中國農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020 53 1 172 182 Scientia Agricultura Sinica doi 10 3864 j issn 0578 1752 2020 01 016 收稿日期 2019 06 03 接受日期 2019 10 23 基金項(xiàng)目 國家 十三五 重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃子課題 2016YFD0100204 25 江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新項(xiàng)目 CX 17 3016 江蘇省農(nóng)業(yè)重大新品種創(chuàng)制 項(xiàng)目 PZCZ201719 江蘇高校 青藍(lán)工程 人才項(xiàng)目 聯(lián)系方式 亓飛 E mail qifei0115 通信作者婁群峰 E mail qflou 開放科學(xué) 資源服務(wù) 標(biāo)識碼 OSID 黃瓜抗白粉病突變體篩選與鑒定 亓飛 林姝 宋蒙飛 張孟茹 陳姝延 張乃心 陳勁楓 婁群峰 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 作物遺傳與種質(zhì)改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南京 210095 摘要 目的 白粉病是危害黃瓜產(chǎn)量 品質(zhì)的最嚴(yán)重的病害之一 抗白粉病材料的發(fā)掘與研究 可以實(shí)現(xiàn) 從根本上解決病害問題 對獲得的 長春密刺 突變體材料進(jìn)行分析 旨在篩選出黃瓜抗白粉病突變體材料 豐 富育種群體 方法 對400 份 長春密刺 突變體材料進(jìn)行苗期接種白粉病菌試驗(yàn) 通過葉片病斑觀察結(jié)合病情 指數(shù)分析 初步篩選出抗病材料 將篩選出的抗病材料在大田環(huán)境下自然發(fā)病進(jìn)一步觀察表型 對初步篩選出的 抗病材料進(jìn)行苗期生理鑒定 測定并分析超氧化物歧化酶 過氧化物酶 過氧化氫酶活性以及葉綠素a 葉綠素b 類胡蘿卜素 可溶性蛋白含量等生理指標(biāo) 通過田間自然發(fā)病進(jìn)一步篩選抗病材料 并測定其蒸騰速率 胞間二 氧化碳濃度 氣孔導(dǎo)度 凈光合速率等光合作用指標(biāo)及乙烯 茉莉酸 水楊酸激素含量 并通過熒光定量 PCR 分 析葉片中乙烯 茉莉酸 水楊酸 木質(zhì)素 病程相關(guān)蛋白等防御信號途徑中相關(guān)基因的表達(dá) 結(jié)果 與感病材料 相比 抗病材料的表面菌斑少 凈光合速率 氣孔導(dǎo)度都優(yōu)于對照 長春密刺 胞間CO2濃度低于 長春密刺 在防御激素方面 抗病材料的乙烯 茉莉酸 水楊酸含量同樣優(yōu)于感病材料 而在成熟期葉片的防御信號途徑相 關(guān)基因表達(dá)上 抗病材料的表達(dá)高于感病材料 通過苗期接種白粉病菌和田間自然發(fā)病綜合篩選出了兩份抗白粉 病突變體材料 Mu 86 2 Mu 58 9 結(jié)論 通過對突變體庫的篩選可以獲得抗白粉病新材料 這些材料的獲得對 黃瓜抗白粉病的遺傳研究和新品種培育具有重要價(jià)值 關(guān)鍵詞 黃瓜 突變體 抗白粉病 篩選鑒定 Screening and Identification of Cucumber Mutant Resistant to Powdery Mildew QI Fei LIN Shu SONG MengFei ZHANG MengRu CHEN ShuYan ZHANG NaiXin CHEN JinFeng LOU QunFeng College of Horticulture Nanjing Agricultural University State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement Nanjing 210095 Abstract Objective Powdery mildew is one of the most serious diseases that effects cucumber yield and quality The discovery and research of materials resistant to powdery mildew can fundamentally solve the disease problem To screen out materials of cucumber resistant to powdery mildew and enrich the breeding population the Changchunmici mutants were investigated and analyzed in the study Method Totally 400 Changchunmici mutant lines were inoculated with powdery mildew at seedling stage and resistant materials were screened preliminarily based on leaf lesion observation combined with disease index analysis The selected resistant materials were further observed in the natural environment in the field environment Physiological indexes of resistant materials in the seedling stages were analyzed including the activities of superoxide dismutase peroxidase and catalase activity and physiological indicators such as the contents of chlorophyll a chlorophyll b carotenoids and soluble protein 1期 亓飛等 黃瓜抗白粉病突變體篩選與鑒定 173 The resistant materials were screened by natural pathogenesis in the field and were further analyzed for the photosynthetic indexes such as transpiration rate intercellular carbon dioxide concentration stomatal conductance and net photosynthetic rate And the contents of ethylene jasmonic acid and salicylate were determined and expression of related genes in defense signaling pathways such as ethylene jasmonic acid salicylic acid lignin and disease related proteins in leaves were analyzed by real time PCR Result Compared with susceptible materials the resistant materials had less plaque The net photosynthetic rate and stomatal conductance of resistant materials were higher than those of wild type Changchunmici and the intercellular CO 2 concentration of them was lower than that of Changchunmici In terms of defensive hormones the contents of ethylene jasmonic acid and salicylate of resistant materials were higher than those in control The expression of defense signal related genes in mature leaves of resistant materials was higher compared with susceptible materials Two powdery mildew resistance materials Mu 86 2 and Mu 58 9 were screened by inoculation of powdery mildew in seedling stage and natural disease Conclusion The new materials resistant to powdery mildew could be obtained by screening mutant libraries The acquisition of these materials had the important value for the genetic research and new varieties breeding of cucumber resistance to powdery mildew Key words cucumber mutant resistance to powdery mildew screening and identification 0 引言 研究意義 黃瓜是一種非常重要的蔬菜作物 1 黃瓜在生產(chǎn)上易感染多種病害 其中白粉病是危害最 嚴(yán)重的病害之一 黃瓜的產(chǎn)量每年都會因白粉病的發(fā) 生而大幅度降低 2 黃瓜白粉病病菌的分布范圍很廣 且傳播速度快 在適合的條件下 它可以迅速繁殖 3 白粉病菌一般從下部葉片開始染病 隨后霉菌逐漸覆 蓋整個葉片 這不但降低植株的光合效能 同時(shí)病菌 持續(xù)感染下去甚至導(dǎo)致整個植株萎黃枯干 早衰死亡 進(jìn)而使植株產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)下降 4 目前生產(chǎn)上主要 使用化學(xué)殺菌劑控制 然而 過多的使用化學(xué)殺菌劑 導(dǎo)致白粉病菌產(chǎn)生抗藥性 同時(shí)不利于環(huán)境保護(hù)和公 共衛(wèi)生 因此 培育對白粉病菌具有抗性的品種是控 制該病的最有效和環(huán)保的措施 5 前人研究進(jìn)展 國際上認(rèn)為黃瓜白粉病病原菌是子囊菌亞門白粉菌屬 E cichoracearum 和單囊殼屬 S fuliginea 這兩種白粉 病在各個國家的分布不盡相同 6 抗病黃瓜品種的選 育已經(jīng)進(jìn)行了幾十年 但到目前為止尚未對潛在的抗 性基因進(jìn)行功能性鑒定 7 長春密刺 是典型的華 北市場型黃瓜自交系 具有高收獲性 對白粉病病原 體敏感 是一種易感基因型品種 周鳳珍等 8 在對黃 瓜白粉病抗性鑒定的研究中發(fā)現(xiàn) 在使用濃度為 4 8 10 5 6 10 5 mL 的孢子懸浮液接種黃瓜第二真 葉期幼苗發(fā)現(xiàn)材料的感病率達(dá)到 100 對于白粉病 的分級大多采用 5 個級別表示不同的染病情況 根 據(jù)病情指數(shù)作出相應(yīng)的抗性分級 植物病原菌侵入 植物體后會引起很多復(fù)雜的變化 除了肉眼可見的 外表變化外 在寄主植物體內(nèi)還會發(fā)生復(fù)雜的生理 生化變化 9 以抵御外來病原菌的入侵 植物在逆境 脅迫條件下 體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和消除的代謝平衡受到 破壞 這將導(dǎo)致活性氧過剩 繼而引發(fā)和加劇膜脂過 氧化作用 從而破壞膜的結(jié)構(gòu)與功能 對植物產(chǎn)生毒 害 10 11 同時(shí) 病菌入侵植物體后還會使植物光合作 用能力下降 葉綠素含量降低 12 導(dǎo)致植物產(chǎn)量下 降 嚴(yán)重會造成植株死亡 在遭受病菌入侵后 植物 能夠通過細(xì)胞膜上的受體來識別病原菌從而觸發(fā)復(fù) 雜的信號傳導(dǎo)途徑 以此來應(yīng)對入侵 最主要的有 ET SA JA 介導(dǎo)的 3 條信號途徑 這 3 條信號途徑 分別參與不同的互作類型 引發(fā)不同的防御反應(yīng) 13 14 而植物通過自身發(fā)生不同的防御反應(yīng)來共同抵御外 來病原物的入侵 本研究切入點(diǎn) 近年來 隨著人 們生活質(zhì)量的不斷提高 對于蔬菜品質(zhì)的要求也越來 越高 加上長期使用殺菌劑使白粉病菌產(chǎn)生抗藥性 15 人們迫切希望能通過育種工作來選育優(yōu)良品種 通過 人工誘變育種來獲得優(yōu)良品種是一種有效的方式 擬解決的關(guān)鍵問題 本研究利用已經(jīng)建立的 長春 密刺 突變體庫 通過苗期接種白粉病菌處理 依照 病級以及病情指數(shù) 幼苗相關(guān)的生理指標(biāo)分析篩選出 苗期抗白粉病的突變體單株 然后在大田環(huán)境下進(jìn)一 步觀察 在表型觀察的基礎(chǔ)上 分析其光合指標(biāo)及防 御相關(guān)激素及與防御信號途徑相關(guān)基因的表達(dá) 綜合 各項(xiàng)指標(biāo) 最終篩選出抗性好的黃瓜突變體材料 1 材料與方法 試驗(yàn)于 2017年 10月至 2019年 3月在南京農(nóng)業(yè)大 學(xué)園藝學(xué)院進(jìn)行 1 1 材料與處理 本試驗(yàn)所用材料由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)葫蘆科作物遺傳 與種質(zhì)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室提供 前期已獲得華北型黃瓜品種 174 中 國 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 5 3 卷 長春密刺 經(jīng)甲基磺酸乙酯誘變處理后自交三代的 突變體材料 挑選飽滿度和整齊度都較高的種子用于 試驗(yàn) 苗期抗病性篩選 對 400份突變體材料進(jìn)行編號 每個編號取 5 粒籽粒飽滿 大小一致的種子置于紙杯 中 用 56 的溫水浸泡 6 h 后將水倒掉 置于光照培 養(yǎng)箱中進(jìn)行催芽 種子出芽后將種子播于 72 孔穴盤 中 待長到二片真葉時(shí)進(jìn)行人工接種 接種用的病原 菌孢子取自當(dāng)季病葉 用毛筆將病葉上的病原孢子刷 下來 收集到無菌水中 攪拌均勻后用血球計(jì)數(shù)板測 定孢子濃度 所用的孢子懸浮液濃度為 5 10 5 個 mL 采用噴霧法進(jìn)行接種 噴至葉片上沾滿水珠為止 重 復(fù) 3 次 接種后將材料放于溫室中 溫度控制在白天 22 26 夜晚 18 20 濕度在 80 左右 接種后 進(jìn)行病情指數(shù)統(tǒng)計(jì) 病情指數(shù)分級采用 SAKATA等 16 的方法 田間抗病性篩選 將從苗期篩選出的抗病突變體 材料播種催芽 催芽方式與苗期篩選相同 將突變體 材料與抗性對照材料 IL52 17 種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白 馬基地 自然發(fā)病 進(jìn)行田間觀察 在結(jié)果期對植株的 功能葉進(jìn)行光合參數(shù)和防御相關(guān)激素含量的測定分析 1 2 顯微觀察 取接種后 7 d 的葉片 用磷酸緩沖液沖洗樣品 采 用 Lecia DVM6 數(shù)碼視頻顯微鏡對葉片表面病菌進(jìn)行 顯微觀察 取接種后 7 d 的葉片 用磷酸緩沖液清洗 樣品 清洗后將樣品切成 1 cm 2 的小塊 用 2 5 戊二 醛固定 樣品制備參考康振生 18 的方法 樣品制備完 成后在日立 S 3000N 掃描電子顯微鏡下觀察并拍照 1 3 酶及葉綠素 可溶性蛋白含量的測定 超氧化物歧化酶 SOD 活性測定采用氮藍(lán)四唑 光化還原法 過氧化物酶 POD 活性測定采用愈創(chuàng) 木酚法 過氧化氫酶 CAT 活性測定采用紫外分光 光度計(jì)法 葉綠素含量測定采用乙醇溶液浸提法 可 溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法 1 4 光合參數(shù)測定 采用 LI 6400XT光合儀 在晴天中午光強(qiáng)為 6 000 lx 時(shí)選取不同編號同一部位的第 7 8 節(jié)葉片測量凈 光合速率 蒸騰速率 胞間 CO 2 濃度 氣孔導(dǎo)度 1 5 內(nèi)源激素測定 取第 7 8 節(jié)葉片 功能葉 0 5 g 采用 ELISA 法 19 測定乙烯 茉莉酸 水楊酸含量 試劑盒由南京 森貝伽生物科技有限公司提供 每份樣品進(jìn)行 3 次重 復(fù) 1 6 RNA 提取 反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 在成熟期采植株第 7 8 節(jié)葉片 總 RNA 的提取 采用 Trizol 法 反轉(zhuǎn)錄利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 TaKaRa 合成 CTR EIN2 ETR EDS5 NPR1 CCR PAL COI1 PDF PR2 及內(nèi)參基因 Action 的引物 20 利用 CFX96 熒光定 量 PCR 儀 Bio Rad 公司 以及 SYBR Green1 試劑盒 TaKaRa 進(jìn)行擴(kuò)增 反應(yīng)條件為 95 3 min 95 10 s 60 30 s 共 40 個循環(huán) 對 PCR結(jié)束后樣品進(jìn)行 熔解曲線分析 確定為特異性擴(kuò)增 所有樣品進(jìn)行 3 次重復(fù) 采用 2 CT 法進(jìn)行基因相對表達(dá)量分析 2 結(jié)果 2 1 黃瓜突變體苗期抗白粉病材料的篩選 2 1 1 抗病性病情指數(shù)分析 在黃瓜幼苗長到二葉 一心 用 5 10 5 個 mL 濃度的白粉病原菌懸浮液對幼 苗進(jìn)行噴灑接種 觀察發(fā)現(xiàn) 不同編號材料的抗病性 表現(xiàn)不一 依照病情指數(shù)將 400 份突變體材料分類 其中高抗材料 3 份 占接種材料總數(shù)的 0 75 中抗 材料 8 份 占 2 中感材料 30 份 占 7 50 其余 的為感病材料 共 359份 占總數(shù)的 89 75 根據(jù)病情指數(shù)分析 將選出的 3 份抗性材料和 8 份中抗材料進(jìn)一步進(jìn)行幼苗期抗性相關(guān)指標(biāo)的鑒定分 析 表 1 表1 初步篩選的抗病突變體的病情指數(shù)分析 Table 1 Analysis of disease index of primary screening resistant mutants 編號 Code 病情指數(shù) Disease index 抗性類型 Disease resistance 編號 Code 病情指數(shù) Disease index 抗性類型 Disease resistance Mu 86 2 2 22 抗R Mu 104 2 20 20 中抗 MR Mu 58 9 3 33 抗R Mu 106 3 22 22 中抗 MR Mu 50 10 4 18 抗R Mu 59 8 22 22 中抗 MR Mu 9 9 9 00 中抗MR Mu 150 3 23 23 中抗 MR Mu 60 5 10 00 中抗MR Mu 118 2 24 24 中抗 MR Mu 84 8 15 56 中抗MR 1期 亓飛等 黃瓜抗白粉病突變體篩選與鑒定 175 2 1 2 感染白粉病菌葉片的顯微觀察 通過接種白 粉病菌 7 d 后在對照幼苗葉片部位可以清楚的觀察到 一層白粉 取其中的一份抗病材料 Mu 58 9 通過顯 微觀察在抗病材料未能觀察到菌絲體 圖 1 A 而 在感病材料 長春密刺 葉片上能清楚的觀測到病原 菌絲體 圖 1 B 通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)在不同病級的材料上 白 粉病菌絲的生長情況不同 在高抗材料 Mu 86 2 葉片 上未觀察到菌絲體 圖 2 A 在中抗材料上僅觀察 到很少的孢子 隨著感病程度加強(qiáng) 病原菌絲體也逐 漸明顯 在感病材料上能觀察到從菌絲中出現(xiàn)長且為 圓柱形的分生孢子 孢子直立地分開分枝 直至布滿 整個葉片 2 1 3 生理生化指標(biāo) 如表 2 所示 與對照 CK 長春密刺 相比 黃瓜突變體材料中葉綠素 a 葉綠素 b 類胡蘿卜素含量均有不同程度變化 其 中 除 Mu 104 2 Mu 9 9 Mu 50 10 的葉綠素 a 和葉綠素 b 指標(biāo)低于對照 其他材料的 3 種色素指 標(biāo)均高于對照 且葉綠素 a 和葉綠素 b 的變化較類 胡蘿卜素明顯 A Mu 58 9 B 長春密刺 Changchunmici 圖1 接種病菌處理后在顯微觀察下的白粉病菌絲生長情況 Fig 1 Growth of Podosphaera fusca mycelium under microscopic observation after inoculation 表2 接種白粉病菌后對黃瓜突變體幼苗色素含量影響 Table 2 Effect of inoculation of Podosphaera fusca on the pigment content of cucumber mutant seedlings 編號 Code 葉綠素 a含量 Chlorophyll a content 葉綠素 b 含量 Chlorophyll b content 類胡蘿卜素 Carotenoids content CK 13 556 1 089abcd 4 713 1 081b 2 420 0 987b Mu 86 2 14 869 0 521abc 5 536 0 179ab 2 946 0 195ab Mu 58 9 16 723 0 536a 6 298 0 504ab 2 887 0 484ab Mu 50 10 11 825 3 908d 4 566 0 756ab 2 501 0 942b Mu 9 9 11 597 2 778bcd 4 291 0 886b 2 526 0 450b Mu 60 5 14 317 2 577abc 5 342 0 709ab 2 853 0 356ab Mu 84 8 14 921 2 864abc 5 635 1 691ab 2 950 0 296ab Mu 104 2 11 845 1 490cd 4 557 0 526b 2 609 0 475b Mu 106 3 14 333 2 758abc 5 599 0 923ab 2 993 0 292ab Mu 59 8 15 372 3 327abc 5 930 1 075ab 3 042 0 938a Mu 150 3 14 749 0 876abc 5 594 0 886ab 2 858 0 466ab Mu 118 2 15 839 1 838ab 6 100 0 822a 2 783 0 185ab CK 對照 長春密刺 不同字母表示不同處理間差異顯著 P 0 05 下同 CK Control Changchunmici The different letters indicate significant difference at 0 05 level among different treatments The same as below 176 中 國 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 5 3 卷 A Mu 86 2 B Mu 150 3 C Mu 1 5 D 長春密刺 Changchunmici 圖2 接種白粉病菌后不同材料的SEM 掃描電鏡 觀察 Fig 2 SEM observation of different materials after inoculation with Podosphaera fusca 如表 3 所示 有 3 個材料的 POD 活性顯著高于對 照 4 個突變體材料 SOD 活性顯著高于對照 4 個突 變體材料 CAT 活性顯著高于對照 其中 Mu 86 2 和 Mu 58 9 的這 3 種酶活性顯著高于對照 在這 3 種活 性酶中 突變體材料與 長春密刺 相比 SOD CAT 上升較少 POD 的活性比對照上升明顯 表3 接種白粉病菌后對黃瓜突變體幼苗抗氧化酶活性的影響 Table 3 Effects of inoculation of Podosphaera fusca on the activities of antioxidant enzymes in cucumber mutants 編號Code POD活性 POD activity U g 1 min 1 SOD活性 SOD activity U g 1 CAT活性 CAT activity U g 1 min 1 CK 0 876 0 011bc 0 331 0 041bcde 13 104 0 381c Mu 86 2 2 143 0 651a 0 450 0 108b 16 906 0 565ab Mu 58 9 2 186 0 311a 0 415 0 028bc 18 800 2 630a Mu 50 10 1 836 0 526b 0 588 0 024a 14 960 0 876bc Mu 9 9 1 588 0 503b 0 309 0 003cde 13 120 0 155c Mu 60 5 1 208 0 520b 0 358 0 085bcde 14 040 0 501bc Mu 84 8 1 245 0 497b 0 302 0 115bcde 18 506 0 966a Mu 104 2 0 832 0 119bc 0 327 0 049bcde 11 920 0 969d Mu 106 3 0 589 0 237c 0 441 0 091bc 15 093 1 927ab Mu 59 8 2 272 0 404a 0 247 0 046e 13 040 0 855c Mu 150 3 0 977 0 228bc 0 268 0 087de 14 640 1 222bc Mu 118 2 0 964 0 152bc 0 380 0 031bcd 14 340 0 650bc 如圖 3 所示 不同突變體可溶性蛋白質(zhì)含量存在 差異 其中 Mu 58 9 Mu 86 2 Mu 50 10 幼苗的可 溶性蛋白的含量顯著高于對照 抗性更好 Mu 84 8 Mu 106 3 的可溶性蛋白含量顯著低于對照 其他突變 體材料與對照相比無顯著差異 2 2 黃瓜抗白粉病突變體田間篩選 2 2 1 突變體材料田間抗病性的表型觀察 通過苗 期篩選得到的材料在田間進(jìn)行觀察 發(fā)現(xiàn)除 Mu 86 2 Mu 58 9 外 其他材料抗性較差 在田間自然狀態(tài)下 抗病材料 Mu 58 9 相對于感病材料葉片表面白粉病斑 更少 感病材料白粉病斑濃厚 嚴(yán)重的導(dǎo)致植株死亡 圖 4 2 2 2 光合指標(biāo)測定 如表 4 所示 在對田間自然發(fā) 病品種的光合指標(biāo)測定分析中發(fā)現(xiàn) 抗性材料 Mu 58 9 Mu 86 2 IL52在凈光合速率 氣孔導(dǎo)度方 面都優(yōu)于對照 其中 Mu 58 9的凈光合速率相比 長 春密刺 上升 6 366 mol m 2 s 1 升高 38 氣孔導(dǎo) 度上升 0 604 mmol m 2 s 1 升高 106 Mu 86 2 比 長春密刺 凈光合速率上升 6 366 mol m 2 s 1 升 高 38 氣孔導(dǎo)度上升 0 255 mmol m 2 s 1 升高 45 IL52比 長春密刺 凈光合速率上升 7 1 mol m 2 s 1 升高 43 氣孔導(dǎo)度上升 0 22 mmol m 2 s 1 升高 38 而蒸騰速率與對照相似 胞間 CO 2 濃度低于 對照 1期 亓飛等 黃瓜抗白粉病突變體篩選與鑒定 177 bc bcd bc d bc d bc bc ab a a bc 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 CCMC Mu 86 2 Mu 58 9 Mu 50 10 Mu 9 9 Mu 60 5 Mu 84 8 Mu 104 2 Mu 106 3 Mu 59 8 Mu 150 3 Mu 118 2 編號 Code 可溶性蛋白質(zhì)含量 Content of soluble protein mg mL 1 圖3 接種白粉病菌后黃瓜突變體幼苗的可溶性蛋白質(zhì)含量 Fig 3 Soluble protein content of cucumber mutant seedlings after inoculation with Podosphaera fusca A 長春密刺 Changchunmici B Mu 58 9 圖4 田間黃瓜突變體抗性情況 Fig 4 Resistance of cucumber mutants in the field 2 2 3 防御激素含量測定 如表 5所示 3份抗性材 料的 3種激素含量都高于對照 長春密刺 Mu 58 9 的茉莉酸含量比對照上升 349 603 pmol L 1 升高 26 Mu 86 2 上升 405 906 pmol L 1 升高 30 IL52 上升 345 675 pmol L 1 升高 25 在水楊酸含量上 與對照相比 Mu 58 9 上升 154 193 pmol L 1 升高 16 Mu 86 2 上升 103 828 pmol L 1 升高 11 IL52 上升49 59 pmol L 1 升高 5 在乙烯含量上 與對 照相比 Mu 58 9 上升 30 235 ng L 1 升高 19 Mu 86 2 上升 35 185 ng L 1 升高 22 IL52 上升 63 196 ng L 1 升 高 40 表明在防御外界病原菌入侵 時(shí) 3 種激素起到了重要作用 2 2 4 防御信號途徑中相關(guān)基因表達(dá)分析 如圖 5 所示 利用 Real time PCR 方法分析田間自然發(fā)病條 件下防御信號途徑中相關(guān)基因的表達(dá) 在黃瓜成熟期 葉片的基因表達(dá)分析顯示 與對照材料 長春密刺 相比 Mu 58 9 Mu 86 2 IL 52中乙烯相關(guān)基因 CTR1 EIN2 ETR 表達(dá)量均較高 且 ETR 表達(dá)最明顯 水楊 酸相關(guān)基因 NPR1 在抗性材料中呈現(xiàn)高表達(dá) 茉莉酸 相關(guān)基因在 COI1 在抗性材料中呈現(xiàn)高表達(dá) 病程相 關(guān)蛋白基因 PR2 在 Mu 58 9 Mu 86 2 IL 52 中比在 對照中表達(dá)要高 178 中 國 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 5 3 卷 相對表達(dá)量 Relative erpression level 0 2 0 4 0 6 0 8 1 2 CK Mu 58 9 Mu 86 2 IL 52 EIN2 a b b c 0 1 0 CK Mu 58 9 Mu 86 2 IL 52 CTR1 c b b a 相對表達(dá)量 Relative erpression level 0 2 0 4 0 6 0 8 1 2 0 1 0 COI1 CK Mu 58 9 Mu 86 2 IL 52 相對表達(dá)量 Relative erpression level 0 2 0 4 0 6 0 8 1 2 0 1 0 PAL CK Mu 58 9 Mu 86 2 IL 52 相對表達(dá)量 Relative erpression level 0 2 0 4 0 6 0 8 1 2 0 1 0 CCR 相對表達(dá)量 Relative erpression level 0 2 0 4 0 6 0 8 1 2 0 1 0 CK Mu 58 9 Mu 86 2 IL 52 NPR1 相對表達(dá)量 Relative erpression level 0 2 0 4 0 6 0 8 1 2 0 1 0 CK Mu 58 9 Mu 86 2 IL 52 ETR b a b c CK Mu 58 9 Mu 86 2 IL 52 相對表達(dá)量 Relative erpression level 0 2 0 4 0 6 0 8 1 2 0 1 0 EDS5 CK Mu 58 9 Mu 86 2 IL 52 相對表達(dá)量 Relative erpression level 0 2 0 4 0 6 0 8 1 2 0 1 0 CK Mu 58 9 Mu 86 2 IL 52 PR2 a b b c 相對表達(dá)量 Relative erpression level 0 2 0 4 0 6 0 8 1 2 0 1 0 CK Mu 58 9 Mu 86 2 IL 52 PDF1 2 相對表達(dá)量 Relative erpression level 0 2 0 4 0 6 0 8 1 2 0 1 0 b a b c b a b c b a b c b a b c b a b c b a b c 圖5 田間自然發(fā)病條件下防御信號途徑中相關(guān)基因的表達(dá) Fig 5 Expression of related genes in defense signaling pathways under natural pathogenesis in the field 1期 亓飛等 黃瓜抗白粉病突變體篩選與鑒定 179 表4 田間感染白粉病菌后對突變體材料光合指標(biāo)影響 Table 4 Effect of photosynthetic indicators on mutant materials after field infection with Podosphaera fusca 編號 Code 凈光合速率 Net photosynthetic rate mol m 2 s 1 氣孔導(dǎo)度 Stomatal conductance mmol m 2 s 1 胞間 CO 2 濃度 Intercellular CO 2 concentration mol mol 1 蒸騰速率 Transpiration rate mmol m 2 s 1 CK 16 500 1 252b 0 569 0 042b 302 666 9 865a 10 866 0 351a Mu 58 9 22 866 1 625a 1 173 0 188a 286 000 1 000b 10 666 0 650a Mu 86 2 22 866 2 281a 0 824 0 155b 278 000 10 000b 10 123 0 849a IL52 23 600 0 435a 0 789 0 074 b 295 666 3 780b 11 133 0 416a 表5 田間感染白粉病菌后對突變體材料防御激素含量影響 Table 5 Effect of defensive hormone content on mutant materials after field infection with Podosphaera fusca 編號 Code 茉莉酸含量 Jasmonic acid content pmol L 1 水楊酸含量 Salicylic acid content pmol L 1 乙烯含量 Ethylene content ng L 1 CK 1346 912 25 758b 960 066 23 283d 159 509 3 868d Mu 58 9 1696 515 31 178a 1114 259 19 026b 189 744 5 398b Mu 86 2 1752 818 51 115a 1063 894 29 433a 194 694 6 823b IL52 1692 587 47 625a 1009 656 10 652c 222 705 5 158a 3 討論 本研究獲得抗白粉病黃瓜突變體 Mu 58 9 Mu 86 2 這為進(jìn)一步研究黃瓜抗病機(jī)制提供了材 料 植物在受到病原菌侵害后 病菌迅速繁殖 造成 葉片組織受損進(jìn)而使其光合速率下降 葉綠素含量降 低 21 在本研究中 通過研究發(fā)現(xiàn)受到病菌侵害后 的不同突變體材料葉綠素 a 葉綠素 b 類胡蘿卜素 均有不同程度的下降 且葉綠素 a 葉綠素 b 的含量 變化明顯大于類胡蘿卜素 葉綠素 a 主要存在于兩 個光系統(tǒng)的 PS PS 核心復(fù)合物中 葉綠素 b 主要是兩個光系統(tǒng)的天線組分 類胡蘿卜素是光合 作用的輔助色素 白粉病菌侵染后 使黃瓜葉片光 合膜全鏈 D 電子傳遞受損 受損的主要部位在光系 統(tǒng) 22 葉綠素 a 比其他兩種色素對白粉病菌更敏 感 本研究還發(fā)現(xiàn) 抗性材料的凈光合速率 氣孔 導(dǎo)度比對照高 黃瓜在遭受到病菌侵害后 由于葉 肉細(xì)胞光合活性下降從而造成光合速率下降 23 進(jìn) 而影響植株正常生長 為抵御病原物侵染或逆境的影響 體內(nèi)防御酶 活性的次生代謝物含量或發(fā)生明顯變化 24 多數(shù)學(xué) 者認(rèn)為植物體內(nèi)防御性酶 POD SOD CAT等的活 性變化與植物的抗病性具有一定的關(guān)系 25 SOD POD CAT 能夠有效清除過量的活性氧 減少對膜 結(jié)構(gòu)和功能的破壞 SOD 活性的增加和減少經(jīng)常與 疾病抗性和易感性相關(guān) 植物受到病原菌侵入后需 要增加 SOD 的活性來催化氧化爆發(fā)期間 H 2 O 2 的合 成以防止超氧化物的積累 26 CAT 是保護(hù)植物免受 ROS 氧化損傷的重要酶 27 幾種酶共同協(xié)同來去除 O 2 和 H 2 O 2 28 通過對防御性酶的研究發(fā)現(xiàn) 與對照 相比 3 種防御酶的活性有不同程度的變化 高抗材 料較對照活性最強(qiáng) 在對材料的表型進(jìn)行觀察時(shí) 發(fā)現(xiàn)在苗期篩選得到的中抗材料在田間成熟下發(fā)病 嚴(yán)重 葉片上布滿白粉 幼苗期的表型與成熟期有 差異 在對苗期進(jìn)行病情分級時(shí)或許應(yīng)該采用更嚴(yán) 格的分級 植物體內(nèi)的防御反應(yīng)機(jī)制十分復(fù)雜 植物通過多 條途徑對外來的病原物產(chǎn)生反應(yīng) 研究最深入的抗病 信號途徑主要是乙烯 茉莉酸 水楊酸途徑 29 植 物抗病性受到乙烯的調(diào)控 乙烯在植物抗病性上的