黃瓜抗灰霉病育種研究進(jìn)展 戴卓男 苗 晗 李寶聚 石延霞 薄凱亮 董邵云 顧興芳 張圣平 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所 北京 100081 摘 要 黃瓜灰霉病由半知菌亞門葡萄孢屬灰葡萄孢菌引起 是為害黃瓜生產(chǎn)的重要病害之一 本文對黃瓜灰霉病的病原菌 發(fā)病規(guī)律 致病機(jī)理及黃瓜抗病機(jī)制 抗病育種等方面進(jìn)行了系統(tǒng)綜述 并對下一步工作進(jìn)行了展望 以期為黃瓜抗灰霉病 育種提供參考 關(guān)鍵詞 黃瓜 灰霉病 抗病育種 分子機(jī)制 綜述 致病力都具有廣泛的遺傳變異率 隨著分子生物學(xué) 技術(shù)的不斷發(fā)展成熟 人們利用分子標(biāo)記等研究技 術(shù)進(jìn)一步揭示了灰葡萄孢菌豐富的轉(zhuǎn)座子位點(diǎn) 根據(jù)分生孢子的特點(diǎn)以及是否產(chǎn)生菌核 可 將灰葡萄孢菌分為菌絲型 孢子型和菌核型 3類 張靜 2010 Martinez等 2003 將灰葡萄孢 菌分為菌絲型和菌核型 2類 菌絲型具有 M1 M2 M3 M4 4個(gè)亞型 菌核型具有S1 S2 S3 S4 4個(gè)亞型 Boty和 Flipper是灰霉病菌中 2 個(gè)轉(zhuǎn)座因子 根據(jù) Boty和 Flipper的有無 將灰葡 萄孢菌分為 4類 Boty containing 僅含 Boty Boty de cient 不含Boty transposa 含F(xiàn)lipper 和 Boty vacuma 不含F(xiàn)lipper和 Boty Diolez et al 1995 Giraud et al 1997 Mu oz等 2002 選用 12對 RAPD引物在葡萄和番茄等多個(gè)寄主的 灰葡萄孢菌中擴(kuò)增出 106個(gè)多態(tài)性條帶 這些菌 株均有不同的單倍型 具有豐富的遺傳多樣性 Alfonso等 2000 利用 RAPD對不同時(shí)間 地點(diǎn) 采集的灰葡萄孢菌菌株進(jìn)行分析 結(jié)果表明亞群內(nèi) 具有非常高的遺傳多樣性 而亞群間的遺傳多樣性 較低 雖然灰葡萄孢菌不具有寄主專一性 但不同 菌株的致病性存在明顯差異 李喜玲 等 2008 不同菌株對相同寄主的致病力也不同 范詠梅 等 2010 1 3 發(fā)病條件及癥狀 灰霉病菌主要以菌核 菌絲體或分生孢子越 冬 翌年在適宜條件下借助空氣 雨水 農(nóng)事操作 等侵染植物 灰霉病菌喜低溫高濕 溫度為 18 23 戴卓男 碩士研究生 專業(yè)方向 黃瓜遺傳育種 E mail dzhuonan 通訊作者 Corresponding authors 張圣平 研究員 專業(yè)方向 黃 瓜遺傳育種 E mail zhangshengping 顧興芳 研究員 專業(yè)方向 黃瓜遺傳育種 E mail guxingfang 收稿日期 2020 03 05 接受日期 2020 05 09 基金項(xiàng)目 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程項(xiàng)目 CAAS ASTIP 2017 IVF 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目 CARS 25 黃瓜是我國重要的蔬菜作物 在設(shè)施生產(chǎn)中 占有舉足輕重的地位 2017年栽培面積為 123 52 萬 hm 2 產(chǎn)量達(dá)到6 482 46萬 t 張圣平和顧興 芳 2020 近年來 灰霉病已成為制約我國保 護(hù)地黃瓜生產(chǎn)的重要病害 一般可導(dǎo)致蔬菜減產(chǎn) 20 30 鄭果和杜蕙 2006 造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì) 損失 因此研究灰霉病病原菌及致病機(jī)理 探索病 原菌與寄主互作的分子機(jī)制 挖掘黃瓜抗病基因 對黃瓜抗病育種具有重要意義 1 黃瓜灰霉病病原菌概況 1 1 病原菌 黃瓜灰霉病是由灰葡萄孢菌 Botrytis cinrera 引起的 屬半知菌亞門葡萄孢屬 李寶聚 等 2003 病原菌菌絲體呈透明至褐色 有隔膜 分生孢子梗單生或叢生 頂端簇生分生孢子 分生 孢子圓形或卵圓形 大小為 7 5 12 5 m 黑色菌 核 圓形或長圓形 表面有小刺或瘤 張忠義 2006 1 2 遺傳多樣性 灰葡萄孢菌作為一個(gè)復(fù)合種 無論是表型還是 15 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 專論與綜述 2020 7 15 23 濕度達(dá)到 90 以上時(shí)最容易發(fā)病 張智 等 2005 灰霉病能在近百種植物中致病 植物的莖 葉 果實(shí)均可發(fā)病 孔維文 2016 植物受害時(shí) 葉片上前期表現(xiàn)為淺灰色水漬狀病斑 隨著病斑的 擴(kuò)展 葉片逐漸萎縮 變色 腐爛 幼莖上表現(xiàn)為 水漬狀病斑 引起幼莖腐爛 阻礙營養(yǎng)運(yùn)輸使發(fā) 病部位以上枯死 花瓣腐爛 果實(shí)軟腐 后期表 面產(chǎn)生灰色霉層 Shtienberg et al 1998 Kwon 2006 在黃瓜上 灰霉病嚴(yán)重時(shí) 表現(xiàn)為整個(gè)植 株的莖和果實(shí)腐爛 導(dǎo)致植株死亡 甚至絕收 杜 曉峰 等 2019 2 灰霉病菌致病機(jī)理 灰霉病菌屬于腐生型菌 在病原菌與寄主共 同演化過程中 灰霉病菌進(jìn)化出復(fù)雜的侵染系統(tǒng) 其侵染過程通?？煞譃榍秩爰闹鞅砥?殺死植物細(xì) 胞 引起組織腐爛和形成孢子等階段 van Kan 2006 多種基因協(xié)同調(diào)控侵染過程 2 1 侵入寄主表皮 分生孢子首先識別寄主表面的疏水基團(tuán)或糖 基 進(jìn)而在寄主表面產(chǎn)生菌絲體 Schumacher 2012 菌絲體依靠膜相關(guān)蛋白 BcPLS1穿透植物 表面 Gourgues et al 2004 2 2 殺死植物細(xì)胞 灰霉病菌在侵染植物表皮后 會破壞植物細(xì) 胞 植物細(xì)胞死亡后 侵入寄主組織中 Clark Lorbeer 1976 2 2 1 產(chǎn)生毒素 灰霉病菌在侵入植物表皮的過 程中 會產(chǎn)生有毒性的代謝物質(zhì)為害植物 其中 最主要的有毒物質(zhì)是高取代內(nèi)酯 botcinolide 和 倍半萜烯 botrydial 劉莎莎和陳小龍 2010 botcinolide雖然早在 1993年就被分離鑒定出來 Dulik et al 1993 但對其功能和應(yīng)用的研究卻 較少 僅 Cutler和 Jacyno 1995 將其作為一種天 然除草劑進(jìn)行了研究 而 botrydial能夠誘導(dǎo)植物黃 化和細(xì)胞裂解 更有利于病原菌穿透寄主表面和體 內(nèi)定殖 Dur n Patr n et al 2000 2 2 2 誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡 超敏反應(yīng) hypersensitivity reaction HR 是植物抵御病原菌 而引發(fā)的一種防御反應(yīng) H 2 O 2 在侵染部位大量積 累 誘導(dǎo)病原菌侵染部位的組織發(fā)生細(xì)胞程序性死 亡 從而切斷營養(yǎng)型病原菌的營養(yǎng)供給 然而灰霉 病菌屬死體型菌 不僅對 HR無效 還會利用植物 的 HR 甚至?xí)T導(dǎo)植物發(fā)生 HR 從而促進(jìn)病菌 生長 Govrin Levine 2000 灰霉病菌中超氧 化物歧化酶 BcSOD1可能在 HR中起重要作用 缺 乏 Bcsod1基因的灰霉病菌對寄主的毒性降低 Rolke et al 2004 2 2 3 分解寄主細(xì)胞 灰霉病菌可以分泌多種細(xì)胞 壁酶 穿透植物細(xì)胞壁 分解植物細(xì)胞 將植物 細(xì)胞分解后的物質(zhì)用于自身增殖 Boulard et al 2008 灰霉病菌分泌的草酸等物質(zhì)為細(xì)胞壁酶創(chuàng) 造了適宜的酸堿條件 景嵐和康振生 2003 研究表明 細(xì)胞壁中果膠含量較高的寄主植物 更易受灰霉病菌的侵染 病原菌可以分泌果膠酶 將多聚半乳糖醛酸分解為寡聚半乳糖醛酸和半乳糖 醛酸單體 Wanjiru et al 2002 灰霉病菌至少具 有 6個(gè)與果膠酶相關(guān)的內(nèi)源性多半乳糖醛酸酶基 因 對病原菌的侵染和分解寄主細(xì)胞有不同的調(diào)節(jié) 作用 其中 Bcpg1和 Bcpg2可編碼同工酶 Bcpg2 對前期侵染表皮細(xì)胞具有重要作用 van Kan 2006 半乳糖醛酸可誘導(dǎo) Bcpg4和 Bcpg6的表 達(dá) 低 pH值可誘導(dǎo) Bcpg3基因的表達(dá) Bcpg5的 誘發(fā)機(jī)制尚不明確 Wubben et al 2000 灰霉病 菌在侵染植物時(shí)還會分泌多種纖維素酶協(xié)助分解細(xì) 胞壁 其中外切型葡聚糖酶可以水解纖維素晶體結(jié) 構(gòu) 內(nèi)切型葡聚糖酶可以切開纖維素分子的 1 4 糖苷鍵 最后 葡聚糖苷酶將切開的纖維素分 子分解為葡萄糖 農(nóng)向 等 2005 木聚糖是植物 細(xì)胞壁半纖維素的主要成分 灰霉病菌分泌的木聚 糖水解酶系統(tǒng)由內(nèi)切木聚糖酶 外切木糖苷酶和 一些脫支鏈酶等多種酶組成 Urbanek Zalewska Sobczak 1984 2 3 形成孢子 不同外界條件下 灰霉病菌在侵染寄主過程中 會產(chǎn)生不同的生長發(fā)育和代謝反應(yīng) 寄主表面硬度 和疏水性會對灰霉病菌分生孢子的萌發(fā)產(chǎn)生影響 分生孢子在疏水表面更易萌發(fā) Doehlemann et al 2005 灰霉病菌感知外界環(huán)境依賴于 G蛋白介導(dǎo) 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo) G蛋白亞基 BCG3調(diào)控病菌的穿透 能力 誘導(dǎo)發(fā)芽和產(chǎn)生分生孢子 Gronover et al 2001 Yang等 2012 認(rèn)為灰霉病菌絲裂原激活 16 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 專論與綜述 蛋白激酶基因 BcOs4也與病原菌形成孢子有關(guān) 2 4 灰霉病菌致病過程的相關(guān)基因 研究灰霉病菌生長發(fā)育過程和致病機(jī)制 克隆 致病相關(guān)基因是防治灰霉病的有效方法 目前 許 多研究已經(jīng)報(bào)道了灰霉病菌在不同階段致病相關(guān)的 基因 2 4 1 與灰霉病菌發(fā)育有關(guān)的基因 灰霉病菌能夠 在寄主體內(nèi)正常生長與增殖是植株發(fā)病的基礎(chǔ) BcPls1誘導(dǎo)灰霉病菌附著胞分化 是病原菌穿透植 物表面的關(guān)鍵基因 BcPls1基因的突變體對植株無 致病性 Gourgues et al 2004 BcOs4是灰霉病 菌絲裂原激活蛋白激酶基因 缺失 BcOs4基因的 病原菌無法正常進(jìn)行營養(yǎng)生長和形成分生孢子 此 外 Western bolt分析表明 BcSak1位于 BcOs4下游 BcSak1非磷酸化的病原菌突變體不能侵染黃瓜葉 片 因此 BcOs4和 BcSak1均對灰霉病菌的侵染 產(chǎn)生影響 Yang et al 2012 自噬現(xiàn)象能夠確保 灰霉病菌正常的細(xì)胞分化和發(fā)展 自噬相關(guān)基因 BcAtg1 BcAtg3 BcAtg7和 BcAtg8是分生孢子萌 發(fā)和菌核形成所必需的 此外 BcAtg1與形成感染 結(jié)構(gòu)附著胞的能力有關(guān) BcAtg8對灰霉病菌的發(fā)病 和脂質(zhì)代謝起重要作用 Ren et al 2017 2018a 2018b BcSdr1基因?qū)颐共【z生長 菌核發(fā) 育和致病性有正向調(diào)控作用 對灰霉病菌分生孢子 的形成有負(fù)向調(diào)節(jié)作用 Zang et al 2018 2 4 2 灰霉病菌致病性相關(guān)基因 灰霉病菌致病性 相關(guān)的基因具有調(diào)節(jié)病原菌毒性 殺死并分解寄主 細(xì)胞 導(dǎo)致植物發(fā)病的作用 絲狀體基因 BcVea和 BcVelb對灰霉病菌產(chǎn)生 毒性具有重要作用 缺失 BcVea和 BcVelb的灰霉 病菌雖然增殖能力和黑色素生物合成增加 對氧化 應(yīng)激的敏感性提高 但不能正常侵入寄主組織 對 植株幾乎不會產(chǎn)生任何影響 Yang et al 2013 灰葡萄孢犬尿氨酸單氧酶基因 BcKmo對灰霉病菌 的生長發(fā)育有負(fù)調(diào)控作用 對其致病性有正調(diào)控作 用 Li等 2014 通過構(gòu)建 BcKmo基因表達(dá)載體 轉(zhuǎn)化的灰霉病菌突變體表現(xiàn)出生長緩慢 不產(chǎn)生分 生孢子和菌核 菌絲細(xì)小等特征 但在黃瓜真葉上 的致病性卻顯著提高 BMP1是灰霉病菌中控制絲 裂原活化蛋白 MAP 激酶的基因 它對灰霉病菌 侵染寄主具有促進(jìn)作用 Zheng et al 2000 幾丁 質(zhì)合成酶 類基因 BcChs3a可以調(diào)控病原菌的吸 附 感染和在寄主組織內(nèi)增殖能力 還可抑制植物 產(chǎn)生抗毒素 camalexin Souli et al 2006 Arbelet et al 2010 超氧化物歧化酶基因 BcSod1與毒力 因子 SOD的產(chǎn)生有關(guān) Patel et al 2008 絲狀體 基因 BcVel1缺失的突變體無法正常殺死和分解植物 組織 Schumacher et al 2012 菌核基因 BcSdr1 調(diào)控毒素和酸性物質(zhì)的產(chǎn)生 Zang et al 2018 小 G蛋白 Rab家族同源基因 BcSas1通過影響灰霉 病菌細(xì)胞外蛋白的生長 發(fā)育和分泌 從而影響毒 性 Zhang et al 2014 此外幾丁質(zhì)合成酶 類基 因 BcChs1 Souli et al 2003 內(nèi)源性半乳糖醛 酸酶基因 BcPg1 Have et al 1998 都是灰霉病菌 毒性的必需基因 3 黃瓜抗灰霉病分子機(jī)制 植物天然免疫系統(tǒng) PTI ETI 是植物應(yīng)對 外界病原菌侵染的自我保護(hù)措施 在與病原菌相 互作用進(jìn)化的過程中 病原菌相關(guān)分子模式激發(fā) 的免疫 PAMP DAMP triggered immunity PTI 和病原菌效應(yīng)因子激發(fā)的免疫 e ector triggered immunity ETI 被先后進(jìn)化出來 Chisholm et al 2006 在對灰霉病的研究中 PTI仍是植物 抗灰霉病的主要免疫反應(yīng) 植物通過細(xì)胞膜上的模 式識別受體 PRR 識別 PTI信號分子 激活一系 列信號途徑 最終誘發(fā)植物免疫反應(yīng) 陳俊達(dá) 2017 植物天然免疫的大量研究為黃瓜抗灰霉病 的研究奠定了良好的基礎(chǔ) 然而 目前對黃瓜灰霉 病的研究主要集中在防治方法方面 對灰霉病的抗 性機(jī)制和抗病基因等方面的研究還很少 3 1 PTI信號的產(chǎn)生 PTI的信號分子分為灰霉病菌細(xì)胞壁降解產(chǎn)物 PAMP 和植物細(xì)胞壁降解產(chǎn)物 DAMP 張 燕 等 2018 PAMP主要是植物分泌的幾丁質(zhì)酶 分解灰霉病菌細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)產(chǎn)生的分解產(chǎn)物 例 如芥菜幾丁質(zhì)酶 BjCHI1 Gao Zhao 2017 水 稻幾丁質(zhì)酶 RCH10 RCC2 Tabei et al 1998 de C ceres Gonz lez et al 2015 等都可將病原菌細(xì) 胞壁分解 引發(fā) PTI反應(yīng)提高植物抗病性 DAMP 主要是果膠酶分解植物細(xì)胞壁得到的產(chǎn)物 如灰霉 病菌在侵染過程中產(chǎn)生果膠酶 植物細(xì)胞壁被水解 17 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 專論與綜述 生成半乳糖酰亞胺 OGs Rasul et al 2012 從 而引發(fā) PTI反應(yīng) 3 2 PTI信號的識別 灰霉病菌侵染植物后產(chǎn)生的 PTI信號分子與 植物細(xì)胞膜上的 PRR結(jié)合 LYK5和 CERK1是 擬南芥中主要的模式識別受體 在接收 PTI信號 后 LYK5與 CERK1結(jié)合 將免疫信號向下游傳 遞 Cao et al 2014 CERK1是響應(yīng)真菌誘導(dǎo)物 甲殼素的信號傳遞所必需的輔助受體 CERK1磷 酸化可以增強(qiáng)甲殼素應(yīng)答反應(yīng)和真菌抗性 Gong et al 2019 細(xì)菌可以誘導(dǎo) CERK1磷酸化 從而 為植物抵御真菌做準(zhǔn)備 因此 植物通過細(xì)菌獲得 對灰霉病的抗性 依賴模式識別受體 CERK1 Gong et al 2019 3 3 PTI信號的傳導(dǎo) 灰霉病菌侵染植物引起的 PTI信號傳導(dǎo)途徑主 要有兩條 一是 MAPK級聯(lián)反應(yīng)接收 PTI信號 通過信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)抗病相關(guān)基因的表達(dá) MPK3 MPK4和 MPK6是擬南芥中 MAPK級聯(lián)反應(yīng)的主 要參與者 MPK3和 MPK6的磷酸化對 PTI反應(yīng)起 正調(diào)控作用 而 MPK4通過調(diào)控下游免疫基因的表 達(dá)調(diào)節(jié) PTI反應(yīng) Asai et al 2002 Nicaise et al 2009 二是通過受體激酶 BIK1將 PRR上的免疫 信號向下傳遞 Zhang et al 2010 當(dāng)植株受到 灰霉病菌侵染時(shí) 受體激酶 PEPR1和 PEPR2識別 Pep1蛋白激活并磷酸化 BIK1 激活 PTI信號的傳 導(dǎo) Liu et al 2013 3 4 PTI信號激發(fā)的免疫反應(yīng) PTI信號經(jīng) PRR傳導(dǎo)或被放大后可激發(fā)一系 列植物天然免疫反應(yīng) 如激活 MAPK WRKY33 是擬南芥中病原體誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子 可誘導(dǎo) MPK3 MPK6合成 camalexin camalexin被運(yùn)送到灰霉病 菌侵染部位 從而抑制灰霉病菌侵染 Mao et al 2011 活性氧 ROS 的爆發(fā) OGs可誘導(dǎo)擬南 芥產(chǎn)生一氧化氮 NO NO可以誘導(dǎo)植物 PTI反 應(yīng)產(chǎn)生 ROS 并參與調(diào)控 OG響應(yīng)基因 產(chǎn)生陰離 子過氧化物酶 PER4 和 1 3 葡聚糖酶等 來 抵御灰霉病菌的侵染 Zaninotto et al 2006 Aziz et al 2007 在蛋白水平上 茄科植物在受到灰 霉病菌侵染時(shí) 體內(nèi)一種含有 200個(gè)氨基酸的前體 蛋白 PS 被剪切形成 18 個(gè)氨基酸的片段 SYS 分泌到細(xì)胞外 與 PRR結(jié)合激活抗病基因的表 達(dá) 從而增強(qiáng)植物對灰霉病菌的抗病性 同時(shí) PS 的 mRNA能在植物體內(nèi)進(jìn)行長距離運(yùn)輸 因此可 以通過 PS的異位表達(dá)提高植株對灰霉病菌的抗性 Zhang et al 2018 3 5 植物激素調(diào)節(jié) 植物先天免疫還可精細(xì)調(diào)節(jié)植物激素水平 Robert Seilaniantz et al 2011 植物受到灰霉病 菌侵染時(shí) 體內(nèi)茉莉酸 JA 水楊酸 SA 脫 落酸 ABA 乙烯 ET 等激素水平顯著變化 從而誘發(fā)植物的免疫機(jī)制來抵御灰霉病菌侵染 茉莉酸 JA 是植物抗病和發(fā)育的重要物質(zhì) 植株受到病原菌侵染時(shí) JA累積 PRR將 PTI信 號分子與 JA結(jié)合 激活轉(zhuǎn)錄因子并促進(jìn)免疫基 因表達(dá) 從而產(chǎn)生次級代謝物進(jìn)行防御 Campos et al 2014 Caarls et al 2017 水楊酸 SA 通過共激活因子 NPR1信號通路調(diào)節(jié)植物免疫反 應(yīng) 也可通過 WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族直接激活植物 防御基因PDF1 2 Eulgem Somssich 2007 SA對 JA也起到抑制作用 作用部位位于 E3泛素 連接酶復(fù)合物 SCFCOI1 JAZ的下游 SA對轉(zhuǎn)錄 激活因子 ORA59起負(fù)向調(diào)節(jié)作用 靶向 JA反應(yīng) 啟動子中的 GCC box元件 從而抑制 JA信號 促 進(jìn)病害的發(fā)生 van der Does et al 2013 灰霉病 菌可利用胞外多糖 EPS 來抑制 SA與 JA的免疫 調(diào)控反應(yīng) El Oirdi et al 2011 脫落酸 ABA 在植物抵御灰霉病菌侵染過程中起著負(fù)調(diào)節(jié)作用 脫落酸含量較低的植株葉片表面疏水性和毛狀體 數(shù)量減少 表面滲透性增加 對灰霉病的抗性增 強(qiáng) 此外 較低含量的 ABA可以誘導(dǎo)植物表皮細(xì) 胞產(chǎn)生 H 2 O 2 從而增強(qiáng)細(xì)胞壁的防御反應(yīng) Curvers et al 2010 乙烯 ET 調(diào)節(jié)的免疫反應(yīng)由灰霉 病菌受體激酶 BIK1和肽段受體激酶 PEPRs調(diào)控 通過兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子 EIN3 EIL1來調(diào)控植物防御反應(yīng) Liu et al 2013 4 黃瓜抗灰霉病育種 抗病育種是解決灰霉病最根本的手段 利用簡 易可行 重復(fù)性好的抗性鑒定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抗病資 源的評價(jià)和篩選 并結(jié)合分子標(biāo)記輔助育種 從而 培育灰霉病抗性新品種 18 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 專論與綜述 4 1 灰霉病抗性鑒定 抗性鑒定技術(shù)是進(jìn)行抗病資源篩選 抗病品 種選育的基礎(chǔ) 人工接種鑒定是抗性鑒定過程中 常用的方法 黃瓜灰霉病人工接種鑒定通常分為活 體接種 李淑菊和馬德華 1997 和離體接種 Li et al 2014 活體接種按照病斑面積占整個(gè)葉片 面積的比例確定發(fā)病程度 離體接種是按照侵染率 和擴(kuò)展率確定發(fā)病程度 灰霉病可在植株不同部位 發(fā)病 且在植株不同生長發(fā)育時(shí)期以及不同部位的 發(fā)病程度不同 番茄高節(jié)位比低節(jié)位易感病 苗齡 越大越易感病 ten Have et al 2007 不同研究中 番茄莖和葉對灰霉病抗性的相關(guān)性不同 Egashira 等 2000 認(rèn)為葉和莖的抗性不存在相關(guān)性 而 ten Have等 2007 認(rèn)為番茄莖和葉的抗性相關(guān) 劉書林 2014 在黃瓜蔓枯病的研究中將苗期葉片 抗病主效位點(diǎn)定位在黃瓜 5號染色體上 將莖蔓主 效抗性位點(diǎn)定位在 6號染色體上 因此有必要將黃 瓜不同時(shí)期不同部位進(jìn)行分開接種鑒定 李淑菊 和馬德華 1997 認(rèn)為黃瓜苗期活體接種灰霉病菌 應(yīng)在一葉一心時(shí)采用噴霧法將含孢子 1 10 5 1 10 6 個(gè) mL 1 濃度的菌液噴施葉片表面 保持 20 左 右 飽和濕度 2 d以上 關(guān)于灰霉病在黃瓜成株期 及莖和果實(shí)的接種鑒定研究較少 番茄莖部接種灰 霉病菌通常采用離體法 將莖部切成小段 然后在 橫切面上滴5 L濃度為含孢子 1 10 6 個(gè) mL 1 的 菌液 ten Have et al 2007 果實(shí)接種采用針刺傷 口接種法 李君明 2005 4 2 黃瓜抗病資源的評價(jià)和篩選 抗病資源的評價(jià)與篩選是獲得優(yōu)良抗性材料 進(jìn)行種質(zhì)資源創(chuàng)新及培育抗病新品種的基礎(chǔ) 然而 對黃瓜灰霉病抗病資源進(jìn)行評價(jià)的研究并不多 封 林林等 2006 從國家蔬菜中期種子庫中選出 96 份黃瓜材料進(jìn)行灰霉病抗病性鑒定 篩選出 19份 抗病材料 4 3 遺傳規(guī)律和分子標(biāo)記 研究植物抗灰霉病的遺傳規(guī)律 開發(fā)與抗病基 因連鎖的分子標(biāo)記可為分子標(biāo)記輔助育種 選育優(yōu) 良抗灰霉病新品種奠定基礎(chǔ) 但在黃瓜中關(guān)于抗灰 霉病的遺傳規(guī)律 分子標(biāo)記及基因定位等分子生物 學(xué)研究尚未見報(bào)道 曹嫻等 2011 利用集群分離分析法 BSA 和 SSR分子標(biāo)記技術(shù) 以草莓高感親本達(dá)賽萊克 特 89 與高抗親本甜查理 103 的 F 2 群體為 材料 發(fā)現(xiàn)草莓灰霉病抗性受 1對顯性單基因控 制 并鑒定出 1個(gè)距離抗病基因 15 9 cM的連鎖 標(biāo)記 UFFxa01H05 李君明 2005 利用多毛番 茄 PI134417與 99165 30構(gòu)建的 BC 1 群體進(jìn)行抗 性鑒定 認(rèn)為番茄灰霉病抗性為數(shù)量性狀并鑒定 出 2個(gè) QTLs位點(diǎn) 同時(shí)鑒定了與抗灰霉病位點(diǎn) QTLlygm7 1緊密連鎖的 T1255 CAPs標(biāo)記 并在 不同類型的試驗(yàn)材料中進(jìn)行驗(yàn)證 Zhang等 2016 利用番茄感抗雙親雜交獲得的 F 2 群體鑒定了 3個(gè) QTLs位點(diǎn) 其中 Rbcq2和 Rbcq4與植物發(fā)病率 有關(guān) Rbcq1與病斑擴(kuò)散速度有關(guān) Anuradha等 2011 在鷹嘴豆中檢測到 3個(gè)與灰霉病抗性相關(guān) 的 QTLs位點(diǎn) 這些 QTLs和分子標(biāo)記為植物抗灰 霉病機(jī)制研究和分子標(biāo)記輔助育種奠定了基礎(chǔ) 也 為黃瓜抗灰霉病的研究提供了借鑒 4 4 抗病基因 抗病基因的挖掘?yàn)榛蚩寺『娃r(nóng)作物遺傳改良 奠定了基礎(chǔ) 因此挖掘抗灰霉病基因是植物抗灰霉 病研究的關(guān)鍵問題 在其他植物中關(guān)于灰霉病抗病 基因已有一定的研究基礎(chǔ) 但在黃瓜中的研究甚少 植物中灰霉病抗性基因分為兩類 一是類似于 植物幾丁質(zhì)酶基因 這類基因可以激發(fā) PAMP信號 分子從而觸發(fā)植物天然免疫反應(yīng) 二是與植物激素 調(diào)節(jié)相關(guān)的基因 如擬南芥中的 2個(gè)含有 VQ結(jié)構(gòu) 域的蛋白基因 VQ12和 VQ29 對植物灰霉病抗 性起負(fù)調(diào)控作用 Wang等 2015 發(fā)現(xiàn) VQ12和 VQ29表達(dá)受到抑制的植株對灰霉病菌產(chǎn)生抗性 VQ12和 VQ29蛋白可相互作用形成同型二聚體和 異型二聚體 它們部分參與 JA信號通路 MPK3 基因的表達(dá)與 SA JA有關(guān) 主要參與擬南芥的基 礎(chǔ)抗病性 MPK6與擬南芥 PTI誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗病性 有關(guān) Tanaka et al 2006 Galletti et al 2011 HDTF1是 JA通路的負(fù)調(diào)控因子 可以激活 JA信 號使 JA積累 棉花受到灰霉病菌侵染后 HDTF1 表達(dá)下調(diào) HDTF1表達(dá)受到抑制后 可以顯著增 強(qiáng)棉花對灰霉病菌的抗性 Gao et al 2016 Kishimoto等 2004 過表達(dá)黃瓜中 CHI2基 因后 發(fā)現(xiàn)與非轉(zhuǎn)基因黃瓜相比 轉(zhuǎn)基因黃瓜在 接種后灰霉病癥狀減輕 值得注意的是 去除轉(zhuǎn)基 19 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 專論與綜述 因黃瓜葉片中 CHI2后 葉片對灰霉病菌仍有抑制 作用 可能是由于過表達(dá) CHI2加強(qiáng)了其他內(nèi)源性 防御反應(yīng) 因此 黃瓜對灰霉病菌侵染不是單一 的反應(yīng)機(jī)制 灰霉病菌侵染時(shí) 黃瓜體內(nèi)茉莉酸甲 酯 水楊酸和脫落酸等植物激素會誘導(dǎo)功能蛋白激 酶 CsPti1 L的表達(dá) 從而延緩灰霉病的發(fā)生 Oh et al 2014 Kong等 2015 利用 RNA seq發(fā)現(xiàn) 灰霉病相關(guān)基因主要富集在 脂肪酸降解 纈氨 酸 亮氨酸和異亮氨酸降解 光合作用 亞 麻酸代謝 和 乙醛酸和二羧酸代謝 等途徑 Csa2G010390基因富集在 防御響應(yīng)真菌 途徑 推斷 Csa2G010390可能是黃瓜防御灰霉菌的候選 基因 5 展望 隨著我國設(shè)施水平的發(fā)展 設(shè)施栽培面積不 斷增加 灰霉病已經(jīng)從次要病害上升為主要病害 每年給我國黃瓜產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失 封林林 等 2006 研究黃瓜抗病機(jī)制 培育抗灰霉病黃 瓜新品種是最經(jīng)濟(jì)有效的途徑 目前對黃瓜灰霉病的研究還很少 病原菌與寄 主植物互作關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜 體現(xiàn)在生長發(fā)育的各個(gè) 階段 在抗病育種方面 依然缺乏對抗病資源的評 價(jià)和篩選 遺傳規(guī)律 抗灰霉病基因定位 基因克 隆等方面的研究 因此對黃瓜灰霉病抗性的研究可 以從以下幾個(gè)方面加強(qiáng) 加強(qiáng)對病原菌的研究 和認(rèn)識 廣泛搜集并鑒定國內(nèi)外抗灰霉病優(yōu)良 種質(zhì)資源 為黃瓜抗灰霉病研究提供材料基礎(chǔ) 加強(qiáng)對黃瓜與灰霉病菌互作分子機(jī)制方面的研究 深入了解黃瓜抗灰霉病信號通路 充分利用已 有的抗性材料明確黃瓜抗灰霉病遺傳規(guī)律 通 過基因定位對黃瓜抗灰霉病基因進(jìn)行挖掘 找到與 黃瓜抗灰霉病基因連鎖的分子標(biāo)記 利用抗病基因 研究黃瓜抗病機(jī)理或利用基因編輯等技術(shù)創(chuàng)制新的 抗灰霉病黃瓜材料 利用傳統(tǒng)育種與分子標(biāo)記 輔助選擇相結(jié)合來選育優(yōu)良抗灰霉病黃瓜新品種 參考文獻(xiàn) 曹嫻 高清華 聶京濤 王云莉 何歡樂 蔡潤 潘俊松 2011 草莓灰霉病抗性遺傳分析和分子標(biāo)記初定位 上海交通大學(xué) 學(xué)報(bào) 農(nóng)業(yè)科學(xué)版 29 4 75 78 86 陳俊達(dá) 2017 植物免疫反應(yīng)研究進(jìn)展概述 中國林業(yè)產(chǎn)業(yè) 1 177 178 杜曉峰 王璐 張杰婷 李夢妤 雷春媚 顧容榕 王曉梅 2019 黃瓜灰霉病生防菌株的篩選與鑒定 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 41 2 154 160 范詠梅 陳林鳳 郝敬喆 競中梅 2010 新疆灰霉病菌多態(tài)性及 其致病力分化分析 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 18 3 548 555 封林林 李寶聚 沈鏑 石延霞 李錫香 2006 黃瓜種質(zhì)資源抗 灰霉病的鑒定與評價(jià) 中國蔬菜 s 61 62 景嵐 康振生 2003 植物病原真菌致病毒素草酸的研究進(jìn)展 西 北植物學(xué)報(bào) 23 12 2223 2228 孔維文 2016 黃瓜灰霉病 PMA qPCR方法及互作轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究 碩士論文 北京 北京林業(yè)大學(xué) 李寶聚 陳立芹 孟偉軍 王福建 2003 溫濕度調(diào)控對番茄灰 霉病菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶的影響 植物病理學(xué)報(bào) 33 3 209 212 李君明 2005 番茄抗灰霉病和晚疫病基因定位及分子標(biāo)記多基因 輔助選育技術(shù)研究 博士論文 北京 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 李淑菊 馬德華 1997 黃瓜灰霉病苗期人工接種抗病性鑒定技 術(shù) 天津農(nóng)業(yè)科學(xué) 3 2 13 15 李喜玲 高智謀 李艷梅 曹中革 陳偉 汪世軍 2008 不同寄 主來源的灰葡萄孢對番茄的致病力分化研究 菌物學(xué)報(bào) 27 3 343 350 劉莎莎 陳小龍 2010 與灰葡萄孢致病性相關(guān)的真菌毒素及胞外 酶 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué) 4 859 862 864 劉書林 2014 黃瓜蔓枯病抗性遺傳分析與 QTL定位 碩士論 文 北京 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)向 伍紅 秦天鶯 向會耀 2005 纖維素酶的研究進(jìn)展 西南 民族大學(xué)學(xué)報(bào) 自然科學(xué)版 17 s1 29 33 張靜 2010 湖北省灰霉病病菌區(qū)系和灰葡萄孢菌多樣性研究 博 士論文 武漢 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 張圣平 顧興芳 2020 黃瓜重要農(nóng)藝性狀的分子生物學(xué) 中國農(nóng) 業(yè)科學(xué) 53 1 117 121 張燕 夏更壽 賴志兵 2018 植物抗灰霉病菌分子機(jī)制的研究進(jìn) 展 生物技術(shù)通報(bào) 34 2 10 24 張智 李君明 宋燕 云興福 徐和金 周永健 2005 番茄灰霉 病及其防治研究進(jìn)展 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