34(1)79-85 中國生物防治學(xué)報 Chinese Journal of Biological Control 2018年 2 月 收稿日期： 2017-01-29 基金項目： 國家自然科學(xué)基金（ 31401812）；國家重點研發(fā)計劃（ 2017YFD0201201）；黑龍江自然科學(xué)基金（ C2016025）；植物病蟲害生物 學(xué)國家重點實驗室開放基金（ SKLOF201705） 作者簡介： 雒國興， 碩士研究生 ， E-mail： 15765534169163.com； *通信作者，研究員， E-mail： jzhangippcaas.cn。 DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2018.01.009 蘇云金芽胞桿菌 Vip3Aa11蛋白 C端點突變 對其殺蟲活性的影響 雒國興 1，劉榮梅 1，李海濤 1,2，張金波 1，高繼國 1，張 杰 1,2* （ 1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030； 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 /植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193） 摘要： 為 研究 Vip3Aa11 羧基 端對其殺蟲活性和敏感性的影響，本研究利用定點突變技術(shù)構(gòu)建了 Vip3Aa11的 3 個突變體 S543N、 D547E 和 T681V。經(jīng) SDSPAGE 分析證實 3 個 突變體蛋白均能在大腸桿菌中表達(dá)分子量約 88 kD 的目的蛋白，生物活性測定顯示，與 Vip3Aa11 相比，突變體 S543N 對甜菜夜蛾 Helicoverpa armigera 的殺蟲活性提高了 5 倍。突變體 D547E 對甜菜夜蛾殺蟲活性 顯著 降低。 突變體 S543N、 D547E和 T681V對棉鈴蟲 Spodoptera exigua 的殺蟲活性無明顯變化 。 說明 Vip3Aa11 C 端部分氨基酸的定點突變對其殺蟲活性有影響，且對不同害蟲的殺蟲活性變化趨勢不同。本研究 比較了 Vip3Aa11 蛋白與突變蛋白之間殺蟲活性的差異，為研究 Vip3Aa 類蛋白的結(jié)構(gòu)和機理奠定基礎(chǔ)。 關(guān) 鍵 詞： 蘇云金芽胞桿菌；營養(yǎng)期殺蟲蛋白；定點突變；活性分析 中圖分類號： S476.12 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 1005-9261(2018)01-0079-07 The Influence of C-terminus Site-directed Mutation on the Toxicity of Bacillus thuringiensis Vip3Aa11 Protein LUO Guoxing1, LIU Rongmei1, LI Haitao1,2, ZHANG Jinbo1, GAO Jiguo1, ZHANG Jie1,2* (1. College of Life Sciences, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests/Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China) Abstract: Vegetative insecticidal proteins (VIPs) of Bacillus thuringiensis show a wide insecticidal spectrum against a wide variety of lepidopteran pests. The insecticidal activity and specificity of the Vip3Aa protein derived from different Bt strains are highly different, although the similarities between these proteins are higher than 95%. To determine whether the residues from the Vip3Aa11 C-terminus contribute to the insecticidal activity, three mutants (S543N, D547E and T681V) of Vip3Aa11 were constructed by site directed mutagenesis. Through SDS-PAGE, the mutants produced a 88 kD fusion protein, indicating that all mutants had successful expression in E. coli. Bioassay detection indicated that the insecticidal activity of the S543N mutant against Spodoptera exigua increased obviously, and the LC50 value was approximately 5-fold higher than that of the Vip3Aa11, while the activity of D547E mutant against S. exigua decreased obviously. The activities of all the mutants against Helicoverpa armigera had no obvious changes. The results indicated that the site directed mutagenesis of some amino acids from Vip3Aa11 C terminus had an effect on insecticidal activity, and the effect was not consistent against different Lepidopteran pests even in the same mutant. In this study, the differences of insecticidal activity between Vip3Aa11 and mutant proteins serve a guideline for the study of Vip3Aa protein structure and activity mechanism. Key words: Bacillus thuringiensis; vegetative insecticidal proteins; site directed mutation; activity 80 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報 第 34 卷 近年來，鱗翅目害蟲的啃食導(dǎo)致農(nóng)作物大量減產(chǎn) 1,2。且隨著蘇云金芽胞桿菌 Bacillus thuringiensis（簡稱 Bt） 內(nèi)毒素 在 微生物 工程菌和轉(zhuǎn)基因抗蟲植物中的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致 一些 昆蟲對 Bt 殺蟲蛋白 產(chǎn)生耐藥性以及抗性 3-5。營養(yǎng)期殺蟲蛋白（ Vip）是由蘇云金芽胞桿菌產(chǎn)生的一種新型殺蟲蛋白，與目前研究較為深入的 Cry 蛋白相比， Vip3Aa 蛋白在營養(yǎng)生長期就開始分泌，且并不形成晶體；在氨基酸序列的進(jìn)化上與 Cry 沒有同源性；殺蟲作用位點與 Cry 蛋白也無競爭關(guān)系； Vip3Aa 蛋白結(jié)構(gòu)尚未解析，殺蟲作 用機制的研究相對滯后 6-10。 近些年有關(guān) Vip3Aa 蛋白的突變研究較多，且研究表明 Vip3Aa 蛋白上某些氨基酸區(qū)域與其殺蟲活性及特異性有關(guān)。如 Selvapandiyan 等 11將 Vip3Aa 蛋白 N 端的 39 個氨基酸殘基缺失，則顯著降低了其對斜紋夜蛾 Spodoptera litura（ Fabricius） 的毒力，而 C 端的 154 個氨基酸殘基缺失導(dǎo)致 Vip3Aa 蛋白對斜紋夜蛾完全喪失毒力，對蛀莖斑螟 Chilo Partellus 的毒性輕微下降。相比之下， Gayen 等 12研究表明 Vip3Aa N 端的 200 個氨基酸缺失，導(dǎo)致對棉鈴蟲 Helicoverpa armigera（ Hbner） 、海灰翅夜蛾 Spodoptera littoralis（ Boisduval） 、小地老虎 Agrotis ipsilon（ Hufnagel）和三化螟 Tryporyza incertulas（ Walker） 的殺蟲活性增強了 2 3 倍，而 C 端的 200 個氨基酸缺失，則維持了對棉鈴蟲和小地老虎較低水平的殺蟲活性。 Dong等 13用絲氨酸（ Ser）取代位于 Vip3Aa7 蛋白 62 kD 核心功能區(qū) 292、 507 和 401 位點的 3 個高度保守的半胱氨 酸（ Cys）殘基， 3 個突變蛋白 C292S、 C401S 和 C507S 對小菜蛾 Plutella xylostella（ Linnaeus）的殺蟲活性降低或者喪失。 Liu 等 14利用定點突變技術(shù)，成功構(gòu)建了 Vip3Aa11 的氨基端 9 個突變蛋白，獲得了甜菜夜蛾殺蟲活性提高的突變蛋白 1 個（ S193T）。對棉鈴蟲殺蟲活性提高的突變蛋白 3 個（ S9N、S193T、 S194L）。 上述研究結(jié)果充分說明了 Vip3Aa 蛋白的 N 端和 C 端對于殺蟲活性的發(fā)揮起到了舉足輕重的作用。 基于 Vip3Aa11 和 Vip3Aa39 蛋白氨基酸序列之間僅 存在 39 個氨基酸差異，而 2 種蛋白的殺蟲活性卻存在很大的差異 14。本研究利用定點突變技術(shù)構(gòu)建了 Vip3Aa11蛋白的 3個突變體 S543N、 D547E和 T681V，進(jìn) 行了 3 個突變體 對 甜菜夜蛾和棉鈴蟲的生物活性測定，研究 Vip3Aa11 C 端單個氨基酸的改變對其殺蟲活性的影響。 本文 為研究 Vip3 毒素的蛋白結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系提供線索。 1 材料與方法 1.1 菌株和質(zhì)粒 試 驗所用菌株與質(zhì)粒詳見表 1。 表 1 菌株與質(zhì)粒 Table 1 Strains and plasmids 菌株與質(zhì)粒 Strains and plasmids 特點 Characteristics 大腸桿菌 Escherichia coli BL21 F-ompT hsdSB (RB- mB-) gal dcm DE3 (lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5) pLysSRARE (CamR) 質(zhì)粒 Plasmids pET28a E. coli expression vector, KmR 質(zhì)粒 Plasmids pET3Aa11 Vector pET28a carrying vip3Aa11 gene, KmR 1.2 引物 參考 GenBank 公布的已知 vip3Aa11 基因序列，設(shè)計全長引物 V3F/V3R。構(gòu)建單點突變體引物 3 對如表 2。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 1.3 供試?yán)ハx 供試?yán)ハx甜菜夜蛾 Spodoptera exigua（ Hbner） 及棉鈴蟲 初孵幼蟲及飼養(yǎng)生測飼料 均購自河南省濟源白云實業(yè)有限公司。 供試?yán)ハx在上海一恒科技有限公司生產(chǎn)的人工氣候箱里進(jìn)行飼養(yǎng)及生物活性測定。 1.4 酶與生化試劑 突變試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒 購自 Axygen 公司； DNA marker 購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司； Taq Mix 聚合酶和蛋白 Marker 均購自 TaKaRa 公司；抗生素購自納川生物技術(shù)公司；其 他 試劑均為市售國產(chǎn)或者進(jìn)口分析純或電泳級純化學(xué)試劑。 第 1 期 雒國興 等 ： 蘇云金芽胞桿菌 Vip3Aa11 蛋白 C 端點突變對其殺蟲活性的影響 81 表 2 PCR 鑒定引物及突變引物序列 Table 2 PCR primers used for identification and mutation 引物編號 Primer number 序列 Sequence 53 V3F ATGAACAAGA ATAATACTAA ATTAAGC V3R CTACTTAATA GAGACATCGT AAAAATGTAC vip3Aa11S543NF ATTGTAGAGAACGGGAACATAGAAGAGG vip3Aa11S543NR TTCCCGTTCTCTACAATATTGCTAATAAA vip3Aa11D547EF GTCCATAGAAGAGGAAAATTTAGAGCC vip3Aa11D547ER TTCCTCTTCTATGGACCCGTTCTCTA vip3Aa11T681VF CCAGAATTAATTAATGTAAATAATTGG vip3Aa11T681VR ACATTAATTAATTCTGGACTTAATAAC 1.5 PCR 克隆突變體 以 攜帶 vip3Aa11 基因的 pET28a 載體的 Vip3Aa11 質(zhì)粒為模板，利用 Fast Alteration DNA Polymerase進(jìn)行 PCR 擴增，獲得的帶有缺口的突變質(zhì)粒再用 Dpn1 消化掉甲基化的模板質(zhì)粒，獲得擴增得到的突變質(zhì)粒，最后轉(zhuǎn)入受體菌后突變質(zhì)粒的缺口得以修復(fù)，從而進(jìn)行復(fù)制。 1.6 序列測定及分析 將陽性克隆送往吉林省庫美生物科 技有限公司進(jìn)行全長測序， DNAMAN 軟件分析測序結(jié)果正確后，對正確重組轉(zhuǎn)化子進(jìn)行誘導(dǎo)及蛋白的表達(dá)。 1.7 vip3Aa11 及 突變體基因在大腸桿菌中表達(dá) 篩選出的陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21（ DE3） 中進(jìn)行 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，收集誘導(dǎo)物，離心，棄上清，用 20 mmol/L TrisHCl（ pH 8.0） 緩沖液懸浮細(xì)胞并進(jìn)行超聲波破碎，取樣，進(jìn)行 SDSPAGE 分析。大腸桿菌質(zhì)粒 DNA 提取、酶切、連接、轉(zhuǎn)化， SDSPAGE 電泳檢測方法參照文獻(xiàn) 15。 1.8 生物活性測定 室內(nèi)殺蟲活性測定 ， 稱取 30 g 人工飼料于培養(yǎng)皿中，與 3 mL 蛋白樣品混合均勻，均勻的分裝 24 孔板中，選取健康的、未經(jīng)取食的初孵幼蟲（孵化后 12 h 內(nèi)）作供試蟲，用軟毛筆輕輕地將它們移入已有感染飼料的小孔內(nèi)，每孔 1 頭蟲，每個處理重復(fù) 3 次，鋪上濕潤衛(wèi)生紙后蓋上塑料蓋，用橡皮筋捆緊，豎立放入 30 （棉鈴蟲）或 25 （甜菜夜蛾）生化培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 7 d 后調(diào)查活蟲數(shù)。 初篩飼料混合蛋白質(zhì)濃度：甜菜夜蛾 20 g/mL 和棉鈴蟲 40 g/mL； LC50測定選用 6 個濃度梯度，至少 4 個濃度試蟲死亡率小于100%。 光周期 14L:10D， 相對 濕度 65%。培養(yǎng) 7 d 后分別調(diào)查死、活蟲數(shù)，計算死亡率，以及利用 SPSS 24軟件分析 殺蟲 蛋白的致死中濃度（ LC50） ，生物活性測試試驗重復(fù) 3 次測試 。 1.9 Vip3Aa11 及 突變體蛋白對胰蛋白酶的敏感性分析 用 20 mmol/L 的 PBS（ pH 8）替代 20 mmol/L TrisHCl 重提蛋白。每個蛋白與 0.1 mg/mL 的胰蛋白酶按質(zhì)量比 10:1（蛋白質(zhì) :胰蛋白酶）混勻， 37 水浴中孵育 30 min；孵育后每個反應(yīng)體系加入相應(yīng)體積的3 上樣緩沖液終止反應(yīng)；用 8%分離膠分離蛋白樣，以不經(jīng)胰蛋白酶消化的 Vip3Aa11 蛋白樣品做為對照，以上消化反應(yīng)重復(fù) 3 次。 2 結(jié)果與分析 2.1 突變基因的鑒定與蛋白表達(dá) 以連有 pET28a 載體的 Vip3Aa11 質(zhì) 粒 為 模 板 ， 利 用 突 變 引 物 vip3Aa11S543NF 和vip3Aa11S543NR，通過 PCR 擴增，將 Vip3Aa11 蛋白氨基酸序列中 543 位點的絲氨酸（ Ser）突變?yōu)樘於０罚?Asn）；同樣利用突變引物 vip3Aa11D547EF 和 vip3Aa11D547ER，通過 PCR 擴增，將 Vip3Aa11蛋白氨基酸序列中 547 位點的天冬氨酸（ Asp）突 變?yōu)楣劝彼幔?Glu）；利用突變引物 vip3Aa11T681VF和 vip3Aa11T681VR，通過 PCR 擴增，將 Vip3Aa11 蛋白氨基酸序列中 681 位點的蘇氨酸（ Thr）突變?yōu)槔i氨酸（ Val）。將擴增獲得的突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體菌，利用全長引物 V3F 和 V3R 進(jìn)行 PCR 突變基因的 82 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報 第 34 卷 鑒定， DNA 核酸電泳檢測結(jié)果如圖 1 所示。 鑒定結(jié)果顯示 3 個突變體均可以檢測到 2370 bp 的目的條帶，說明陽性克隆子中含有 vip3Aa11 基因或其突變基因。利用 DNAMAN 對測序結(jié)果與原序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示已經(jīng)成功構(gòu)建了連 有載體的突變基因 ， 并將突變體分別命名為 S543N、 D547E 和 T681V。 突變體轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21（ DE3） 感受態(tài)細(xì)胞后，進(jìn)行 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，以 SDSPAGE 檢測可溶性蛋白 （圖 2） 。結(jié)果表明 Vip3Aa11 與 3 個突變體蛋白均只在大腸桿菌中正常表達(dá)分子量約為 88 kD 的可溶蛋白。 5 0 0 0b p3 0 0 02 0 0 01 0 0 07 5 05 0 02 5 01 0 01 M C K M C K 2 3 4BAM： DNA marker； 1： vip3Aa11； 2： S543N； 3： D547E； 4： T681V；CK： 陰性對照 Negative control 圖 1 vip3Aa11（ A） 和突變基因 （ B） 的 PCR 鑒定圖譜 Fig. 1 Identification results of vip3Aa11 (A) and mutation genes (B) by PCR 8 8 k D2 0 0k D1 1 69 7 . 26 6 . 42 9M 1 C K 2 3 4M： Protein marker； CK： pET28a-BL21； 1： Vip3Aa11； 2： S543N； 3：D547E； 4： T681V 圖 2 vip3Aa11 和突變體基因在 BL21（ DE3） 中表達(dá) Fig. 2 Expression of vip3Aa11 and mutant genes in the BL21 (DE3) 2.2 生物活性分析 利用棉鈴蟲和甜菜夜蛾 2 齡幼蟲對 Vip3Aa11 和突變體蛋白進(jìn)行初篩生物活性測定，其校正死亡率如表 3。 Vip3Aa11 蛋白對甜菜夜蛾具有高的殺蟲活性，而相比于 Vip3Aa11 蛋白突變體蛋白 S543N 對甜菜夜蛾的殺蟲活性有顯著的提高， D547E 蛋白活性有所降低，活性降低 57.7%， T681V 蛋白的殺蟲活性沒有改變。 3 個突變體蛋白對棉鈴蟲的殺蟲活性與 Vip3Aa11 蛋白相比沒有顯著的變化 （ 表 3） 。 進(jìn)一步配制 5、 10、 15、 23.5、 30、 40 g/mL的 Vip3Aa11 蛋白液；配制 1.35、 2.5、 5、 10 和 20 g/mL的 S543N 蛋白液；對 Vip3Aa11 蛋白和突變體蛋白 S543N 進(jìn)行甜菜夜蛾的致死中濃度 LC50 的測定。Vip3Aa11 蛋白對甜菜夜蛾具有高的殺蟲活性，其 LC50為 18.399 g/mL，而突變體蛋白 S543N 的 LC50為 3.614 g/mL，其 LC50 降低了 5 倍，說明突變體蛋白 S543N 對甜菜夜蛾的殺蟲活性有了顯著的提高（ 表 4） 。 表 3 Vip3Aa11 和突變體蛋白對甜菜夜蛾和棉 鈴蟲的生物活性 （ 7 d） Table 3 Bioassay results of Vip3Aa11 and mutant proteins against H. armigera and S. exigua (7 d) 蛋白 Protein 校正死亡率 Corrected mortality rate (%) 甜菜夜蛾 S. exigua (20 g/mL) 棉鈴蟲 H. armigera (40 g/mL) Vip3Aa11 74.25 38.55 S543N 100* 37.12 D547E 31.41* 35.69 T681V 74.25 37.12 注： *表示數(shù)值與 Vip3Aa11 原蛋白之間有顯著差異， P 0.05。下同。 Note: * there is significant differences between the mutant proteins and Vip3Aa11 protein, P 0.05. The same below. 第 1 期 雒國興 等 ： 蘇云金芽胞桿菌 Vip3Aa11 蛋白 C 端點突變對其殺蟲活性的影響 83 表 4 Vip3Aa11 和突變體蛋白對甜菜夜蛾的致死中濃度 Table 4 Further bioassay results (at 7 d) of Vip3Aa11 and S543N protoxin against S. exigua 蛋白樣品 Samples LC50 (g/mL) 95%置信限 Confidence limits Vip3Aa11 18.399 14.7 22.1 S543N 3.614* 2.123 4.974 2.3 Vip3Aa11 及 突變體蛋白對胰蛋白酶的敏感性分析 將經(jīng)超聲波破碎處理后的 S543N、 3D547E、 4T681V和 Vip3Aa11 蛋白樣品與 0.1 mg/mL 的 胰蛋白酶 按質(zhì)量比 10:1（蛋白質(zhì) :胰蛋白酶）的比例反應(yīng)，并對原毒素和消化產(chǎn)物進(jìn)行 SDSPAGE 電泳檢測 （ 圖3） 。 SDSPAGE 結(jié)果顯示， Vip3Aa11 和突變體蛋白經(jīng)胰蛋白酶消化后均可形成大小約 62 kD 的抗性多肽。 8 8 k D6 2 k D2 0 0k D1 1 69 7 . 26 6 . 44 4 . 3M 1 2 M 3 4 M 5 6 M 7 8M： Protein marker； 1： Vip3Aa11 protoxin； 2： Vip3Aa11 toxin； 3： S543N protoxin； 4： S543N toxin； 5： D547E protoxin； 6： D547E toxin； 7： T681V protoxin； 8： T681V toxin 圖 3 SDSPAGE分析 胰蛋白酶 消化 Vip3Aa11 和突變體蛋白結(jié)果 Fig. 3 SDSPAGE analysis of the trypsin digestion products of the Vip3Aa11 and mutant proteins 3 討論 Vip 殺蟲蛋白是由 Estruch 等 17從蘇云金芽胞桿菌 AB88 上清液中發(fā)現(xiàn)的，該類蛋白已被證明對多種鱗翅目害蟲具有殺蟲活性 18,19。而對于 Vip3A 蛋白的殺蟲機制的研究甚少。有 研究顯示， Vip3 的 N 端片段是高度保守的，而 C 末端具有可變性 20。雖然 Vip3A 類蛋白同源性很高，然而他們有不同的殺蟲譜。例如 Vip3Aa11 和 Vip3Aa39 僅有 39 個氨基酸的差異，然而其殺蟲活性存在很大差異 ， 用兩種蛋白的表達(dá)產(chǎn)物分別進(jìn)行了對小地老虎、小菜蛾、棉鈴蟲和甜菜夜蛾的殺蟲活性測定，結(jié)果表明 Vip3Aa39 對小地老虎有較高的殺蟲活性， LC50為 5.43 g/mL，而 Vip3Aa11 的 LC50為 73.62 g/mL； Vip3Aa39 對小菜蛾也具有一定的殺蟲活性， LC50為 140.64 g/mL，而 Vip3Aa11 對小菜蛾殺蟲活性幾乎沒有； Vip3Aa11 對棉鈴蟲具有一定的殺蟲活性， LC50為 35.18 g/mL，而 Vip3Aa39 的 LC50僅為 286.99 g/mL； Vip3Aa39 和 Vip3Aa11均對甜菜夜蛾具有相近的高毒力， LC50分別為 2.0 和 2.04 g/mL14。研究表明，在 Vip3Aa 蛋白的 C 端氨基酸突變顯著影響蛋白對不同鱗翅目害蟲的殺蟲活性 。 因此，隨機從 Vip3Aa11 羧基端挑選了 3 個不同的氨基酸殘基（ Ser543、 Asp547 和 Thr681），并利用定點突變技術(shù)， 將這些氨基酸分別突變?yōu)?Vip3Aa39 對應(yīng)位點上的氨基酸（ Asn543、 Glu547和 Val681）。最后通過觀察突變體殺蟲活性的變化，研究這些氨基酸的改變對其殺蟲活性的影響。 與 Vip3Aa11 蛋白相比，同一突變體蛋白對不同試蟲的毒力變化趨勢不盡相同。突變體 S543N 對甜菜夜蛾的殺蟲活性明顯增加，而對棉鈴蟲的毒性稍有降低。這表明， Vip3Aa11 對甜菜夜蛾和棉鈴蟲的殺蟲機理可能不同，同時也表明 Vip3Aa11 的第 543 位氨基酸可能是該蛋白對這試蟲產(chǎn)生殺蟲活性改變的關(guān)鍵位點。 Ser543Asn 543 的改變僅 將絲氨酸 CH2OH 側(cè)鏈變成了 CH2CONH2 側(cè)鏈，且絲氨酸和天冬酰胺均屬于極性不帶電的中性氨基酸。 然而這一改變卻導(dǎo)致其對甜菜夜蛾的毒殺能力顯著增強，說明該位點的84 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報 第 34 卷 絲氨酸（ Ser）的改變可能是導(dǎo)致活性發(fā)生變化的主要原因。 Dong 等 13研究表明 Vip3Aa7 蛋白活性區(qū)的半胱氨酸（ Cys） 被 絲氨酸（ Ser）取代 后 ， 會導(dǎo)致其對小菜蛾的毒性降低 。因此在研究 Vip3Aa 蛋白結(jié)構(gòu)和殺蟲機理中，絲氨酸可能起到至關(guān)重要的作用。而對于本研究中的 D547E 突變體蛋白對甜菜夜蛾的殺蟲活性降低現(xiàn)象也表明： Vip3Aa11 蛋白的第 547 位氨基酸可能也是該蛋白對甜菜夜蛾產(chǎn)生殺蟲活性的一個關(guān)鍵氨基 酸。而 T681V 蛋白對甜菜夜蛾的殺蟲活性與 Vip3Aa11 蛋白相比沒有改變 ， 說明該位點可能不是該蛋白對該試蟲產(chǎn)生活性關(guān)鍵位點。同 時 研究發(fā)現(xiàn) S543N、 D547E 和 T681V 3 種蛋白對棉鈴蟲的殺蟲活性與 Vip3Aa11 蛋白相比并沒有顯著的變化，說明這 3 個突變位點可能不參與 Vip3Aa11 蛋白對棉鈴蟲的殺蟲活性。 研 究表明， Vip3Aa經(jīng)不同的鱗翅目昆蟲中腸液處理主要產(chǎn)生 4種片段，大小分別為 22、 33、 45和 66 kD2 1。且 進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)， 62 kD 的片段是原毒素被消化后的主要產(chǎn)物，因而該片段被視為原毒素的活性形式 22,23。 此外另一項研究顯示，只有 62 kD 的片段可與棉鈴蟲的 BBMV 特異結(jié)合 25。本研究中 Vip3Aa11和突變體蛋白經(jīng)胰蛋白酶消化后均可被活化形成大小約 62 kD 的核心多肽（圖 3）。因此， 62 kD 片段的形 成可能是保證 Vip3Aa 蛋白殺蟲活性的必要條件。 蛋白質(zhì)的殺蟲活性受許多不同的因素影響，如蛋白質(zhì)的氨基酸序列 、 溫度 、 pH26以及不同昆蟲體內(nèi)微生物和酶的數(shù)量和多樣性等因素 27。 本研究中的 3 個 突變體蛋白在不同供試?yán)ハx中的殺蟲活性的不同說明Vip3Aa11 蛋白蛋白在甜菜夜蛾和棉鈴蟲中的作用方式以及受體可能不同， 且由于 Vip3Aa 蛋白結(jié)構(gòu)尚未解析，因此， 3 個突變體殺蟲活性改變的具體原因尚不清楚有待進(jìn)一步研究。本研究篩選獲得的對甜菜夜蛾具有高毒力的突變體 S543N，為進(jìn)一步研究 Vip3A 蛋白的殺蟲機理提供了一定理論基礎(chǔ)， 為構(gòu)建工程菌和轉(zhuǎn)基植物提供遺傳材料，同時也為對抗 Bt 產(chǎn)生耐性和抗性提供了菌株資源 。 參 考 文 獻(xiàn) 1 Fitt G P. 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