北方園藝（）： 食 用 菌第一作者簡介：劉國麗（），女，碩士，助理研究員，現(xiàn)主要從事食用菌遺傳育種等研究工作。：責(zé)任作者：張敏（），女，博士，研究員，現(xiàn)主要從事食用菌育種及栽培等研究工作。：基金項目：遼寧省自然科學(xué)基金資助項目（）；國家食用菌產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助項目（）。收稿日期：二十個黑木耳菌株的酯酶同工酶分析劉 國 麗，李紅，呂 立 濤，張敏（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食用菌研究所，遼寧 沈陽）摘要：以個（）黑木耳菌株為試材，采用拮抗試驗和酯酶同工酶試驗分析了其遺傳多樣性，以期為遼寧黑木耳的親緣關(guān)系和遺傳育種研究提供參考依據(jù)。結(jié)果表明：試驗共檢出遷移率不同的譜帶條，個菌株間的遺傳相似系數(shù)變化范圍在。當(dāng)遺傳相異系數(shù)為時，供試菌株被聚成個類群，和自成一類，其余為第三類。說明絕大多數(shù)黑木耳菌株親緣關(guān)系很近，且聚類分析結(jié)果與形態(tài)觀察及拮抗試驗結(jié)果基本一致。關(guān)鍵詞：黑木耳；拮抗試驗；酯酶同工酶；聚類分析中圖分類號： 文獻標(biāo)識碼： 文章編號：（）黑木耳（ ）屬擔(dān)子菌門、層菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬。又名木耳、細(xì)木耳，是我國最先栽培的食用菌之一。黑木耳是我國著名的“山珍”之一，享有“黑色瑰寶”“素中之葷”之美譽，已經(jīng)成為世界各國廣大消費者的美味佳肴。目前市場上黑木耳菌種名目繁多，菌種管理相對滯后，亂引種、亂命名現(xiàn)象比較普遍，導(dǎo)致同名異種或同種異名現(xiàn)象比較嚴(yán)重，老化、退化和劣質(zhì)菌種流入生產(chǎn)，不僅造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，還給科研工作帶來很多困難，嚴(yán)重影響著黑木耳產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。同工酶指一類具有相同功能，但分別由不同等位基因或不同基因位點編碼的蛋白質(zhì)。由于不同的菌種中同工酶的基因位點不同，同工酶技術(shù)能夠從本質(zhì)上揭示菌株間的遺傳差異，為雜交親本的選擇提供非常重要的參考依據(jù)。現(xiàn)已大量應(yīng)： ， ， （， ， ， ， ）， ， ， ， ， （）， （）， （）， ： ； ； ； 用于誘變育種的融合子和雜交育種的菌株特性及種質(zhì)鑒定方面，特別是在食用菌的研究中應(yīng)用更為廣泛。該研究對個黑木耳的主要栽培品種進行了拮抗試驗和酯酶同工酶分析試驗，旨在為黑木耳的優(yōu)良品種選育、種性鑒定及菌種管理等工作提供參考依據(jù)。 材料與方法 試驗材料供試黑木耳菌株共有個，品種名及來源見表。表黑木耳供試品種 菌株編號 品種名 來源 “長城號” 吉林省琿春長城菌業(yè)科技開發(fā)有限公司“野生號” 撫順市清原縣采集“木” 黑龍江省微生物研究所“純黑山” 遼寧三友農(nóng)業(yè)生物科技有限公司“野生號” 黑龍江省海林市山市鎮(zhèn)勝利村采集“野生號” 內(nèi)蒙古呼倫貝爾市鄂倫春阿榮旗采集“黑優(yōu)” 黑龍江省亞布力忠正食用菌研究所“” 遼寧三友農(nóng)業(yè)生物科技有限公司“” 大連全禾菌業(yè)有限公司“豐產(chǎn)” 遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所“神” 吉林省海瀾生物技術(shù)有限公司“新科” 江蘇省江都天達食用菌研究所“鐵” 鐵嶺縣白旗寨鄉(xiāng)凡河源黑木耳種植專業(yè)合作社“春寶” 吉林省海瀾生物技術(shù)有限公司“新科” 江蘇省江都天達食用菌研究所“海元” 吉林省海瀾生物技術(shù)有限公司“黑威” 撫順大金禾食用菌有限公司“豐產(chǎn)王” 遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所“” 大連全禾菌業(yè)有限公司“菊” 江蘇省江都天達食用菌研究所 試驗方法 菌種活化挑取供試黑木耳菌絲左右接種至綜合培養(yǎng)基上進行活化，置于黑暗條件下培養(yǎng)，將菌絲長勢強的菌種用于拮抗試驗。 拮抗試驗將所有菌株每個為一組進行組合，每個菌種用直徑打孔器打取個菌絲塊，交叉循環(huán)，設(shè)置個重復(fù)。每平皿接種個菌株，按“品”字形排列。菌株間距左右，置于黑暗條件下培養(yǎng)，觀察不同菌株間拮抗線形成是否存在及明顯情況。 酯酶同工酶鑒定將活化后的供試菌株轉(zhuǎn)接到液體綜合培養(yǎng)基上，、避光培養(yǎng)，過濾收集搖瓶中的菌絲體，并用無菌水沖洗干凈，濾紙吸干水分，稱取菌絲體放入研缽中，加入適量液氮充分研磨后，裝入離心管中，加入等量研磨液，于、 離心。棄去沉淀取上清，置于離心管中，低溫保存?zhèn)溆?。采用垂直平板不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳進行酯酶同工酶分析。將樣品與蔗糖（）混合后點樣，加樣量，先低壓電泳一段時間，待進入分離膠后再加大到所需電壓，電泳在冰箱中進行。電泳完畢后，取出凝膠，進行染色和固定，下保存。 數(shù)據(jù)分析根據(jù)酯酶同工酶電泳結(jié)果，在凝膠上具有相同遷移率的位置上有條帶的記為，無條帶的記為。統(tǒng)計各菌株的同工酶條帶信息，采用進行系統(tǒng)聚類分析，得到各菌株同工酶的差異系數(shù)矩陣表及聚類樹狀圖，對各菌株進行遺傳分析。 結(jié)果與分析 拮抗試驗結(jié)果由表可知，共檢測拮抗組合數(shù)個，其中與其它供試菌株均有明顯的拮抗線（圖），說明與其它菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，為獨立菌株。與、與、，與也均有明顯的拮抗線。其它組合拮抗反應(yīng)不明顯（圖），說明親緣關(guān)系較近或為同株異名。 酯酶同工酶的多態(tài)性分析由圖可知，在相同的條件下，個黑木耳菌株共有條酯酶同工酶條帶。值在（ ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ，）。其中，、為個菌株共有北方園藝月（上）表拮抗試驗結(jié)果 菌株編號 注：表示拮抗反應(yīng)明顯；表示有拮抗反應(yīng)，但是不明顯；無拮抗反應(yīng)。： ； ； 注：拮抗反應(yīng)明顯；拮抗反應(yīng)不明顯。箭頭位置為拮抗線。： ； 圖拮抗試驗 的條基礎(chǔ)性共有酶帶。菌株譜帶分布和其它菌株差異較大，共有條特有譜帶，分別為和；菌株有條特有譜帶；有條特有譜帶；有條特有譜帶，這些特有譜帶可作為菌株與其它菌株鑒別的依據(jù)。和具有相同的酶帶，與、譜帶相同，說明它們具有極相近的親緣關(guān)系，很有可能是同株異名。檢測到的條帶數(shù)最少，僅為個。 聚類分析由表可知，個菌株間的遺傳相似系數(shù)變化范圍在。部分菌株（和、和、和、和、和）之間相似系數(shù)為，顯示它們親緣關(guān)系很近，這些菌株很有可能為同物異名，需要從多個方面予以比較鑒別。從圖可以看出，當(dāng)遺傳相異系數(shù)為時，供試菌株被聚類成個類群：和自成一類，第三類為、 第期北方園藝圖供試菌株的同工酶酶譜 表個黑木耳菌株間的遺傳相似性系數(shù) 菌株編號 、。 討論與結(jié)論該研究對目前市場上個黑木耳的主要栽培品種進行了拮抗試驗和酯酶同工酶分析，得到個黑木耳供試菌株的遺傳相似系數(shù)和聚類分析樹狀圖，初步鑒定了個供試菌株之間的親緣關(guān)系。結(jié)果表明，個黑木耳菌株的酯酶多態(tài)性較高，種質(zhì)資源較為豐富，部分菌株之間酶帶相似性極高，可以初步判斷這些菌株親緣關(guān)系較近，很有可能是同株異名，例如和，和，和，和，和，雖然來自不同地區(qū)，親緣關(guān)系卻很近，這可能與目前我北方園藝月（上）圖黑木耳菌株聚類分析 國各地互相穿插引種、菌種管理混亂等有關(guān)，與唐利華等的研究結(jié)論相似。該研究為遼寧省黑木耳優(yōu)良菌種的選育以及菌種的管理工作提供參考依據(jù)。由于酯酶活性受外界因素的影響較大，酯酶同工酶試驗的穩(wěn)定性以及可重復(fù)性不高，還需采用和等分子標(biāo)記技術(shù)對個黑木耳供試菌株進一步分類鑒別。參考文獻馬云橋，張介弛黑龍江省黑木耳菌種生產(chǎn)現(xiàn)狀及發(fā)展對策北方園藝，（）：唐利華，郭倩，王瑞娟，等中國黑木耳主要栽培菌株酯酶同工酶的研究食用菌學(xué)報，（）：秦俊哲，谷珅睿，陳合個靈芝菌株的酯酶同工酶分析微生物學(xué)通報，（）：韋仕巖，王燦琴，覃曉娟，等金福菇菌株的酯酶同工酶分析基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，（）：李紅，肖千明，張敏遼寧省黑木耳主栽品種的酯酶同工酶分析湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，（）：邊銀丙，羅信昌，周啟木耳栽培菌株酯酶同工酶的酶譜多樣性研究菌物系統(tǒng)，（）： ， ， ， （ ， ， ）： （） ， ， ， ： ； ； ； 第期北方園藝