morphology of S. fuliginea  3  討論  本研究通過利用葉盤法和室內(nèi)盆栽試驗進行初篩和復(fù)篩，獲得一株對黃瓜白粉病具有較好防治效果的菌株 JK13，其平均防治效果為 82.18%，與前期研究結(jié)果基本一致。范瑛閣等13采用孢子萌發(fā)抑制試驗測432             中  國  生  物  防  治  學(xué)  報    第 33 卷  定了 4 株生防細菌 H1、 H2、 H3和 H7對黃瓜白粉病防治效果，表明其防治效果分別為 91.25%、 87.77%、82.7%和 75.29%。 Gafni 等14研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生酵母菌 Pseudozyma aphidis 抑制病原菌生長主要通過產(chǎn)生菌絲體寄生于白粉病菌菌絲和孢子上，但本試驗發(fā)現(xiàn) JK13 發(fā)酵液能夠?qū)е掳追劬稚咦油Ｖ姑劝l(fā)，分生孢子及分生孢子梗出現(xiàn)皺縮。  本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法將菌株 JK13 鑒定為腐皮鐮刀菌。 國內(nèi)目前在鐮刀菌生防應(yīng)用方面也有相關(guān)報道，屈佳玉15分離得到茄腐鐮刀菌的代謝物原液對大豆胞囊線蟲 Heterodera glycines 2 齡幼蟲的致死率為 96.8%；付潔等16研究表明禾谷鐮刀菌 F. graminearum 毒素對油菜菌核病菌 Sclerotinia sclerotiorum、 玉米大斑病菌 Exserohilum turcicum 和蘋果褐腐病菌 Clerotinia fructigena 具有很強的抑制活性；段玉璽等17研究發(fā)現(xiàn)鐮刀菌 Snef332 對南方根結(jié)線蟲 Meloidogyne incognita 校正死亡率達 91.39%。除此之外，鐮刀菌對雜草生防應(yīng)用方面也有報道， Boari 和 Vurro18篩選出彎角鐮孢菌 F. camptoceras 和厚垣鐮孢菌 F. chlamydosporum 對分枝列當?shù)姆乐涡Ч蛇_ 50%，篩選的尖孢鐮刀菌 F. oxysporum 和腐皮鐮刀菌對分枝列當?shù)姆乐涡Ч蛇_ 60% 70%；李健等19研究表明厚垣孢鐮刀菌對雜草馬唐 Digitaria sanguinalis具有良好的防治效果，但是有關(guān)腐皮鐮刀菌對黃瓜白粉病的防效目前尚未見報道。  因此，拮抗真菌腐皮鐮刀菌發(fā)酵液在防治黃瓜白粉病上具有廣闊的應(yīng)用前景，但目前的研究仍處于初級階段，還需進一步深入研究，如該菌發(fā)酵液在田間防治效果及防效穩(wěn)定性、對植物的安全性、人畜毒性和生產(chǎn)加工工藝等問題。  參  考  文  獻  1 Dik A J, VerhaarM A, Berlanger R R. 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