北方園藝（）： ·食 用 菌·第一作者簡(jiǎn)介：劉國(guó)麗（），女，碩士，助理研究員，現(xiàn)主要從事食用菌遺傳育種等研究工作。：責(zé)任作者：張敏（），女，博士，研究員，現(xiàn)主要從事食用菌育種及栽培等研究工作。：基金項(xiàng)目：遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（）；國(guó)家食用菌產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助項(xiàng)目（）。收稿日期：二十個(gè)黑木耳菌株的酯酶同工酶分析劉 國(guó) 麗，李紅，呂 立 濤，張敏（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食用菌研究所，遼寧 沈陽(yáng)）摘要：以個(gè)（）黑木耳菌株為試材，采用拮抗試驗(yàn)和酯酶同工酶試驗(yàn)分析了其遺傳多樣性，以期為遼寧黑木耳的親緣關(guān)系和遺傳育種研究提供參考依據(jù)。結(jié)果表明：試驗(yàn)共檢出遷移率不同的譜帶條，個(gè)菌株間的遺傳相似系數(shù)變化范圍在。當(dāng)遺傳相異系數(shù)為時(shí)，供試菌株被聚成個(gè)類群，和自成一類，其余為第三類。說(shuō)明絕大多數(shù)黑木耳菌株親緣關(guān)系很近，且聚類分析結(jié)果與形態(tài)觀察及拮抗試驗(yàn)結(jié)果基本一致。關(guān)鍵詞：黑木耳；拮抗試驗(yàn)；酯酶同工酶；聚類分析中圖分類號(hào)： 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： 文章編號(hào)：（）黑木耳（ ）屬擔(dān)子菌門、層菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬。又名木耳、細(xì)木耳，是我國(guó)最先栽培的食用菌之一。黑木耳是我國(guó)著名的“山珍”之一，享有“黑色瑰寶”“素中之葷”之美譽(yù)，已經(jīng)成為世界各國(guó)廣大消費(fèi)者的美味佳肴。目前市場(chǎng)上黑木耳菌種名目繁多，菌種管理相對(duì)滯后，亂引種、亂命名現(xiàn)象比較普遍，導(dǎo)致同名異種或同種異名現(xiàn)象比較嚴(yán)重，老化、退化和劣質(zhì)菌種流入生產(chǎn)，不僅造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，還給科研工作帶來(lái)很多困難，嚴(yán)重影響著黑木耳產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。同工酶指一類具有相同功能，但分別由不同等位基因或不同基因位點(diǎn)編碼的蛋白質(zhì)。由于不同的菌種中同工酶的基因位點(diǎn)不同，同工酶技術(shù)能夠從本質(zhì)上揭示菌株間的遺傳差異，為雜交親本的選擇提供非常重要的參考依據(jù)。現(xiàn)已大量應(yīng)： ， ， （， ， ， ， ）， ， ， ， ， （·）， （）， （）， ： ； ； ； 用于誘變育種的融合子和雜交育種的菌株特性及種質(zhì)鑒定方面，特別是在食用菌的研究中應(yīng)用更為廣泛。該研究對(duì)個(gè)黑木耳的主要栽培品種進(jìn)行了拮抗試驗(yàn)和酯酶同工酶分析試驗(yàn)，旨在為黑木耳的優(yōu)良品種選育、種性鑒定及菌種管理等工作提供參考依據(jù)。 材料與方法 試驗(yàn)材料供試黑木耳菌株共有個(gè)，品種名及來(lái)源見(jiàn)表。表黑木耳供試品種 菌株編號(hào) 品種名 來(lái)源 “長(zhǎng)城號(hào)” 吉林省琿春長(zhǎng)城菌業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限公司“野生號(hào)” 撫順市清原縣采集“木” 黑龍江省微生物研究所“純黑山” 遼寧三友農(nóng)業(yè)生物科技有限公司“野生號(hào)” 黑龍江省海林市山市鎮(zhèn)勝利村采集“野生號(hào)” 內(nèi)蒙古呼倫貝爾市鄂倫春阿榮旗采集“黑優(yōu)” 黑龍江省亞布力忠正食用菌研究所“” 遼寧三友農(nóng)業(yè)生物科技有限公司“” 大連全禾菌業(yè)有限公司“豐產(chǎn)” 遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所“神” 吉林省海瀾生物技術(shù)有限公司“新科” 江蘇省江都天達(dá)食用菌研究所“鐵” 鐵嶺縣白旗寨鄉(xiāng)凡河源黑木耳種植專業(yè)合作社“春寶” 吉林省海瀾生物技術(shù)有限公司“新科” 江蘇省江都天達(dá)食用菌研究所“海元” 吉林省海瀾生物技術(shù)有限公司“黑威” 撫順大金禾食用菌有限公司“豐產(chǎn)王” 遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所“” 大連全禾菌業(yè)有限公司“菊” 江蘇省江都天達(dá)食用菌研究所 試驗(yàn)方法 菌種活化挑取供試黑木耳菌絲左右接種至綜合培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，置于黑暗條件下培養(yǎng)，將菌絲長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)的菌種用于拮抗試驗(yàn)。 拮抗試驗(yàn)將所有菌株每個(gè)為一組進(jìn)行組合，每個(gè)菌種用直徑打孔器打取個(gè)菌絲塊，交叉循環(huán)，設(shè)置個(gè)重復(fù)。每平皿接種個(gè)菌株，按“品”字形排列。菌株間距左右，置于黑暗條件下培養(yǎng)，觀察不同菌株間拮抗線形成是否存在及明顯情況。 酯酶同工酶鑒定將活化后的供試菌株轉(zhuǎn)接到液體綜合培養(yǎng)基上，、·避光培養(yǎng)，過(guò)濾收集搖瓶中的菌絲體，并用無(wú)菌水沖洗干凈，濾紙吸干水分，稱取菌絲體放入研缽中，加入適量液氮充分研磨后，裝入離心管中，加入等量研磨液，于、 ·離心。棄去沉淀取上清，置于離心管中，低溫保存?zhèn)溆?。采用垂直平板不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行酯酶同工酶分析。將樣品與蔗糖（）混合后點(diǎn)樣，加樣量，先低壓電泳一段時(shí)間，待進(jìn)入分離膠后再加大到所需電壓，電泳在冰箱中進(jìn)行。電泳完畢后，取出凝膠，進(jìn)行染色和固定，下保存。 數(shù)據(jù)分析根據(jù)酯酶同工酶電泳結(jié)果，在凝膠上具有相同遷移率的位置上有條帶的記為，無(wú)條帶的記為。統(tǒng)計(jì)各菌株的同工酶條帶信息，采用進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，得到各菌株同工酶的差異系數(shù)矩陣表及聚類樹(shù)狀圖，對(duì)各菌株進(jìn)行遺傳分析。 結(jié)果與分析 拮抗試驗(yàn)結(jié)果由表可知，共檢測(cè)拮抗組合數(shù)個(gè)，其中與其它供試菌株均有明顯的拮抗線（圖），說(shuō)明與其它菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，為獨(dú)立菌株。與、與、，與也均有明顯的拮抗線。其它組合拮抗反應(yīng)不明顯（圖），說(shuō)明親緣關(guān)系較近或?yàn)橥戤惷?酯酶同工酶的多態(tài)性分析由圖可知，在相同的條件下，個(gè)黑木耳菌株共有條酯酶同工酶條帶。值在（ ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ，）。其中，、為個(gè)菌株共有北方園藝月（上）表拮抗試驗(yàn)結(jié)果 菌株編號(hào) 注：表示拮抗反應(yīng)明顯；表示有拮抗反應(yīng)，但是不明顯；無(wú)拮抗反應(yīng)。： ； ； 注：拮抗反應(yīng)明顯；拮抗反應(yīng)不明顯。箭頭位置為拮抗線。： ； 圖拮抗試驗(yàn) 的條基礎(chǔ)性共有酶帶。菌株譜帶分布和其它菌株差異較大，共有條特有譜帶，分別為和；菌株有條特有譜帶；有條特有譜帶；有條特有譜帶，這些特有譜帶可作為菌株與其它菌株鑒別的依據(jù)。和具有相同的酶帶，與、譜帶相同，說(shuō)明它們具有極相近的親緣關(guān)系，很有可能是同株異名。檢測(cè)到的條帶數(shù)最少，僅為個(gè)。 聚類分析由表可知，個(gè)菌株間的遺傳相似系數(shù)變化范圍在。部分菌株（和、和、和、和、和）之間相似系數(shù)為，顯示它們親緣關(guān)系很近，這些菌株很有可能為同物異名，需要從多個(gè)方面予以比較鑒別。從圖可以看出，當(dāng)遺傳相異系數(shù)為時(shí)，供試菌株被聚類成個(gè)類群：和自成一類，第三類為、 第期北方園藝圖供試菌株的同工酶酶譜 表個(gè)黑木耳菌株間的遺傳相似性系數(shù) 菌株編號(hào) 、。 討論與結(jié)論該研究對(duì)目前市場(chǎng)上個(gè)黑木耳的主要栽培品種進(jìn)行了拮抗試驗(yàn)和酯酶同工酶分析，得到個(gè)黑木耳供試菌株的遺傳相似系數(shù)和聚類分析樹(shù)狀圖，初步鑒定了個(gè)供試菌株之間的親緣關(guān)系。結(jié)果表明，個(gè)黑木耳菌株的酯酶多態(tài)性較高，種質(zhì)資源較為豐富，部分菌株之間酶帶相似性極高，可以初步判斷這些菌株親緣關(guān)系較近，很有可能是同株異名，例如和，和，和，和，和，雖然來(lái)自不同地區(qū)，親緣關(guān)系卻很近，這可能與目前我北方園藝月（上）圖黑木耳菌株聚類分析 國(guó)各地互相穿插引種、菌種管理混亂等有關(guān)，與唐利華等的研究結(jié)論相似。該研究為遼寧省黑木耳優(yōu)良菌種的選育以及菌種的管理工作提供參考依據(jù)。由于酯酶活性受外界因素的影響較大，酯酶同工酶試驗(yàn)的穩(wěn)定性以及可重復(fù)性不高，還需采用和等分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)個(gè)黑木耳供試菌株進(jìn)一步分類鑒別。參考文獻(xiàn)馬云橋，張介弛黑龍江省黑木耳菌種生產(chǎn)現(xiàn)狀及發(fā)展對(duì)策北方園藝，（）：唐利華，郭倩，王瑞娟，等中國(guó)黑木耳主要栽培菌株酯酶同工酶的研究食用菌學(xué)報(bào)，（）：秦俊哲，谷珅睿，陳合個(gè)靈芝菌株的酯酶同工酶分析微生物學(xué)通報(bào)，（）：韋仕巖，王燦琴，覃曉娟，等金福菇菌株的酯酶同工酶分析基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，（）：李紅，肖千明，張敏遼寧省黑木耳主栽品種的酯酶同工酶分析湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，（）：邊銀丙，羅信昌，周啟木耳栽培菌株酯酶同工酶的酶譜多樣性研究菌物系統(tǒng)，（）： ， ， ， （ ， ， ）： （） ， ， ， ： ； ； ； 第期北方園藝