劉 閏 周 暄 邢 帥 等 百日菊白粉菊菌的分子檢測與鑒定 J 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020 48 6 98 103 doi 10 15889 j issn 1002 1302 2020 06 020 百日菊白粉菌的分子檢測與鑒定 劉 閏 周 暄 邢 帥 楊旭欣 王占斌 東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 黑龍江哈爾濱 150040 摘要 對百日上的白粉菌進(jìn)行分子生物學(xué)分析 采用試劑盒法提取病原菌總基因組 DNA PCR 擴(kuò)增其 rDNA 內(nèi)轉(zhuǎn) 錄間隔區(qū) internal transcribed spacer 簡稱 ITS 的保守序列并測序 并通過 Clustal 與 MEAG 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹推演 系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系 在分子水平鑒定該菌種并比較與其他白粉菌菌種的親緣關(guān)系 結(jié)果表明 本研究測序的百日菊白粉菌 BC180623 的 ITS 序列與發(fā)生在土耳其菊芋上的 Erysiphe cichoracearum KF453969 1 相似度達(dá)到 99 與其具有比較 近的親緣關(guān)系 以百日菊白粉菌為研究對象 在分子水平鑒定該菌種并分析其進(jìn)化親緣關(guān)系為本試驗(yàn)的創(chuàng)新之處 關(guān)鍵詞 百日菊 白粉菌 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) 序列分析 中圖分類號 S435 672 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1002 1302 2020 06 0098 06 收稿日期 2019 01 30 基金項(xiàng) 目 東北林業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃 編 號 201710225294 作者簡介 劉 閏 1998 女 內(nèi)蒙古赤峰人 碩士研究生 主要從 事植物病理學(xué)研究 E mail 1293365687 qq com 通信作者 王占斌 博士 副教授 主要從事分子植物病理學(xué)研究 E mail wangzbchina 163 com 百日菊 Zinnia elegans Jacq 別稱百日草 為中 藥材 以全草入藥 百日菊也是一年生草花主栽品 種之一 其色彩豐富 花大 艷麗 花期長達(dá)百日 故 得百日菊之美名 白粉病是百日菊常見的最重要 病害之一 在生長區(qū)幾乎每年都普遍發(fā)生 1 3 百 日菊被白粉菌侵染后 最初葉片出現(xiàn)白色粉狀斑 點(diǎn) 后病斑擴(kuò)大或相連成片 發(fā)病后期葉面布滿白 色粉層 葉片變褐 嚴(yán)重影響觀賞價(jià)值 甚至導(dǎo)致植 株成片死亡 發(fā)病后期在發(fā)病部位形成的小黑點(diǎn) 即為病菌的閉囊殼 據(jù)以前的研究報(bào)道有 2 個(gè)屬的 白粉菌引起百日菊的白粉病 分別是白粉菌屬 Erysiphe 和單絲殼屬 Sphaerotheca 屬于子囊菌 門 Ascomycota 白粉菌目 Erysiphales 白粉菌科 Erysiphaceae 4 7 白粉菌傳統(tǒng)的鑒定以其形態(tài)學(xué)為主要特征 如 有性世代閉囊殼內(nèi)子囊的個(gè)數(shù)及子囊孢子的數(shù)目 閉囊殼外附屬絲的特征等 但傳統(tǒng)的分類特征有諸 多不足之處 8 11 近年來 分子生物學(xué)在植物病害 鑒定上的應(yīng)用越來越廣泛 特別是植物病原菌在 rDNA 的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) internal transcribed spacer 簡稱 ITS 既具有保守性 又在科 屬 種水平上均有 特異性序列的特點(diǎn) 通過特異性引物對 ITS 區(qū)段進(jìn) 行 PCR 擴(kuò)增 可用于快速鑒定 檢測植物病原菌以 及病害的診斷等 12 13 目前國內(nèi)關(guān)于百日菊白粉 病病原菌分子分類系統(tǒng)的研究未見報(bào)道 通過提取 百日菊白粉菌總基因組 DNA 利用分子生物學(xué)技術(shù) 對其分類特征及進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行研究 可為該花卉白 粉病的準(zhǔn)確調(diào)查提供有效和實(shí)用的手段 1 材料與方法 1 1 試驗(yàn)材料 白粉菌樣本于 2017 年 8 月 12 日采自黑龍江省 哈爾濱市東北林業(yè)大學(xué)城市實(shí)驗(yàn)林場 樣品編號為 BC180623 寄主植物為百日菊 提取白粉菌基因組 DNA 的試劑盒購自盛澤生物試劑有限公司 目錄 號 DP321 1 2 試驗(yàn)方法 1 2 1 樣品白粉菌的收集 刀片輕輕刮下葉片表 面的菌絲與閉囊殼混合物 放入 2 mL 離心管中 置 于 4 冰箱中保存 1 2 2 基因組 DNA 的提取 采用試劑盒法提取百 日菊白粉菌基因組 DNA 1 取適量白粉菌菌絲放 入研缽中 加入液氮充分研磨 2 加入 400 L 緩 沖液 FP1 和 6 LRNaseA 10 mg mL 渦旋振蕩 1 min 室溫放置 10 min 3 加入 130 L 緩沖液 FP2 充分混勻 渦旋振蕩 1 min 12 000 r min 離心 5 min 將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中 重復(fù)這一步 驟 4 向上清液中加入 0 7 倍體積的異丙醇 充分 混勻 此時(shí)出現(xiàn)絮狀基因組 DNA 離心 2 min 棄上 89 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020 年第 48 卷第 6 期 清 保留沉淀 5 加入 700 L 70 乙醇 渦旋振蕩 5 s 12 000 r min 離心 2 min 棄上清 重復(fù)這一步 驟 6 開蓋倒置 室溫晾干 10 min 徹底晾干殘余 的乙醇 7 加入適量洗脫緩沖液 TE 65 水浴 10 60 min 溶解 DNA 期間顛倒混勻數(shù)次助溶 最 終得到 DNA 溶液 用瓊脂糖凝膠電泳方法檢測得 到的 DNA 溶液 1 2 3 ITS 序列 PCR 擴(kuò)增 PCR 反應(yīng)的引物采用 通用引物 ITS1 ITS4 1 13 PCR 反應(yīng)所用的試劑是 PCR Mix 25 L 的反應(yīng)體系如下 模板 DNA 1 L PCR Mix 12 L ddH 2 O 10 L P1 和 P2 分別為 1 L PCR 擴(kuò)增條件 94 預(yù)變性 2 min 94 變 性 30 s 60 退火 30 s 72 延伸 2 min 30 次循環(huán) 72 最終延伸 10 min PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 0 8 瓊脂 糖凝膠電泳檢測 EB 染色觀察 檢測合格樣品進(jìn)行 序列測定與分析 1 2 5 序列分析 將所得 DNA 序列輸入 GenBank 進(jìn)行 BLAST 比對檢索 從 NCBI 數(shù)據(jù)庫中調(diào)取 22 種 白粉菌 ITS 保守序列 采用 Clustalx1 83 將測序白粉 菌 BC180623 結(jié)果與不同白粉菌的 ITS 序列構(gòu)建 系統(tǒng)發(fā)育樹 推演系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系 2 結(jié)果與分析 2 1 基因組 DNA 提取與 PCR 擴(kuò)增的結(jié)果 ITS 通用引物擴(kuò)增獲得的目的片段用膠回收試 劑盒回收并純化 對所得結(jié)果進(jìn)行電泳檢測 圖 1 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在回收后送生工生物工程 上海 股 份有限公司測序 測序獲得長度為 603 bp 的堿基序 列 結(jié)果如下 AGGACGTAGCTTGTGCTGCGTCGTG CATCGACCTCTCCACCCGTGTTGACTTTATCACTT GTTGCTTTGGCGGACCGGGCCGCGCACACGTCTGT GTGTGTTGGTCCGCTGGCTACGGCTGGAGCGCGT CTGCCAGAGACTTATAAACAACCTAACTCAAGTT TTACCTGCAGTCTAAGACAAGATTTATTAAGAAT TGATAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTG GCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGT AATGTGAATTGCAGAATTTAGTGAATCATCGAAT CTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGCATTCCGAG GGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATAACACCCCCCT CAAGTCACCGTTTGTGTGACTTCGGTGTTGGGGCT CGCCCACCTGGGTGGCCCTTAAAGACAGTGGCGG TACCGGCGTGAGCTCTACGCGTAGTAATCTGTATC TCGCGACAGAGCGCCGACGGTGGCTGGCCAAAAG CTCCTCCTTTGTAGATGTTTATCTACATCCAAGGT TGACCTCGAATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACT TAAGCATATCAATAGCCGGGAGGAAAA 2 3 百日菊白粉菌 ITS 序列進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果與 分析 獲得的序列用 NCBI 的 BLAST 進(jìn)行序列搜索 從 GenBank 中選取部分植物白粉菌 ITS 序列與本試 驗(yàn)測序結(jié)果進(jìn)行比較分析 表 1 對表 1 白粉菌的 ITS 序列對比分析結(jié)果見圖 2 由圖 2 可知 樣品百日菌白粉菌 BC180623 的 ITS 序列與 KF453969 1 的 ITS 序列最為接近 相似 度達(dá)到 99 兩者序列差異性主要體現(xiàn)在第 2 4 19 560 581 585 位堿基上 說明樣品百日菊白粉 菌與 KF453969 1 具有較近的親緣關(guān)系 此外 23 種白粉菌 ITS 序列 219 374 bp 之間保留著較高的 一致性 因此 這些區(qū)段有可能起到了保障白粉菌 性狀穩(wěn)定遺傳的功能 對 23 種白粉菌用 MEGA 5 05 軟件分析處理 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 圖 3 結(jié)果表明 23 種白粉菌的 ITS 序列形成 3 個(gè)比較大的分支 本研究測序的百 日菊白粉菌 BC180623 的 ITS 序列與發(fā)生在土耳其 菊芋上的白粉菌 KF453969 1 英國大波斯菊上的 白粉菌 KY660959 1 日本蓼屬植物上的白粉菌 LC331790 1 的 ITS 距離最近 這說明本研究的白 粉菌菌種與它們具有比較近的親緣關(guān)系 從分子水 平證明了發(fā)生在本地百日菊上的白粉病是 Erysiphe cichoracearum 所引起的 3 討論 傳統(tǒng)對于白粉菌的分類方法過多地依據(jù)寄主 種類 危害癥狀與顯微鏡觀察對菌物不同的形態(tài)特 征進(jìn)行比較和分類 通過對大量標(biāo)本測量與數(shù)據(jù)的 99 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020 年第 48 卷第 6 期 表 1 用于同源性比較分析的白粉菌 序號 白粉菌種類 登錄號 寄主植物 備注 1 Erysiphe sp Synonyms Golovinomyces sp LC331790 1 蓼屬植物 日本 2 Erysiphe adunca KY660862 1 園林植物 英國 3 Erysiphe cichoracearum Synonyms Golovinomyces cichoracearum KY660959 1 大波斯菊 英國 4 Erysiphe cruciferarum KC878683 1 大白菜 中國 5 Erysiphe cruciferarum EU140958 1 油菜 意大利 6 Erysiphe pisi FJ378868 1 豌豆 美國 7 Erysiphe heraclei KF680162 1 歐芹 韓國 8 Erysiphe Pseudoidium sp AB522714 1 羅勒 印度 9 Erysiphe betae DQ164440 1 甜菜 英國 10 Erysiphe heraclei JN603995 1 蒔蘿 韓國 11 Erysiphe heraclei JX499184 1 皺葉酸模 南韓 12 Erysiphe heraclei KF111807 1 山蘿卜 韓國 13 Erysiphe pisi FJ378871 1 豌豆 美國 14 Erysiphe sp HQ012432 1 大葉楊 中國 15 Erysiphe diffusa AY739112 2 大豆 巴西 16 Erysiphe alphitoides EF672350 1 橡樹 法國 17 Erysiphe heraclei EU010381 1 長春藤 意大利 18 Erysiphe cichoracearum Synonyms Golovinomyces cichoracearum KF453969 1 菊芋 土耳其 19 Erysiphe cruciferarum KT957424 1 芥菜 中國 20 Erysiphe diffusa KM260363 1 紫藤 中國 21 Erysiphe sp KY290257 1 盒子草 韓國 22 Erysiphe sp MF577080 1 鱷梨 美國 23 Erysiphe sp BC180623 百日菊 中國 比對之后才能得出結(jié)論 這種方法不僅費(fèi)力費(fèi)時(shí) 經(jīng)常由于研究者的主觀因素導(dǎo)致片面甚至錯(cuò)誤的 結(jié)論 許多白粉菌由于種所處環(huán)境條影響 在附屬 絲等細(xì)微特征上也具有差別 因此導(dǎo)致鑒定效率 準(zhǔn)確率比較低 14 15 PCR 技術(shù)是診斷植物病害的有效方法 它比起 傳統(tǒng)檢測方法具有高靈敏性 快速 準(zhǔn)確 簡便等優(yōu) 點(diǎn) ITS 序列在不同真菌種內(nèi)保守性強(qiáng) 而種間存 在變異 根據(jù)這一特性用 ITS 研究真菌系統(tǒng)發(fā)育和 檢測已經(jīng)成為有效的成熟手段 16 19 郭徐鵬等通 過對白粉菌 ITS 區(qū) DNA 片段的提取擴(kuò)增和分析 對 陜西關(guān)中地區(qū)甘藍(lán)型油菜白粉病的病原菌進(jìn)行了 分子水平上的鑒定 20 文靜等通過對內(nèi)蒙古 4 種 白粉菌的 ITS 序列分析 構(gòu)建進(jìn)化發(fā)育樹 表明 ITS 序列可用于白粉菌屬內(nèi)和屬間的親緣關(guān)系和分類 分析 21 通過一對特異性引物 ITS ITS4 利用 PCR 擴(kuò)增 的方法 對發(fā)生在百日菊上的白粉菌 DNA 進(jìn)行擴(kuò)增 并測序 將所獲得的測序結(jié)果與已上傳的白粉菌菌 種進(jìn)行 BLAST 比對 從中篩選相似度接近或較高的 菌種數(shù)據(jù)建立系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖 發(fā)現(xiàn)引起該病害的 白粉菌屬于 Erysiphe 屬 研究結(jié)果為該病原菌的檢 測 分類與鑒定提供理論依據(jù) 對此類病害的監(jiān)測 具有重要意義 參考文獻(xiàn) 1 翟小杰 段顯德 何玉會 百日草白粉病病斑在葉片上的空間分 布型及抽樣研究技術(shù) J 中國植保導(dǎo)刊 2014 6 46 50 2 修立紅 百日草白粉病無性孢子生物學(xué)特性研究 J 農(nóng)業(yè)與技 術(shù) 2013 6 18 25 3 Braun U Taxonomic studies in the genus Erysiphe Generic delimitation and position in the system of the Erysiphaceae J Nova Hedwigia 1981 34 3 4 679 719 4 Braun U Takamatsu S Phylogeny of Erysiphe Microsphaera Uncinula Erysipheae and Cystotheca Podosphaera Sphaerotheca Cystotheceae inferred from rDNA ITS sequences some taxonomic consequences J Schlechtendalia 2000 4 1 33 5 Takamatsu S New taxonomic system and molecular phylogeny of the powdery mildew fungi J Plant Prot 2002 56 229 237 6 劉鐵志 內(nèi)蒙古白粉菌志 M 赤峰 內(nèi)蒙古科學(xué)技術(shù)出版社 2010 126 128 7 戴芳瀾 中國真菌總匯 M 北京 科學(xué)出版社 1979 137 139 001 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020 年第 48 卷第 6 期 101 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020 年第 48 卷第 6 期 201 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020 年第 48 卷第 6 期 8 劉淑艷 高 松 白粉菌屬級分類系統(tǒng)的討論 J 菌物學(xué)報(bào) 2006 25 1 152 159 9 Braun U The powdery mildews Erysiphales of Europe M Jena Germany Gustav Fischer Verlag 1995 1 337 10 Takamatsu S Limkaisang S Braun U Phylogenetic relationships and generic affinity of Uncinula septata inferred from nuclear rDNA sequences J Mycoscience 2005 46 1 9 16 11 陳鳳毛 真菌 ITS 區(qū)序列結(jié)構(gòu)及其應(yīng)用 J 林業(yè)科技開發(fā) 2007 21 2 5 7 12 Kiss L Takamatsu S Cunnington J H 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ribosomal DNA sequences J Canadian Journal of Botany 1999 77 1 150 168 20 郭徐鵬 李建昌 李永紅 等 陜西關(guān)中地區(qū)甘藍(lán)型油菜白粉病 的病原菌鑒定 J 中國農(nóng)學(xué)通報(bào) 2013 29 24 187 192 21 文 靜 劉鐵志 趙 冰 內(nèi)蒙古 4 種白粉菌的 ITS 序列分析 J 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014 42 12 50 52 301 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020 年第 48 卷第 6 期