除擬南芥外 在 水 稻 楊 樹 香蕉 等其 他植物中也有與 功能相關(guān)的研究 但在觀 賞植物中少有報道 百合是重要的鮮切花和園林 花卉 由于其花大艷麗 花香等特點而被廣泛地使 用 但關(guān)于百合乙?；缺碛^遺傳調(diào)控以及其 基因家族功能等相關(guān)的研究還未見報道 本試驗以切花百合的一個主要品種 索邦 為研究材料 克隆 到 基 因 全 長 編 碼 序 列 分 析 的蛋白序列和結(jié)構(gòu) 與其他植物的 系統(tǒng)進化關(guān)系 亞細(xì)胞定位以及在各個組織和不 同花發(fā)育階段的表達情況 為后續(xù)的去乙?；?飾以及在花發(fā)育中的功能研究奠定基礎(chǔ) 材料與方法 試驗材料 以 年 月底在北京市懷柔基地種植的 東方百合 索邦 為試驗材料 取莖生根 嫩莖 上 部葉 下部葉 花被片 花藥 花絲 柱頭 花柱 子 房 種組織用于半定量表達分析 取 個不同花發(fā)育階段的雌蕊 雄蕊 內(nèi) 花被 外花被用于熒光定量表達分析 圖 以 上所有 材 料 用 液 氮 速 凍 法 取 材 后 立 即 放 于 冰箱 備用 花部組織的取材部位 不同發(fā)育階段花蕾的大小 圖 不同花發(fā)育階段花蕾與取材部位 試驗方法 總 的提取與 的 合 成 總 提取按照艾德萊 植物 快速提取試劑盒的方法標(biāo)準(zhǔn)操作 利用 分光光度計測定 的濃度 且保證 核甘酸的吸收峰 與 蛋白質(zhì) 的吸收峰 的比值為 采用 試劑盒 對 上述操作得到的 進行反轉(zhuǎn)合成 分 別用 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 檢 測 后 將 置 于 冰箱保存 置于 冰箱保存 備用 以 索邦 不同組織材料的總 反轉(zhuǎn)所得的 為模板 根據(jù)預(yù)期序列 設(shè)計半定量引物 和 表 進行 擴增 內(nèi)參基因選擇 正 反向引物分別為 和 表 總反應(yīng)體系 其中 引物各 模板根據(jù)內(nèi)參調(diào)整后的量添加 一 般 為 補足至 反應(yīng)程序為 個 循環(huán) 保存 表 試驗中所用引物序列 引物名稱 引物序列 基因編碼序列的克隆 根據(jù)半定量的表 達情況 以 索邦 花絲的 為模板 根據(jù)轉(zhuǎn) 錄組數(shù)據(jù)得到的預(yù)期 序列 設(shè)計克隆引物 和 表 擴增編碼區(qū)序列 總反應(yīng) 體系為 酶為高保真酶 東洋坊生物 公司 其中 西 北 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報 卷 引物 和 各 模板 反應(yīng) 程序為 預(yù) 變 性 變 性 個循環(huán) 最后 保存 擴增產(chǎn)物用 瓊脂糖凝膠 電泳檢測 拍照后切膠回收預(yù)期大小條帶 連接至 平末端克隆載體 艾德萊公司 轉(zhuǎn)化 感受態(tài)細(xì)胞 挑選菌落進行 檢測后送 至睿博興科測序公司測序 結(jié)果采用 在線網(wǎng)站 比對拼接 得到正確編 碼序列 保存菌液 生物信息學(xué)分析 利用 在線設(shè)計特異性引物 在 和 上下載其他物種的 基因的 序列 和氨基酸序列 利用 對所得其他物種 編碼序列與克隆所得 索邦 編碼序列比對 翻譯 后 構(gòu) 建 系 統(tǒng) 進 化 樹 在線網(wǎng)站修飾 進化樹 利用 翻 譯 得 到 可 能 的 氨 基 酸 序 列 分析蛋白的理化性質(zhì) 利用 預(yù) 測 蛋 白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu) 利用 和 進行 亞細(xì)胞定位預(yù)測 利用 中的保 守結(jié) 構(gòu) 域 數(shù) 據(jù) 庫 和 進行蛋白保守結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的比對 分析 繪制蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測圖 亞細(xì)胞定位瞬時表達載體構(gòu)建 將保存 的克隆菌液大搖后提取 重組 質(zhì)粒 以此為模板進行亞克隆的 擴增 根據(jù) 酶切位點設(shè)計亞克隆引物 表 總反應(yīng) 體系為 酶為高保真酶 其中 引 物 和 各 模板 反應(yīng)程序為 預(yù)變性 變性 個循環(huán) 最后 保存 擴增產(chǎn)物用 瓊脂糖凝膠電泳檢測 切膠回收預(yù)期大小 條帶 連 接 至 表 達 載 體 轉(zhuǎn)化 感受態(tài)細(xì)胞 挑選菌落進行 檢測后送至睿博興科測序公司測序 結(jié)果采用 在 線 網(wǎng) 站 比對拼接 得到正確序列 提取重組質(zhì)粒 將表達載體 通過液氮轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入 農(nóng)桿菌 檢測后挑選陽性菌落擴 大培養(yǎng) 重懸后注射侵染煙草葉背面 暗 培 養(yǎng) 采用激光共聚焦顯微鏡觀測定位結(jié)果 以 索邦 不同花發(fā)育階段 的花部組織雌蕊 雄蕊 內(nèi) 花被 外花被反轉(zhuǎn)得到的 為模板 按照實 時熒光定量的引物要求設(shè)計目的基因引物 和 表 內(nèi)參基因選擇 正反向引物為 和 表 進行實時熒光定量 反 應(yīng) 根據(jù) 說明書 配制 反應(yīng)液 體系為 稀釋 后的模板 和 混合稀釋 后 酶 使 用 程序進行擴增反應(yīng) 每份 樣品重復(fù) 次 反應(yīng)程序為 預(yù)變性 變性 退火 延伸 個循環(huán) 隨 后以 每 升 溫 的 速 度 從 升 至 得到擴增產(chǎn)物的熔解曲線 采用 和 軟件進行數(shù)據(jù)處理 結(jié)果與分析 索邦 組蛋白去乙酰化酶基因 編碼 序列的克隆和分析 以 索邦 花絲的 為模板 通過 擴增 得到清晰的擴增片段條帶 圖 大小與預(yù) 期相符 經(jīng)純化回收 連接轉(zhuǎn)化和測序 成功得到 索邦 基因的編碼區(qū)序列長度為 以 此 序 列 進 行 檢 索 發(fā) 現(xiàn) 與 海 棗 油棕 小果野焦 天門冬 鳳梨 等 單子 葉 植 物 的 具 有 較 高 的 的 相 似 性 與 相似性為 確定該 基因為東方百合 索邦 基因 并命名為 期 蒙 娟等 東方百合 索邦 組蛋白去乙?；富?的克隆與表達分析 在擬南芥中 基因家族成員分為 個亞家族 其中最大的為 亞家 族 挑選擬南芥所有 亞家族成員和部 擴增條帶 圖 基因編碼序列的 擴增 分植物的 基因 包括單子葉和雙子葉 與 進行同源比對 構(gòu)建進化樹 圖 結(jié)果表明 所有植物的 基因單獨聚為一支 可信度 很高 擬南芥 亞 家族其他成員各自聚為一支 說明 分支在 進化過程中較為保守 其成員的出現(xiàn)可能發(fā)生在 這些植物物種形成之前 在植物中 基因 的同源性很高 分為單子葉和雙子葉兩大分支 這 與植物的生物學(xué)分類一致 在雙子葉分支 中 茄 科與菊科聚為一支 擬南芥與楊柳科 薔薇科 葡 萄科以及亞麻科聚為一支 在單子葉植物分支 中 基因的也具有較高的保守性 其中禾 本科與鳳梨科聚為一支 與芭蕉科 和棕櫚科聚為一支 且與小果野焦 的同源性最高 其次是海棗 和油棕 與其他單子 葉植物水稻 玉米等同源關(guān)系較遠(yuǎn) 東方百合 索邦 鳳梨 天門冬 海 棗 油棕 小果野焦 水稻 二穗短柄草 玉米 擬南芥 番茄 向日葵 毛果楊 亞麻 桃 葡萄 圖 不同植物 基因的系統(tǒng)進化樹 西 北 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報 卷 氨基酸結(jié)構(gòu)分析 分析結(jié)果顯示 編碼的氨基酸 序列長度為 分子相對質(zhì)量為 等電點 為 正電荷殘基數(shù) 負(fù)電荷殘 基數(shù) 不穩(wěn)定系數(shù)為 表明該蛋白 質(zhì)穩(wěn)定 總平均疏水性 該蛋白為親水蛋 白 脂肪系數(shù) 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果 顯示 圖 在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中 包含大量的螺旋 折疊和無規(guī)則卷曲 其中螺旋和折疊結(jié)構(gòu)主要集 中在保守結(jié)構(gòu)域中 經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn) 螺旋 占 股 占 無規(guī)則卷曲 最多 占 圖 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 對其保守結(jié)構(gòu)域進行分析 圖 發(fā)現(xiàn)在 的 端包含一個組蛋白去乙?；?結(jié)構(gòu)域 該結(jié)構(gòu)域 位于 屬于精氨酸類 組蛋白類水解酶 超家族 中 的 組 蛋 白 去 乙 酰 化 酶 家 族 占氨基酸序列的大部分 是主要發(fā) 揮去乙?；δ艿膮^(qū)域 這與毛果楊 番茄和菠蘿 的研究結(jié)果一致 與其他植物比對發(fā)現(xiàn)該結(jié) 構(gòu)域保守性很高 均存在一些關(guān)鍵的活躍位點 包 括金屬 鋅 鐵 結(jié)合位點 親脂 管和足口袋 在 蛋白質(zhì)賴氨酸的乙酰化 蛋白活性等功能中可能 發(fā)揮著重要的作用 圖 圖 蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測圖 蛋白亞細(xì)胞定位分析 亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示 該蛋白最有可能定位在細(xì)胞核 中 其次是細(xì)胞 質(zhì) 預(yù)測顯示 位 于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì) 但未找到明確的核定位位點 為驗證 蛋白的定位情況 構(gòu)建 了 表達載體 農(nóng)桿菌介 導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草葉片表皮細(xì)胞 觀察 瞬時表達情 況 圖 結(jié)果顯示 在細(xì)胞質(zhì)和細(xì) 胞核中均有表達 可能在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中均發(fā) 揮作用 結(jié)果與預(yù)測結(jié)果較為一致 在不同組織中的表達分析 半 定 量 表 達 的 試 驗 結(jié) 果 顯 示 圖 在 索邦 不同組織中均有表達 并 未在 某 一 個 或 某 幾 個 組 織 中 特 異 性 表 達 在莖生根 嫩莖 下部葉 花被片 花 絲 柱頭 花柱和子房中表達量較高 在上部葉和 花藥中表達稍低 說明其可能廣泛地參與東方百 合各階段的生長發(fā)育 這與番茄 的組織 表達模式相似 期 蒙 娟等 東方百合 索邦 組蛋白去乙?；富?的克隆與表達分析 東方百合 小果野焦 海棗 油棕 天門冬 水稻 玉米 擬南芥 番 茄 毛果楊 桃 方框為主要的活躍位點 其中綠色為金屬 鋅 結(jié) 合位點 圖 不同植物 氨基酸序列比對結(jié)果 西 北 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報 卷 圖 蛋白的亞細(xì)胞定位 圖 在不同組織中的表達 在不同花發(fā)育階段中的表達分 析 半定量結(jié)果顯示 在除花藥外 的花被片 花絲 花柱 柱頭等花部組織中表達量 均較高 為了進一步探究 在花發(fā)育 階段的表達情況 利用 和 花 蕾中的雌雄蕊以及內(nèi)外花被片的 進行熒 光定量表達分析 結(jié)果顯示 在各個 階段的花部組織中都有不同程度的表達 圖 在雌蕊中 早期 中表達量最高 明顯高于 和 在 時明顯下降 中間 過程表達量無明顯的變化 說明 可 能參與了雌蕊早期的發(fā)育 在雄蕊中 呈現(xiàn)與雌蕊 相反的趨勢 花發(fā)育早期表達量較低 在 中表達量最低 后逐漸上升 中表達量最 高 說明 可能參與雄蕊后期的發(fā) 育 在花被片中的表達趨勢較為一致 先上升后降 低 呈現(xiàn)一定的波動性 在內(nèi)花被中 各個發(fā)育階 段的表達量差異不十分明顯 在花蕾 時表 達量最高 在外花被中 的表達量下 降 后 又 升 高 在 花 蕾 時 達 到 最 高 到 又下降 呈現(xiàn)一個動態(tài)變化趨勢 討 論 的編碼區(qū)序列 與擬 南芥等植物的 的序列長度相當(dāng) 已有的 氨基酸序列比對結(jié)果 顯示 與其他植物同源蛋白序列具有很高 的保守性 其中與小果野焦同源性最高 從進化關(guān) 系來看 百合與小果野焦同為單子葉植物 親緣關(guān) 系相對較近 基因的功能更為接近 從比對結(jié)果發(fā) 現(xiàn) 自身在保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)外也有不 同于其他植物的特異性位點 這可能導(dǎo)致百合 功能的變化 在發(fā)揮去乙?；δ艿谋?守結(jié)構(gòu)域中 存在幾個與人類 相同的活 躍結(jié)合位點 這些位點對其正常功能發(fā)揮有重要 期 蒙 娟等 東方百合 索邦 組蛋白去乙?；富?的克隆與表達分析 表示在 水平下的差異顯著性 圖 在不同花發(fā)育階段的表達 作用 進化關(guān)系顯示 與單子葉植物 的同源性更高 擬南芥 亞家族 成員系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn) 各成員在進化過程中 十分保守 在這些高等被子植物物種形成之前 可 能已經(jīng)進化完成 并具有一定同源性 比對 個 亞家族的蛋白結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn) 亞家族與 和 亞家族在 蛋 白 結(jié) 構(gòu) 域 上 差 異 較 大 亞家族不含有組蛋白去乙?；附Y(jié)構(gòu) 域 存在甘氨酸 天冬氨酸和谷氨酸豐富區(qū) 保守區(qū)以及 在功能機制上可能 存在差異 從蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定 位 上 來 看 定位于細(xì)胞核 非核仁 但 毛 果楊 定 位 于 細(xì) 胞 質(zhì) 可 能 在 細(xì) 胞 質(zhì) 中 發(fā) 揮 作 用 研究表明 亞家族主要定位于細(xì) 胞核中 部分成員位于細(xì)胞質(zhì) 也有一些成員穿梭 于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間 這與它的功能存在一定 聯(lián)系 亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示 定位 于細(xì)胞核中的可能性最大 其次位于細(xì)胞質(zhì)中 試 驗結(jié)果顯示 定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞 核 可能在細(xì)胞質(zhì) 細(xì)胞核中均發(fā)揮功能 說明 在不同植物中的定位存在一定差異 在百合組織中廣泛表達 這說 明它與擬南芥 番茄等其他已研究的植物一樣 廣 泛地參與百合生長發(fā)育的各個階段 的同源基 因 在花部組織 花發(fā)育過程中表達量尤為高 證 明其與花發(fā)育過程密切相關(guān) 開花植物花器 官發(fā)育的調(diào)控主要依靠 模型相關(guān)基因 等 大部分屬于 轉(zhuǎn)錄因子家族 它們的異常表達直接影響花 器官 的 正 常 發(fā) 育 與 花 發(fā) 育 相 關(guān) 基 因 直接互作影響開花 轉(zhuǎn)錄抑制因子 其靶基因涵蓋植物的各個發(fā)育階段 通過與 家族成員 等互作 實現(xiàn)對花發(fā)育相關(guān)基因的抑制 還參 與了 類基因 與 類基因 間的相互抑 制作用 保證花被片與生殖器官的正常 擬南芥 系列突變體具有花發(fā)育異常表型 花瓣融 合 數(shù)量減少 雄蕊變短 雌雄蕊育性降低等 在百合中 在雌雄蕊和花被片中都 表達 值得注意的是 在雌蕊的早期 西 北 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報 卷 發(fā)育中 表達量明顯高于其他階段 在雄蕊 后期高于其他階段 其很可能參與了雌蕊的分化 形成和早期發(fā)育 雄蕊后期的發(fā)育 進一步推測 在雌雄蕊的正常發(fā)育 維持花被片 數(shù)量中發(fā)揮一定功能 不僅如此 功能 的缺失 導(dǎo)致其他發(fā)育階段的異常 這些結(jié)果表明 是一種在植物中通過 序列獨立或 表觀遺傳機制控制發(fā)育過程中基因表達的全方位 調(diào)節(jié)劑 因此在百合中 基因如何影響 花發(fā)育 突變是否會導(dǎo)致花瓣減少 雄蕊花絲變短 等發(fā)育異常 需對其功能做進一步研究 通過過表 達或恢復(fù)突變體表型來確認(rèn)是否與 具 有相似的功能 然而番茄中研究表明 在花中表達較低 在果實中高表達 與果實成熟密 切相關(guān) 在香蕉中 與乙烯信號通路 轉(zhuǎn)錄因子 直接互作影響香蕉果實的成 熟 在擬南芥中 與 互 作參 與 種 子 發(fā) 育 而 非 因 此 百 合 中 是否與這些蛋白互作或存在新的蛋白 值 得進一步研究 也說明 在不同植物中可能 與不同蛋白互作 在果實和種子成熟中發(fā)揮重要 作用 筆者從序列比對 系統(tǒng)進化 亞細(xì)胞定位 組 織表達模式和不同花發(fā)育階段花部組織表達格局 初步推測 可能與擬南芥 類似 在百合的成花與花發(fā)育中具有重要作用 但是其是否可以與 等蛋 白質(zhì)形成復(fù)合物 共同作用于其他基因 是否與 具有功能冗余 通過去乙?；揎梾⑴c調(diào) 控百合種球發(fā)育 成花轉(zhuǎn)變和花的發(fā)育 還須進一 步的研究 此外對于 在種子成熟 脅迫響應(yīng)以及防御反應(yīng)中是否與 發(fā)揮 相似的作用 還有待探究 參考文獻 李 濤 蘇慧慧 黎振興 等 植物組蛋白去乙酰化酶生物學(xué) 功能研究進展 分子植物育種 期 蒙 娟等 東方百合 索邦 組蛋白去乙?；富?的克隆與表達分析 張 星 楊 捷 彭夢迪 等 百合黃烷酮 羥化酶基因 的 克 隆 與 表 達 西 北 植 物 學(xué) 報 賈星月 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及純 合轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的篩選 太原 山 西 師 范 大 學(xué) 劉 超 毛果楊 基因的克隆及功能分析 哈爾 濱 東北林業(yè)大學(xué) 郭俊娥 番茄組蛋白去乙?；讣易寤?和 的功能研究 重慶 重慶大學(xué) 李 麗 羅 軒 徐 立 等 粉菠蘿組蛋白去乙?；富?因 的克隆及在乙烯處理下的表達分析 植物生 理學(xué)報 林 瑩 韓玉輝 熊思嘉 等 森林草莓組蛋白去乙酰化酶 基因的鑒定和分析 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 西 北 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報 卷 責(zé)任編輯 潘學(xué)燕 期 蒙 娟等 東方百合 索邦 組蛋白去乙?；富?的克隆與表達分析