34(4)582-588 中國生物防治學(xué)報(bào) Chinese Journal of Biological Control 2018 年 8 月 收稿日期： 2018-01-26 基金項(xiàng)目：山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院特色農(nóng)業(yè)技術(shù)攻關(guān)（ YGG17067） ；山西省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（ 201601D202062） 作者簡介：陳哲，助理研究員， E-mail： yankunchen2015163.com； *通信作者，副研究員， E-mail： lh1964126.com。 DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2018.04.013 防治草莓炭疽病的芽胞桿菌組合的篩選 陳 哲， 黃 靜， 趙 佳， 梁 宏*（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，太原 030031） 摘要： 為開發(fā)防治草莓炭疽病的復(fù)合菌劑，比較了 5 株芽胞桿菌（菌株 CM3、 Y-48、 Lh-1、 Y-30 和 Y-9）在不同的組合方式和比例下對草莓炭疽菌 Colletotrichum thebromicoia 的抑制作用，篩選出抑菌效果的最佳的組合并通過盆栽防治試驗(yàn)測定其防治效果。 抑菌試驗(yàn)表明， 由巨大芽胞桿菌 Y-30 和解淀粉芽胞桿菌 CM3按照 2:1 配比而成的組合抑菌率達(dá)到 59.46%，比菌株 Y-48 的抑菌率高出 13.86%（單菌株中抑菌率最高的菌株，抑菌率為 52.22%） ，比單菌株 Y-30 和 CM3 分別提高 72.65%和 25.22% 。盆栽試驗(yàn)證實(shí)，復(fù)合菌處理對于草莓炭疽病的防治效果為 68.69%，比化學(xué)藥劑的防治效果提高了 23.63%；同時(shí)，復(fù)合菌處理還有效的促進(jìn)了草莓的生長，草莓株高、葉片面積、根鮮重以及莖葉鮮重都有顯著提高。本試驗(yàn)為復(fù)合菌劑應(yīng)用于草莓炭疽病的生物防治提供了依據(jù)。 關(guān) 鍵 詞： 芽胞桿菌；草莓炭疽菌；菌株組合；抑菌效果；生物防治 中圖分類號： S476 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 1005-9261(2018)04-0582-07 Screening of the Combinations of Bacillus Strains against Strawberry Anthracnose CHEN Zhe, HUANG Jing, ZHAO Jia, LIANG Hong*(Biotechnology Research Center, Shanxi Academy of Agriculture Science, Taiyuan 030031, China) Abstract: To develop complex microbial agents against strawberry anthracnose, we compared the inhibitory effects of five Bacillus strains (strain CM3, Y-48, Lh-1, Y-30 and Y-9) on Colletotrichum thebromicoia with different combinations and proportions and identified the best combination. By using the pot culture experiment, we measured their control effects. Bacteriostasis experiment showed that the combination which was composed of Bacillus megaterium Y-30 and Bacillus amyloliquefaciens CM3 with the ratio of 2:1 had the highest inhibition rate of 59.46%, 13.86% higher than that of single strain Y-48 with the highest inhibition rate of 52.22% among the single strains, 72.65% higher than that of single strain Y-30 and 25.22% higher than that of single CM3, respectively. Pot experiments demonstrated that the control efficacy of this combination on strawberry anthracnose was 68.69%, 23.63% higher than that of chemical agents. Furthermore, this combination effectively promoted the growth of strawberry. The strawberry height, leaf area, fresh weight of root and stem were increased significantly. Taken together, this study provided an experimental basis for the application of complex microbial agent to the biological control of strawberry anthracnose. Key words: Bacillus; Colletotrichum thebromicoia; strain combination; bacteriostasis effect; biological control 草莓作為一種深受大家喜愛的水果，種植面積越來越大，種植年限也越來越長，這使得種植環(huán)境中炭疽病菌數(shù)量逐漸增多1,2。目前，草莓炭疽病已經(jīng)成為草莓苗期的主要病害，是設(shè)施草莓移栽后成活率低的主要原因之一，給草莓生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重障礙3-5。炭疽病的病原菌為炭疽菌屬 Colletotrichum spp.的多種真第 4 期 陳哲等：防治草莓炭疽病的芽胞桿菌組合的篩選 583 菌，目前主要是膠孢炭疽菌 . gloeosporioides 復(fù)合種和尖孢炭疽菌 . nymphaeae，前者包含了膠孢炭疽菌 . fructicola 和草莓炭疽菌 C. thebromicoia，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)還有一些其他種的炭疽菌也能引起草莓炭疽病1。不僅如此，炭疽菌屬的病原菌可以侵染多種植株6-9，包括蘋果、梨、棗、柑橘和虎耳草等，同樣也會(huì)給這些作物的生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。在生產(chǎn)中針對炭疽病的防治方式多種多樣10,11，越來越多的種植者采用以生物防治為主的方法，從而減少對于化學(xué)藥劑的依賴，而且依靠生物手段在防病的同時(shí)還能達(dá)到提高作物品質(zhì)和產(chǎn)量的目的12。但是在試驗(yàn)中篩選出的單一生防菌株在田間防治效果往往不夠理想也不夠穩(wěn)定，無法滿足生物防治的實(shí)際要求，所以生防菌劑由單一菌株向復(fù)合菌株的轉(zhuǎn)變勢在必行13-17。 本文有針對性的選擇了 5 株芽胞桿菌進(jìn)行組合篩選，包括解淀粉芽胞桿菌 Bacillus amyloliquefaciens（ CM3、 Y-48 和 Lh-1）、巨大芽胞桿菌 Bacillus megaterium Y-30 和枯草芽胞桿菌 Bacillus subtilis Y-9。其中菌株 CM3 不僅能有效的防治草莓根腐病，還有促進(jìn)草莓生長的作用，同時(shí)此菌株對多種土傳病害（主要是草莓和瓜類病害）以及草莓灰霉病菌有較好的抑制作用18,19；而菌株 CM3、 Y-48 和 Y-30 都對番茄灰霉病有著良好的防治效果20；而菌株 Lh-1 對西瓜枯萎病有一定的防治效果21；菌株 Y-9 是 1 株具有較強(qiáng)抑菌能力的枯草芽胞桿菌。本研究將 5 種拮抗菌株進(jìn)行組合，通過抑菌試驗(yàn)篩選出優(yōu)于單菌株抑制效果的菌株組合，最后通過盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證篩選到的組合，以期獲得防治效果良好的菌株組合，對復(fù)合微生物制劑的實(shí)踐應(yīng)用起到指導(dǎo)作用。 1 材料與方法 1.1 菌株 供試菌株解淀粉芽胞桿菌 B. amyloliquefaciens（ CM3、 Y-48 和 Lh-1）、 B. megaterium Y-30 和枯草芽胞桿菌 B. subtilis Y-9 由山西農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究中心微生物課題組分離鑒定。供試真菌草莓炭疽菌 C. thebromicoia TAN-9 是中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院張國珍老師贈(zèng)送。 1.2 培養(yǎng)基 PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 15 20 g，蒸餾水 1000 mL，自然 pH； LB 液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g， NaCl 10 g，蒸餾水 1000 mL， pH 7.0。 1.3 菌株間親和性的檢測 菌株在 PDA 平板上生長 36 h 后， 分別接種到 50 mL 的 LB 培養(yǎng)基中， 28 、 150 r/min 振蕩培養(yǎng) 72 h，菌液濃度達(dá)到 1 109cfu/mL，取 1 mL 單菌株菌液（平板菌株）稀釋至 1 108cfu/mL，涂布于平板。將滅菌的濾紙片（ d 5 mm）浸入測試菌株的菌液中（ 1 109cfu/mL），浸泡 30 s，放置到涂有菌液的平板上，在 28 培養(yǎng) 48 h，測量各菌株的拮抗圈大小，所有菌株均會(huì)用作平板菌株和測試菌株，交叉測試。每個(gè)處理重復(fù) 3 次。 1.4 菌株抑菌效果的檢測 1.4.1 菌株發(fā)酵液的準(zhǔn)備 單個(gè)菌株在 PDA平板上生長 24 h后， 分別接種到 50 mL的 LB培養(yǎng)基中， 28 、150 r/min 振蕩培養(yǎng) 72 84 h，當(dāng)菌液濃度達(dá)到 1 109cfu/mL 時(shí)，收集菌液。然后，用 0.22 m 的一次性過濾器過濾菌液，得到菌株的發(fā)酵液備用。 1.4.2 抑菌效果的檢測方法 采用牛津杯法測定菌株發(fā)酵液對草莓炭疽菌的抑制效果， 在 PDA 平板中央放置供試真菌菌餅（ d 8 mm），在平皿對角線上距中心 3 cm 處放置 4 個(gè)牛津杯。取過濾后的 200 L發(fā)酵液加入牛津杯。以空白培養(yǎng)基作為對照，每個(gè)處理重復(fù) 3 次。待對照菌落長滿后，測定病原菌菌落直徑，計(jì)算抑制率。抑制率（ %）（對照組菌落直徑處理組菌落直徑） /（對照組菌落直徑原菌餅直徑） 100。 1.4.3 菌株發(fā)酵液兩兩組合的抑菌效果 進(jìn)行配比的菌株 CM3、 Y-48、 Lh-1、 Y-30 和 Y-9 按照 1.4.1 的方法獲得發(fā)酵液。試驗(yàn)設(shè)置 30 個(gè)組合， 5 個(gè)菌株的發(fā)酵液按照體積比 1:1（組合 1-10）、 2:1（組合 11-20）和 1:2（組合 21-30）兩兩組合，進(jìn)行抑菌效果的檢測；選擇單菌株的發(fā)酵液和空白培養(yǎng)基作為對照。檢測方法為牛津杯法，方法同 1.4.2。 1.4.4 菌株混合培養(yǎng)的抑菌效果22將菌株 CM3、 Y-48、 Lh-1、 Y-30 和 Y-9 分別在 PDA 平板上生長 24 h 584 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 34 卷 后，接種到 30 mL 的 LB 培養(yǎng)基中， 28 、 150 r/min 振蕩培養(yǎng) 24 36 h，調(diào)整菌液濃度為 1 105cfu/mL。調(diào)整好的菌液按照體積 1:1 的比例進(jìn)行混合（組合 31-40），混合后的菌液以 1%的接種量接種于 LB 培養(yǎng)基中，于 28 、 150 r/min 振蕩培養(yǎng) 36 48 h，當(dāng)混合菌液濃度達(dá)到 1 109cfu/mL 時(shí)，收集菌液，收集方法同 1.4.1。同樣，選擇單菌株的發(fā)酵液和空白培養(yǎng)基作為對照。檢測方法為牛津杯法，方法同 1.4.2。 1.5 測定組合菌株對于草莓炭疽病的防治促生效果 將健康的、生長狀態(tài)一致的 2 葉 1 心的健康草莓幼苗移植到滅菌基質(zhì)中，移栽前對基質(zhì)進(jìn)行相應(yīng)的菌劑或者農(nóng)藥處理， 10 d 后對草莓進(jìn)行傷根處理，同時(shí)澆灌草莓炭疽菌 TAN-9 的孢子懸浮稀釋液（濃度達(dá)到 1 106cfu/mL）。此后，結(jié)合草莓生長狀態(tài)和基質(zhì)干濕情況，在接種病原菌后每隔 5 7 d 進(jìn)行補(bǔ)施菌劑或者化學(xué)藥劑，補(bǔ)施 3 次即可。 試驗(yàn)設(shè)置 6 個(gè)處理： 1）菌株 Y-30； 2）菌株 CM3； 3）復(fù)合菌劑（ Y-30:CM3 2:1）； 4） 50%福美雙可濕性粉劑； 5）病原菌對照； 6）無菌水對照。每處理種 30 株草莓苗，重復(fù) 3 次，常規(guī)管理，接種 50 d后觀察草莓苗發(fā)病情況，同時(shí)測定草莓的株高、葉片面積、根鮮重和莖葉鮮重23。 草莓炭疽病病情分級標(biāo)準(zhǔn)，參照王豐等24、陳娟等25和卞靜等26的標(biāo)準(zhǔn)以及趙玳琳等27,28的試驗(yàn)結(jié)果略加改良。 0 級：全株無病。 1 級：全株 1/5 以下的葉片（柄）發(fā)病；葉片邊緣有針尖大小的褐點(diǎn)，或葉片出現(xiàn)褐色病斑，病斑面積占葉面積 5%以下；葉柄病部出現(xiàn)淺紅色和褪色暈圈，或紅褐色斑點(diǎn)，病斑長度 2.0 mm； 2 級：全株 1/5 2/5 的葉片（柄）發(fā)?。蝗~片出現(xiàn)近圓形或紡錘形灰褐色病斑，病斑面積占葉面積 5% 10%；葉柄病斑擴(kuò)大呈梭形，黑褐色凹陷，病斑長度在 2.1 5.0 mm；或者莖、葉柄均發(fā)生病斑。3 級：全株 2/5 3/5 的葉片（柄）發(fā)病，病斑中央出現(xiàn)黑色壞死斑，或葉片局部病斑連片，病斑面積占葉面積 10% 25%；葉柄上出現(xiàn)典型的紡錘形病斑，病斑長度在 5.1 10 mm，未環(huán)繞；少量（半數(shù)以下）葉片萎蔫，但植株整體未萎蔫。 4 級：全株 3/5 4/5 以上的葉片（柄）發(fā)??；葉片出現(xiàn)典型病斑，黑色壞死斑擴(kuò)大，或葉緣枯死，病斑面積占葉面積 25% 50%；葉柄病部變黑、干縮，病斑長度 10.1 20.0 mm，病斑超過葉柄周長的一半；或者全株半數(shù)以上的葉片萎蔫。 5 級：全株 4/5 以上的葉片（柄）發(fā)病；葉片的病斑面積占葉面積的 50%以上，或葉片枯死；葉柄的病斑平均長度 20.0 mm，或者整個(gè)葉柄壞死、萎蔫；植株全部萎蔫，或者全株枯死。病情指數(shù) （病害的級別該級別的植株數(shù)） /（病害的最高級別總株數(shù)） 100；防治效果（ %） (1處理病情指數(shù) /對照病情指數(shù) ) 100。 1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 所有數(shù)據(jù)均采用 SPSS 16.0 軟件中對所有數(shù)據(jù)通過鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。 2 結(jié)果與分析 2.1 菌株間的親和性 單菌株由于承擔(dān)角色（平板菌株和測試菌株）的不同，與同一菌株間的親和力會(huì)有不同的表現(xiàn)。當(dāng)菌株 Y-9 作為測試菌株，與其他菌株均為親和；作為平板菌株時(shí)，僅與菌株 Y-30 表現(xiàn)為親和。菌株 Y-30作為測試菌株，與菌株 Y-48 為弱親和；作為平板菌株時(shí)，僅與菌株 Y-9 親和，與其他菌株均為弱親和。菌株 Y-48 作為測試菌株，與菌株 Y-9、 Y-30 的親和力較弱；而作為平板菌株時(shí)，與 Y-30 的親和力最弱。菌株 Lh-1 作為測試菌株時(shí)，僅與菌株 Y-48 親和，與其他菌株為弱親和；而作為平板菌株時(shí)，和其他菌株為親和。菌株 CM3 作為測試菌株時(shí)，與菌株 Y-9 和 Y-30 的親和力很弱；但是作為平板菌株時(shí)，則與 Lh-1表現(xiàn)為弱親和（表 1）。 對于每一個(gè)拮抗細(xì)菌來說，與不同的拮抗菌株混合或使用不同測試處理方式（作為試驗(yàn)菌株或挑戰(zhàn)菌株），其親和程度都可能會(huì)不一樣。在本試驗(yàn)中， 5 株菌株之間沒有出現(xiàn)不親和的現(xiàn)象，說明這 5 株菌株均有作為復(fù)合微生物制劑的潛能。 2.2 組合菌株的抑菌效果 對菌株 CM3、 Y-48、 Lh-1、 Y-30 和 Y-9 一共設(shè)置了 40 個(gè)組合進(jìn)行抑菌效果的分析發(fā)現(xiàn)，在所有單菌株中，菌株 Y-48 是對草莓炭疽菌 TAN-9 抑制率最高的菌株，受抑制的病原菌菌絲分布范圍較小，抑制率達(dá)到 52.22%（表 2）。 第 4 期 陳哲等：防治草莓炭疽病的芽胞桿菌組合的篩選 585 表 1 菌株親和力的測試結(jié)果 Table 1 The results of strains affinity 測試菌株 Tested strains 平板菌株 Strains coated on the plate Y-9 Y-30 Y-48 Lh-1 CM3 Y-9 Y-30 Y-48 Lh-1 CM3 * * * 注：表示強(qiáng)親和力，無抑菌帶；表示親和，抑菌帶寬度為 0.1 1.0 mm；表示弱親和力，抑菌帶寬度為 1.1 4.0 mm；表示不親和力，抑菌帶大于 4.0 mm。 *表示有橘色的色素帶形成 。 Note: indicated strong affinity, no bacteriostasis zone; indicated affinity, the width of bacteriostasis band is 0.1-1.0 mm; indicated weak affinity, the band width of bacteriostasis is 1.1-4.0 mm; indicated no affinity, bacteriostasis zone greater than 4.0 mm. *indicated forming orange bands. 通過比較分析 40 個(gè)菌株的組合，發(fā)現(xiàn)抑菌能力最強(qiáng)的是由菌株 Y-30 和菌株 CM3 的發(fā)酵液按 2:1 的比例混合而成的組合， 抑菌率達(dá)到了 59.46%， 比單菌株 Y-48 的抑菌率高出 13.86%， 比單菌株 Y-30 和 CM3分別高出了 72.65%和 25.22%。因此，菌株 Y-30 和菌株 CM3（發(fā)酵液按 2:1 比例組合）是進(jìn)行盆栽試驗(yàn)的最佳組合（表 2）。 2.3 組合菌株對草莓炭疽病的防治作用（盆栽試驗(yàn)） 根據(jù)菌株組合的抑菌試驗(yàn)結(jié)果，選擇抑菌效果最強(qiáng)的菌株 Y-30 和 CM3 的組合（發(fā)酵液按 2:1 的比例混合）進(jìn)行炭疽病的盆栽防治試驗(yàn)研究。接種病原菌 45 d 后，草莓葉柄開始有發(fā)病的跡象，在接種 50 d后癥狀明顯，病原菌處理組病情指數(shù)為 66.00，其余各處理的病情指數(shù)由高到低的順序?yàn)榫?Y-30菌株CM3 50%福美雙可濕性粉劑復(fù)合菌劑（ Y-30:CM3 2:1）。復(fù)合菌（ Y-30:CM3 2:1）處理組的病情指數(shù)為 20.67， 防治效果達(dá)到了 68.69%， 較化學(xué)藥劑組 （ 50%福美雙可濕性粉劑） 的防治效果提高了 23.63%；同時(shí)， 2 個(gè)單一菌株處理組的病情指數(shù)均高于化學(xué)藥劑和復(fù)合菌處理組，表明單菌株的防治作用確實(shí)有一定的局限性（表 3）。 此外，從草莓的生長指標(biāo)來看，復(fù)合菌還具有一定的促生長作用，明顯強(qiáng)于單菌株的作用。復(fù)合菌處理組的草莓株高為 25.29 cm，比病原菌處理提高了 26.45%；葉片面積為 62.26 cm2，提高了 37.90%；而根鮮重和莖葉鮮重則分別提高了 36.77%和 38.75%，促進(jìn)草莓植株生長的作用明顯。單一菌株處理組對草莓生長也有促進(jìn)作用， 而且菌株 Y-30 對于葉片面積、 根鮮重和莖葉鮮重的促進(jìn)作用要高于菌株 CM3 的作用。而化學(xué)藥劑在促進(jìn)生長方面無明顯作用，甚至各項(xiàng)指標(biāo)均低于無菌水對照處理，表明化學(xué)藥劑只在防治病菌侵染方面起作用（表 3）。 3 討論 本次試驗(yàn)涉及到了 5 株芽胞桿菌 CM3、 Y-48、 Lh-1、 Y-30 和 Y-9，通過 3 種配比比例（ 1:1、 2:1、1:2）和兩種配比方式（發(fā)酵液混合、共同培養(yǎng)）一共設(shè)計(jì)了 40 個(gè)組合，牛津杯試驗(yàn)證實(shí)抑制草莓炭疽菌能力最強(qiáng)的是菌株 Y-30 和菌株 CM3 按 2:1 的比例混合而成的組合， 抑制率達(dá)到了 59.46%， 比單菌株 Y-48的抑菌率高出 13.86%， 這 2 個(gè)菌株的發(fā)酵液混合之后產(chǎn)生了良好的協(xié)同效應(yīng)。 菌株 Y-30 是巨大芽胞桿菌，相比于其他幾類芽胞桿菌來說，應(yīng)用于生物防治的報(bào)道不多29，尤其是防治草莓炭疽病的相關(guān)報(bào)道尚未見到。李穎等30證實(shí)巨大芽胞桿菌 J-28 對馬鈴薯晚疫病病菌的抑菌率為 87.80%。本實(shí)驗(yàn)室之前也報(bào)道過菌株 Y-30 對番茄灰霉病有生物防治的作用，防治效果為 54.10%20。 在親和力試驗(yàn)中，這 5 株菌株兩兩組合間都沒有出現(xiàn)強(qiáng)烈的拮抗反應(yīng)，但是菌株 CM3 和 Y-48 在共同培養(yǎng)中卻表現(xiàn)出極為強(qiáng)烈的拮抗作用，沒有產(chǎn)生抑菌圈。這與吳穎等31的研究結(jié)果類似，當(dāng)多個(gè)菌株共同培養(yǎng)時(shí)存在一定的拮抗作用，需要通過調(diào)整菌種配比和接種順序來降低共同培養(yǎng)時(shí)各個(gè)菌株間的拮抗作用。所以，菌株同時(shí)接種混合培養(yǎng)這一方式并不適合用于本試驗(yàn)中復(fù)合微生物菌劑的制備；同時(shí)也說明親 586 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 34 卷 表 2 組合菌株的抑菌效果 Table 2 The bacteriostasis effect of combination strains 培養(yǎng)方式 Culture 組合 Combination 菌株 Strains 抑菌圈半徑 Radius of inhibition zone (cm) 抑制率 Inhibitory rate (%) CK - 0 0 Y-9 1.10 0.20 hijklm 36.60 0.06 nop 單株培養(yǎng) Pure culture of single strain -30 0.84 0.13 no 34.44 0.03 opq Y-48 1.34 0.05 bcdef 52.22 0.11 bcdef Lh-1 1.21 0.12 cdefghijkl 45.99 0.01 fghijk CM3 1.23 0.17 cdefghijkl 47.48 0.07 defghij 1:1 Y-9 Y-30 1.11 0.46 fghijkl 38.01 0.05 mnop 1:1 Y-9 Y-48 1.13 0.15 fghijkl 42.61 0.06 ijklmn 1:1 Y-9 Lh-1 1.04 0.08 jklmn 41.26 0.02 jklmn 混株培養(yǎng) Mixed culture of two strains 1:1 Y-9 CM3 1.22 0.09 cdefghijkl 47.33 0.04 defghij 1:1 Y-30 Y-48 1.27 0.11 cdefghi 50.24 0.07 cdefg :1 Y-30 Lh-1 1.33 0.08 bcdefg 51.42 0.13 bcdef :1 Y-30 CM3 1.35 0.09 bcdef 52.68 0.21 bcde 1:1 Y-48 Lh-1 1.42 0.02 abc 56.09 0.01 abc :1 Y-48 CM3 1.30 0.07 bcdefgh 51.06 0.19 bcdefg :1 Lh-1 CM3 1.31 0.10 bcdefgh 51.13 0.11 bcdefg 2:1 Y-9 Y-30 0.73 0.43 o 28.00 0.16 r :1 Y-9 Y-48 1.09 0.07 hijklm 41.4 0.03 jklmn :1 Y-9 Lh-1 0.88 0.07 mno 33.54 0.03 pqr 2:1 Y-9 CM3 1.39 0.14 abcd 53.04 0.05 bcd :1 Y-30 Y-48 1.02 0.12 klmn 38.70 0.04 lmnop :1 Y-30 Lh-1 1.13 0.09 efghijkl 43.10 0.03 hijklmn 2:1 Y-30 CM3 1.56 0.12 a 59.46 0.05 a :1 Y-48 Lh-1 1.50 0.08 ab 57.17 0.03 ab :1 Y-48 CM3 1.21 0.05 cdefghijkl 46.03 0.02 efghijk 2:1 Lh-1 CM3 1.33 0.09 bcdefg 50.64 0.03 cdefg 1:2 Y-9 Y-30 1.05 0.15 ijklmn 39.96 0.06 klmno :2 Y-9 Y-48 1.00 0.16 lmn 38.08 0.06 mnop :2 Y-9 Lh-1 0.77 0.07 o 29.26 0.03 qr 1:2 Y-9 CM3 1.27 0.07 cdefgh 48.45 0.03 defghi :2 Y-30 Y-48 1.09 0.07 hijklm 41.35 0.03 jklmn :2 Y-30 Lh-1 1.26 0.06 cdefghij 48.01 0.02 defghi 1:2 Y-30 CM3 1.24 0.09 cdefghijk 47.35 0.03 defghij :2 Y-48 Lh-1 1.14 0.07 efghijkl 43.41 0.03 hijklm :2 Y-48 CM3 1.17 0.06 defghijkl 44.73 0.02 ghijkl 1:2 Lh-1 CM3 1.05 0.09 ijklmn 39.95 0.03 klmno 1:1 Y-9 Y-30 0.74 0.10 o 28.08 0.04 r 1:1 Y-9 Y-48 1.11 0.02 ghijkl 42.22 0.01 ijklmn 1:1 Y-9 Lh-1 1.05 0.08 ijklmn 39.96 0.03 klmno 1:1 Y-9 CM3 1.03 0.12 klmn 39.07 0.05 lmnop 1:1 Y-30 Y-48 1.30 0.06 bcdefgh 49.55 0.02 defgh 1:1 Y-30 Lh-1 1.26 0.10 cdefghi 48.16 0.04 defghi 1:1 Y-30 CM3 1.30 0.11 bcdefgh 49.40 0.04 defgh 1:1 Y-48 Lh-1 1.36 0.11 abcde 51.76 0.04 bcdef 1:1 Y-48 CM3 0 0 1:1 Lh-1 CM3 1.27 0.09 cdefghi 48.23 0.04 defghi 注：表中數(shù)據(jù)為平均值標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同小寫字母表示處理間差異顯著（ Duncans test， P 0.05） 。 Note: Values in the table were means SD ; Different lowercase letters within the same column indicated significant differences at 0.05 level by Duncans test. 第 4 期 陳哲等：防治草莓炭疽病的芽胞桿菌組合的篩選 587 表 3 不同處理對草莓炭疽病的防治效果 Table 3 The control effect of strawberry anthracnose on different treatments 處理 Treatment 病情指數(shù) disease index 防治效果 Control fficiency (%)葉片面積 Plant height (cm2)植株株高 Plant height (cm)根鮮重 Root weight (g) 莖葉鮮重 Shoot weight (g) Y-30 36.00 0.02 b 45.45 57.63 13.94 a 23.54 3.62 a 46.41 2.99 b 68.96 2.87 b CM3 34.67 0.02 b 47.47 53.81 11.14 a 23.67 2.98 a 41.45 3.51 c 59.84 6.01 c Y-30:CM3 2:1 20.67 0.03 d 68.69 62.26 13.83 a 25.29 1.69 a 53.00 4.25 a 74.23 4.27 a 50%福美雙 thiram 29.33 0.01 c 55.56 40.37 6.21 b 17.84 1.13 b 35.57 3.11 d 47.36 3.52 e 炭疽菌 C. thebromicoia 66.00 0.02 a 36.33 6.75 b 16.32 2.06 b 28.27 3.87 e 30.17 3.42 f 無菌水 Control 45.15 2.46 bc 20.01 1.45 b 38.75 3.41 c 53.50 3.79 d 注：表中數(shù)據(jù)為平均值標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同小寫字母表示處理間差異顯著（ Duncans test， P 0.05） 。 Note: Values in the table were means SD ; Different lowercase letters within the same column indicated significant differences at 0.05 level by Duncans test. 和力平板試驗(yàn)并不能說明任何問題，需要和其他試驗(yàn)一起分析才能得出結(jié)論。 在組合的抑菌效果中，發(fā)現(xiàn) 2 個(gè)抑菌能力最強(qiáng)的單菌株 CM3 和 Y-48，無論以何種比例進(jìn)行配比，組合的抑菌率都沒有超過單菌株 Y-48 的抑菌率。這與李琪等22的試驗(yàn)結(jié)果一致，解磷效果較強(qiáng)的 2 個(gè)菌株HDFP1 和 HDBP5 按不同比例混合培養(yǎng)后，解磷效率比單培養(yǎng)菌株 HDBP5 時(shí)明顯降低。這說明菌株間組合后產(chǎn)生的效果往往是有較大差異，可能低于或高于單菌的效果，也可能沒有大的改變，這些都無法從理論中得出結(jié)論，需要做大量的試驗(yàn)才能證實(shí)。 在草莓盆栽試驗(yàn)中，菌株 Y-30 和菌株 CM3 的組合（發(fā)酵液按 2:1 的比例混合）能夠有效的防治草莓炭疽菌對草莓的感染，防治效果為 68.69%，比單菌株 CM3 和 Y-30 的防治效果提高了 44.70%和 51.13%，比化學(xué)藥劑組也提高了 23.63%，充分證實(shí)了這 2 個(gè)菌株具有協(xié)同增效的作用，具備了開發(fā)成生防菌劑的條件。 同時(shí)， 草莓植株生長指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果也證實(shí)了菌株 Y-30 和 CM3 的組合還能促進(jìn)植株生長， 草莓株高、葉片面積、根鮮重和莖葉鮮重分別提高了 26.45%、 37.90%、 36.77%和 38.75%。此外，觀察 2 個(gè)單菌株在防病促生試驗(yàn)中的作用，發(fā)現(xiàn)菌株 CM3 的防治效果比菌株 Y-30 略高，而單菌株 Y-30 的促生能力則略高于菌株 CM3，說明這 2 個(gè)菌株在生物防治中所發(fā)揮的作用各有側(cè)重，而且二者的配合使各自的作用相得益彰。這與多數(shù)已報(bào)道研究結(jié)果類似，復(fù)合微生物菌劑不僅可以防治病害的發(fā)生，也能促進(jìn)作物的生長；而有些復(fù)合菌劑在一定程度上甚至可以減少化肥的使用量32,33。 本研究在草莓移植之前已經(jīng)對栽培基質(zhì)進(jìn)行了菌劑處理，但在接種病原菌后仍然補(bǔ)施了 3 次菌劑，促使菌株 Y-30 和菌株 CM3 在草莓基質(zhì)中保持了一定的種群優(yōu)勢，更加有利于復(fù)合菌劑發(fā)揮防治效果。麻耀華等34在研究黃瓜枯萎病防治時(shí)也發(fā)現(xiàn)，復(fù)合菌劑如果在黃瓜苗期和花期追加施入，可以明顯提高根際土壤微生物數(shù)量、改善土壤中微生物的功能多樣性和種群多樣性，有利于減少黃瓜枯萎病的發(fā)生。所以，在田間使用微生物菌劑進(jìn)行病害防治時(shí)，需要根據(jù)不同作物的生長物候期，在接種后的合適時(shí)期進(jìn)行菌劑的強(qiáng)化補(bǔ)施，保證菌劑的種群優(yōu)勢，充分發(fā)揮防治作用，以彌補(bǔ)生物菌劑持續(xù)力不強(qiáng)的弱勢。 盡管盆栽試驗(yàn)中菌株 Y-30 和 CM3 的組合預(yù)防病害促進(jìn)生長效果良好， 但還需要進(jìn)行大量的實(shí)踐工作才能在田間生產(chǎn)中取得良好的效果，而單憑菌劑是無法滿足生產(chǎn)過程中的綜合需求，必須將微生物菌劑和其他成分配合使用，這是微生物菌劑發(fā)展的必然趨勢。因此，下一步的研究重點(diǎn)就是這 2 個(gè)菌株與無機(jī)養(yǎng)分、有機(jī)養(yǎng)分以及微量元素肥料有機(jī)結(jié)合成為一種復(fù)合微生物肥料35，不僅提供作物生長的全部營養(yǎng)，還能防治植物病害，同時(shí)也可以減少化肥的使用，改良土壤環(huán)境，進(jìn)而改善產(chǎn)品的品質(zhì)，增加作物的產(chǎn)量。 參 考 文 獻(xiàn) 1 張國珍 . 我國對草莓炭疽根腐病的重視程度亟待提高 J. 植物保護(hù) , 2015, 41(2): 234-236. 2 趙帆 , 趙密珍 , 王鈺 , 等 . 不同連作年限草莓根際細(xì)菌和真菌多樣性變化 J. 微生物學(xué)通報(bào) , 2017, 44(6): 1377-1386. 3 Hirayama Y, Asano S, Okayama K, et al. Weeds as the potential inoculum source of Colletotrichum fructicola, responsible for strawberry anthracnose in Nara, JapanJ. Journal of General Plant Pathology, 2018, 84: 12-19. 4 Gan P, Nakata N, Suzuki T, et al. Markers to differentiate species of anthracnose fungi identify Colletotrichum fructicola, as the predominant virulent 588 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 34 卷 species in strawberry plants in Chiba Prefecture of JapanJ. Journal of General Plant Pathology, 2017, 83(1): 14-22. 5 Karimi K, Ahari A B, Arzanlou M, et al. Application of the consolidated species concept to identify the causal agent of strawberry anthracnose in Iran and initial molecular dating of the Colletotrichum acutatum, species complexJ. European Journal of Plant Pathology, 2017, 147(2): 1-13. 6 楊友聯(lián) , 李樹江 , 劉作易 . 虎耳草炭疽病病原菌鑒定 J. 微生物學(xué)通報(bào) , 2017, 44(4): 818-824.