34(4)589-597               中國生物防治學(xué)報  Chinese Journal of Biological Control                    2018 年 8 月  收稿日期： 2018-01-02 基金項目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（ 201503110-03） ；國家重點(diǎn)研發(fā)計劃（ 2017YFD0200606）  作者簡介：朱菲瑩，女，碩士，助理研究員， E-mail： 35460346qq.com； *通信作者，博士，研究員， E-mail： liangzhihuainky163.com。 DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2018.04.014 不同施肥處理對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)                   及西瓜枯萎病發(fā)生的影響  朱菲瑩1，田 程1,3，張  屹1，肖姬玲1，魏 林2，梁志懷1*(1.湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，長沙  410125； 2. 湖南省植物保護(hù)研究所，長沙  410125； 3. 湖南大學(xué)研究生院隆平分院，長沙  410125) 摘要：研究不同肥料組合對西瓜枯萎病發(fā)生的影響，尋找與西瓜幼苗發(fā)病密切相關(guān)的菌群種類。設(shè)置3組不同土壤肥料組合，依次為對照組CK、T1、T2。利用Illumina Miseq高通量測序平臺對試驗組和對照組之間的土壤微生物群落組成在16S rDNA水平上進(jìn)行測序分析。通過對測序結(jié)果在OTU和種群相對豐度的計算和分析發(fā)現(xiàn)，CK組中平均共獲得28986條序列，T1組中平均共有30308條序列，T2組中平均共有29730個條序列；三組共有細(xì)菌OTU數(shù)量為860，占各組分平均總OTU數(shù)量的50%以上，其中芽胞桿菌屬Bacillus、腸球菌屬Enterococcus、乳球菌屬Lactococcus、梭菌屬Clostridium在T1組中相對豐度最高；而2種未知細(xì)菌unclassified_TM7-1(c)和unclassified_Ellin329(o)在T2組中的相對豐度值最高。西瓜枯萎病發(fā)病率情況為CK T1 T2，施用棉隆生物有機(jī)肥可以通過重建土壤生態(tài)環(huán)境，提高土壤細(xì)菌多樣性，從而對西瓜枯萎病有顯著的防治作用。 關(guān)  鍵  詞：西瓜；土壤微生物群落；生物有機(jī)肥；16S rDNA；枯萎病  中圖分類號： S476，S651    文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A    文章編號： 1005-9261(2018)04-0589-09 Effects of Different Fertilization Treatments on Soil Microbial Community Structure and the Occurrence of Watermelon Wilt ZHU Feiying1, TIAN Cheng1,3, ZHANG Yi1, XIAO Jiling1, WEI Lin2, LIANG Zhihuai1*(1. Hunan Agricultural Biotechnology Research Institute, Changsha 410125, China; 2. Institute of Plant Protection, Changsha 410125, China; 3. Graduate School of Hunan University, Longping Branch, Changsha 410125, China) Abstract: The objective of this study was to compare the effects of different fertilizer combinations on occurrence of fusarium wilt of watermelon and to excavate the closely related genus to the disease of watermelon seedlings. The composition of bacterial communities of soil samples fertilized by 3 different soil fertilizer combination groups, followed by the control group (CK), T1 and T2, were compared to that of bacterial communities by the Illumina Meseq platform targeting the V3-V4 regions of 16S rDNA. Through the sequencing results analysis in OTU and the relative abundance of the population, we have find 28986 tags in CK, 30308 tags in T1, and 29730 tags in T2, and there are 860 OTUs in common, which is more than 50% within average of each treatment. And in the genus top 10 bacteria population, the abundance of Bacillus, Enterococcus, Lactococcus, Clostridium in T1 was apparently higher than others, while the unclassified_TM7-1(c) and unclassified_Ellin329(o) were significantly high in T2. The incidence of watermelon Fusarium wilt is CK T1 T2. The application of Basamid+Bio-organic fertilizer can be used to rebuild the soil ecological environment and help to improve the soil bacterial diversity, which has a significant preventive effect on watermelon fasurium wilt.  Key words: watermelon; soil microbes; bio-organic fertilizer; 16S rDNA; Fusarium wilt 590             中  國  生  物  防  治  學(xué)  報    第 34 卷  西瓜為葫蘆科植物，是世界上重要的園藝作物之一。西瓜枯萎病的發(fā)生是造成西瓜產(chǎn)量降低和品質(zhì)下降的重要原因1。因此，研究通過施用生物有機(jī)肥，調(diào)節(jié)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，達(dá)到防治西瓜枯萎病的目的，不僅有利于增加瓜農(nóng)收入、還可以減少環(huán)境污染和維持農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，對發(fā)展西瓜生產(chǎn)具有重大的理論和生產(chǎn)意義。通過增加有機(jī)碳源可促進(jìn)土壤生物多樣性恢復(fù)，抑制病原菌種群數(shù)量的增長。大量研究表明不同類型外源有機(jī)物的投入對土壤微生物種群數(shù)量及其群落結(jié)構(gòu)調(diào)控的機(jī)制存在著顯著性差異25。施用生物有機(jī)肥不僅可以增進(jìn)土壤肥力，而且能改善作物根系微生態(tài)環(huán)境中的理化性狀，從而提高有益微生物活性及作物的抗病能力610。邵麗等11通過盆栽試驗研究了生物復(fù)混肥對土壤微生物功能多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)生物復(fù)混肥的施用比等能提高土壤微生物對碳源的利用率、微生物群落的豐富度。邵麗等12分析了不同施肥處理土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，表明豬糞化肥處理和秸稈化肥處理微生物群落代謝活性和數(shù)量顯著高于化肥和不施肥處理。以西瓜早佳 8424 為材料，通過 Illumina Miseq 平臺測序，差異比較生物有機(jī)肥對西瓜枯萎病發(fā)生及土壤微生物多樣性的影響。該研究旨在用不同的生物有機(jī)肥處理的土壤為材料，比較對照組、 T1、 T2 中特有或含量顯著升高的菌群種類的變化，分析土壤微生物的菌落變化以及對西瓜生長的變化，以期找到與西瓜枯萎病的相關(guān)群落結(jié)構(gòu)。  1  材料與方法  1.1  試驗區(qū)概況  試驗于 2016 2017 年在湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高橋科研基地大棚種植區(qū)進(jìn)行 （ 1125842E， 281149N） 。土壤質(zhì)地為砂壤土。  1.2  試驗設(shè)計  試驗在連作 3 年西瓜的大棚（ 30 m 6 m）內(nèi)進(jìn)行， T1（生物有機(jī)肥）即施加“馕播王”（總養(yǎng)分 N P2O5 K2O=8%，有效活菌數(shù) 0.2 億 /g，有機(jī)質(zhì) 20%）生物有機(jī)肥 280 kg/棚，撒施后立即旋耕。 T2（棉隆生物有機(jī)肥）棉隆 10 kg/棚，撒施后立即旋耕，保持土壤含水量在 40%左右，覆膜保氣提高地溫， 20 d后揭膜通風(fēng)，通風(fēng) 15 d 后施加“馕播王”生物有機(jī)肥 280 kg/棚，撒施后旋耕，以常規(guī)栽培基肥處理為 CK，每個處理為 1 個大棚， 3 次重復(fù)。各處理在西瓜苗移栽前完成。西瓜苗營養(yǎng)缽內(nèi)培育 30 35 d 后移栽，畦寬 3 m、長 30 m，瓜蔓對爬，株距 60 cm，密度 360 株 /667 m2。供試作物為西瓜，品種“早佳 8424”，由新疆農(nóng)人公司提供。供試肥料為“馕播王”生物有機(jī)肥，土壤消毒劑棉隆，均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。不同處理土壤 pH 平均值分別為： 4.88（ CK）； 4.77（ T1）； 4.99（ T2），均偏酸性。  1.3  田間病害調(diào)查  西瓜生育期內(nèi)調(diào)查統(tǒng)計枯萎病的發(fā)生情況，計算發(fā)病率。發(fā)病率（ %） =（發(fā)病株數(shù) /調(diào)查總株數(shù)） 100。  由表 1 可見，不同處理下，西瓜枯萎病發(fā)病率差異顯著，施用 T2 發(fā)病率最低，為 18%，施用 T1 發(fā)病植株次之，對照組發(fā)病率最高，為 93%。與 CK 相比， T1 處理的西瓜枯萎病發(fā)病率降低 39%，而 T2 處理組西瓜發(fā)病率降低 75%，說明不同施肥處理能夠抑制西瓜枯萎病的發(fā)生。  1.4  田間取樣  于 2016 年 5 月 26 日西瓜枯萎病發(fā)病初期，在試驗小區(qū)取樣。用土鉆在大棚按“ S”形隨機(jī)選擇采取15 20 cm 深的 5 處根際土壤樣品混為一個處理，共 9 個處理土樣裝密封袋低溫帶回實驗室。去除植物根  表 1  西瓜發(fā)病情況分析  Table 1  Disease incidence analysis of watermelon plants 處理  Treatments 總植株數(shù)  Total plant number 發(fā)病植株數(shù)  Disease plant number 發(fā)病率  disease rate (%) CK 89.33 1.15 82.67 1.53 93 0.27 a T1 89.33 6.11  48.00 14.00 54 0.15 b T2 88.00 2.00 15.67 9.29 18 0.11 c 注：以上數(shù)值均表示平均值標(biāo)準(zhǔn)差（ n=3）小寫英文字母代表 5%的差異顯著性，下同。  Note: Data were expressed as mean SD (n=3). Different lower-case letters showed significant difference at 0.05 level according to Duncans multiple range test at 0.05 level. The same as below. 第 4 期               朱菲瑩等：不同施肥處理對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及西瓜枯萎病發(fā)生的影響  591 系和石塊并過 2 mm 目篩，將采集的土壤樣品保存于無菌離心管中于- 80 冰箱用于 16S rDNA 測序分析，另外一部分樣品風(fēng)干后用于測定土壤理化性質(zhì)、 pH 值、電導(dǎo)率等。  1.4.1  土壤pH及土壤電導(dǎo)率測定方法  稱量 10 g 風(fēng)干土至于小燒杯（最好 50 mL），加入無二氧化碳水（或者 1 mmp KCl 溶液），用磁力攪拌器攪拌 1 min，靜置 30 min，用 pH 計插入讀數(shù)即可。  1.4.2  微生物群落組成和差異在16S rDNA水平上進(jìn)行測序分析  采用 OMEGA Soil DNA kit（ 200）試劑盒對土壤樣本總 DNA 進(jìn)行提取。對細(xì)菌 16S rDNA 基因 V3-V4 高變區(qū)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，引物序列為： 343F（ 5'-TACGGRAGGCAGCAG-3'）和 798R（ 5'-AGGGTATCTAATCCT-3'），采用 HiFi Hot Start Ready Mix 試劑盒，（反應(yīng)體系為： 2 HiFi Hot Start Ready Mix 15 L， P1 1 L， P2 1 L， DNA 50 ng， ddH2O 13 L，T: 30 L），擴(kuò)增反應(yīng)程序為： 94 預(yù)變性 5 mins； 30 個循環(huán)（ 94  30 s， 56  30 s， 72  30 s），72  7 min。并對 PCR 產(chǎn)物使用 2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。  1.5  數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 由 Illumina Miseq 測序所得原始數(shù)據(jù)，利用 Fast QC 軟件對原始雙端測序數(shù)據(jù)進(jìn)行去雜并拼接，然后對拼接后的 paired end 數(shù)據(jù)進(jìn)行精準(zhǔn)去雜。隨后進(jìn)行去嵌合體序列處理，最終得到較優(yōu)質(zhì)的序列，進(jìn)行下游分析。首先挑選 OTU 步驟，即對所有的優(yōu)質(zhì)序列使用 CD-HIT13方法以相似度進(jìn)行 OTU 分類，相似度為 97%相似度即對應(yīng)物種分類到屬的一個水平分類標(biāo)準(zhǔn)。隨后以 OTU 分類中豐度最大的序列為代表序列，在 Greengenes 數(shù)據(jù)庫14進(jìn)行比對后最終得到系統(tǒng)發(fā)育樹和 OTU 分類表格。最終執(zhí)行下游的 -和 -多樣性分析。利用 MOTHUR 軟件進(jìn)行微生物群落的 -多樣性分析，包括稀釋性曲線、 CHAO1 指數(shù)和 SHANNON 指數(shù)15-18。利用主成份分析技術(shù)（ Principal component analysis， PCA）對各處理進(jìn)行聚類分析19；利用冗余分析技術(shù)（ Redundancy analysis， RDA）對土壤樣品、微生物群落結(jié)構(gòu)和西瓜植株的病害進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析20。  2  結(jié)果與分析  2.1  不同處理對西瓜田土壤養(yǎng)分含量的影響 從表 2 可以看出，不同處理土壤中 pH 值，總氮，總磷，總鉀以及有機(jī)質(zhì)含量均無明顯差異。但是，增施微生物有機(jī)肥 , 促進(jìn)了西瓜根系對土壤養(yǎng)分的吸收 , 西瓜植株吸收磷、鉀總量增加。 T1 和 T2 的磷總量分別比 CK 增加 23.86%和  17.05%, 鉀總量分別比 CK 增加 4.27%和  3.52%， 有效磷總量分別比 CK 增加169.32%和 89.47%，速效鉀分別比 CK 增加 167.5%和 74.36%。  表 2  不同處理對西瓜田土壤養(yǎng)分含量的影響  Table 2  Effects of different treatment on soil nutrients of watermelon field 處理  Treatment pH 總氮 TN (g/kg) 總磷 TP (g/kg) 總鉀 TK (g/kg) 有機(jī)質(zhì) SOM(g/kg) 堿解氮 AN (g/kg) 有效磷 AP (g/kg) 速效鉀 AK (g/kg) CK 4.88 0.17 1.61 0.28 0.88 0.14 22.73 1.33 22.70 5.30 116.60 23.18 93.93 28.66 195.00 95.35 T1 4.77 0.37 1.64 0.43 1.09 0.15 23.70 2.39 23.60 5.99 107.50 31.71 252.97 70.91 362.50 63.79 T2 4.99 0.38 1.56 0.36 1.03 0.10 23.53 1.56 23.43 2.55 129.80 16.44 177.97 44.25 340.00 69.46 2.2  土壤樣品測序深度評估 參與測序的所有 9 個樣品的總序列數(shù)為 2685747 條，所有 9 個樣本序列中觀測到的總的 OTU 數(shù)目為19367 條。其中對照組 CK(6)有 27415 條序列， CK(11)有 30627 條序列， CK(16)有 28907 條序列， T1(5)有29928 條序列， T1(8)有 30671 條序列， T1(21)有 31285 條序列， T2(4)有 30171 條序列， T2(9)有 29902 條序列， T2(20)有 29118 條序列。所有 9 個樣本序列中鑒定到的總的 OTU 數(shù)目為 19367 個。覆蓋率常用來評估克隆文庫信息對環(huán)境微多樣性的代表性，本研究中各組文庫的覆蓋率均為 90%以上，表明所建的文庫可以真實體現(xiàn)所取樣本中的細(xì)菌多樣性。  2.3  土壤細(xì)菌群落 Alpha 多樣性 Alpha 多樣性用于分析樣品內(nèi)（ Within-community）的微生物群落多樣性21，通過單樣本的多樣性分  592             中  國  生  物  防  治  學(xué)  報    第 34 卷  析（ -多樣性）可以反映樣品內(nèi)的微生物群落的豐富度和多樣性。 Shannon 指數(shù)和 Simpson 指數(shù)是衡量群落多樣性的重要指標(biāo)，指數(shù)越大，表明群落的豐富度和多樣性越高。由表 3 可以看出，與 CK 相比， T1、T2 處理對土壤微生物豐度提高具有促進(jìn)作用。 不同處理后土壤細(xì)菌群落 Shannon 指數(shù)和 Simpson 指數(shù)無明顯差異，說明各組分土壤細(xì)菌群落多樣性差異不顯著。  表 3  不同處理土壤細(xì)菌群落豐富度和多樣性指數(shù)  Table 3  Diversity indices of rhizosphere soil bacterial commnities under different managements 處理  Treatments Shannon 指數(shù)  Shannon index Simpson 指數(shù)  Simpson index CK 8.72 1.97 a 0.97 0.037 a T1 7.80 1.13 a 0.97 0.031 a T2 8.61 1.16 a 0.99 0.017 a 2.4  土壤中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)分析 共有的 Top 10 優(yōu)勢菌門從高到低分別為變形菌門 Proteobacteria，厚壁菌門 Firmicutes，酸桿菌門Acidobacteria，放線菌門 Actinobacteria，芽單胞菌門 Gemmatimonadetes，綠彎菌門 Chloroflexi， TM7，擬桿菌門 Bacteroidetes， OD1， Other。其中變形菌門 Proteobacteria 在各組中占比均為最高， CK 中占比為40.84%， T1 中占比為 29.63%， T2 中占比為 33.67%；其次是厚壁菌門 Firmicutes 在各組所占比例， CK 為10.25%， T1 為 38.70%， T2 為 13.24%。  由圖 1 可見，在門水平上豐度在前 10 的優(yōu)勢物種中， CK 組中較高的為變形菌門 Proteobacteria，酸桿菌門 Acidobacteria， T1 在厚壁菌門 Firmicutes 上豐度相對最高， T2 在放線菌門 Actinobacteria，芽單胞菌門 Gemmatimonadetes，以及 TM7， OD1 等 4 種門上細(xì)菌群落上豐度均高于 CK 及 T1。  CK T1 T200.050.100.150.200.250.300.350.400.45圖 1  門水平上 TOP10 細(xì)菌的相對豐度  Fig. 1  Relative abundance of the top 10 bacteria at the level of Phylum 圖 2 可見，共有的 Top10 優(yōu)勢菌屬從高到低分別為：芽胞桿菌屬 Bacillus，腸球菌屬 Enterococcus，unclassified_Koribacteraceae(f) ， unclassified_Xanthomonadaceae(f) ， unclassified_TM7-1(c) ， unclassified_ Rhodospirillaceae(f)， 乳球菌屬 Lactococcus， unclassified_Ellin329(o)， 梭菌屬 Clostridium。 其中 unclassified_ Koribacteraceae(f)，  unclassified_Xanthomonadaceae(f)，  unclassified_Rhodospirillaceae(f)在 CK 組中相對豐度最高。而芽胞桿菌屬 Bacillus 在 T1 組中占比相對其他組分最高約為 13.21%，且乳球菌屬 Lactococcus，  TM7-1(C)，梭菌屬 Clostridium，  腸球菌屬 Enterococcus 在 T1 組相對豐度最高。且在 T2 組中unclassified_TM7-1(c)， unclassified_Ellin329(o)兩種細(xì)菌的相對豐度處于最高值。  第 4 期               朱菲瑩等：不同施肥處理對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及西瓜枯萎病發(fā)生的影響  593 OtherBacillusEnterococcusunclassified_Koribacteraceae(f)unclassified_Xanthomonadaceae(f)unclassified_TM7-1(c)unclassified_Rhodospirillaceae(f)Lactococcusunclassified_Ellin329(o)Clostridium00.050.100.150.200.250.30CK T1 T2圖 2  屬水平上 TOP10 細(xì)菌的相對豐度  Fig. 2  Relative abundance of the top 10 bacteria at the level of genus 2.5  不同組間土壤細(xì)菌群落 OTU 特異性分析 Venn 圖可以直觀地表現(xiàn)  3種處理（ CK、 T1、 T2）土壤微生物群落的 OTU 數(shù)目組成相似性，重疊情況以及特異性（圖 3）。 CK、 T1、 T2 三組之間存在共有細(xì)菌 OTU 數(shù)量為 860，占到各組分平均總 OTU數(shù)量的 50%以上，說明各組分優(yōu)勢菌基本組成相似。其中 CK 特有 142 個細(xì)菌 OTU， T1 特有 45 個細(xì)菌OTU， T2 特有 36 個細(xì)菌 OTU。  2.6  微生物群落與環(huán)境因子( pH，電導(dǎo)率)影響的關(guān)系 通過 RDA 分析可將菌群結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)與某種給定的影響因素互相擬合，并通過置換檢驗來判斷該因素對  66142 4586010116836T2T1CK圖 3  不同組間土壤微生物群落 OTU 維恩圖  Fig. 3  OTU Venn diagram of soil microbial communities in different groups 594             中  國  生  物  防  治  學(xué)  報    第 34 卷  于菌群結(jié)構(gòu)的影響是否顯著。分析每個點(diǎn)代表一個樣品，兩點(diǎn)之間的距離越接近，說明 2 個樣品的群落結(jié)構(gòu)相似度越高。彩色箭頭分別代表不同的影響因素，影響因素之間的夾角代表它們之間相關(guān)性的大小，銳角表示 2 個因素正相關(guān)，直角為不相關(guān)，鈍角時為負(fù)相關(guān)，射線越長，表明該因素對群落結(jié)構(gòu)的影響作用越大。將樣品、微生物群落與環(huán)境因子（ pH，電導(dǎo)率 EC1，發(fā)病率 MORBILIT）進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析， CK 組的3 個樣品在 pH 與 MORBILIT 上呈正相關(guān)， T2 組 3 個樣品在 pH 與 EC1 上為負(fù)相關(guān)。 pH 值對樣本影響的大小排序為： S16.1 S6.1 S11.1 S9.1 S20.1 S4.1 S8.1 S21.1 S5.1；電導(dǎo)率（ EC）對所有樣本影響的大小排序為： S5.1 S21.1 S8.1 S4.1 S9.1 S20.1 S11.1 S6.1 S16.1；發(fā)病率（ MORBILIT）：S16.1 S6.1 S11.1 S8.1 S5.1 S9.1 S4.1 S21.1 S20.1。  可見， CK 組微生物群結(jié)構(gòu)變化受 PH 值影響較大，而 T2 組受三者影響均等（圖 4）。  PH10.6-0.6-0.6 0.8s8.1s5.1EC1MORBILITs21.1s4.1s9.1s20.1s6.1s16.1 s11.1圖 4  RDA 分析圖  Fig. 4  Redundancy analysis diagram 3  討論  3.1  單施生物有機(jī)肥對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響  西瓜產(chǎn)業(yè)中西瓜枯萎病已成為導(dǎo)致產(chǎn)量、品質(zhì)下降最為嚴(yán)重的土傳病害，已引起了世界各國的廣泛重視。目前針對西瓜枯萎病菌的生防菌，主要有木霉屬真菌、叢枝菌根真菌、非致病尖孢鐮刀、芽胞桿菌和內(nèi)生真菌等。生防微生物不僅安全無毒，而且是用來防治枯萎病理想的方法。 土壤微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)和能量循環(huán)以及有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程中擔(dān)負(fù)維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定， 加快土壤生態(tài)系統(tǒng)中養(yǎng)分的循環(huán)和提高土壤對不良環(huán)境的抵御能力， 也是預(yù)防土傳病害的關(guān)鍵所在。生物有機(jī)肥的施用可增加土壤中微生物數(shù)量， 提高土壤中微生物的活性。 生物有機(jī)肥本身含多種有益菌群，對土壤中的土著微生物有一定的活化作用，并且生物有機(jī)肥基料多為有機(jī)物，豐富土壤中微生物可利用營養(yǎng)增加菌群數(shù)。多樣性高的土壤對病原菌具有較強(qiáng)的抑制作用，施用生物有機(jī)肥可提高土壤微生物活性，改善微生物結(jié)構(gòu)和功能，從而實現(xiàn)土壤微生物生態(tài)平衡，抑制病害發(fā)生。有機(jī)肥為微生物提供了較多的能源與養(yǎng)分，促進(jìn)土壤中多種微生物的大量繁殖21,22。楊元根等23研究發(fā)現(xiàn)，土壤微生物通過消耗有機(jī)質(zhì)來維持正常的生理活動，生理活動越強(qiáng)，消耗的有機(jī)質(zhì)越多。 Liu 等24用 Biolog 方法研究了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明有機(jī)肥處理的 Shannon 指數(shù)與碳源利用率均極顯著高于化肥處理。 Chen 等25通過大田試第 4 期               朱菲瑩等：不同施肥處理對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及西瓜枯萎病發(fā)生的影響  595 驗發(fā)現(xiàn)，接種微生物菌劑可顯著提高土壤豐富度指數(shù)，且改變土壤微生物功能多樣性。 Zhou 等26在溫室盆栽條件下研究連作黃瓜土壤中真菌群落多樣性的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)種群大小和土壤病態(tài)與黃瓜生長緊密相關(guān)。本試驗發(fā)現(xiàn)， T1 組厚壁菌門 Firmicutes 豐度相對最高；而在屬水平上，芽胞桿菌屬 Bacillus，乳球菌屬 Lactococcus TM7-1（ C） ，梭菌屬 Clostridium，  腸球菌屬 Enterococcus 在 T1 組相對豐度最高。說明這些菌屬可能對土壤中的土著微生物有一定的活化作用，通過改善微生物結(jié)構(gòu)和功能，從而抑制了植物病害的發(fā)生。  3.2  施用棉隆 生物有機(jī)肥對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響  棉隆是一種環(huán)保型廣譜性綜合土壤熏蒸消毒劑。施用棉隆對土壤消毒可大幅度的提高產(chǎn)量、減少地上部分的病蟲害、提高作物的品質(zhì)、無農(nóng)藥殘留問題、減少地上部分噴農(nóng)藥的次數(shù)。 2014 年，王媛等27試驗發(fā)現(xiàn)，施用棉隆后的土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌的數(shù)量均大幅度減少，而且棉隆施用的濃度越高，真菌、細(xì)菌和放線菌的數(shù)量減少的程度越大。隨著西瓜植株的生長，棉隆處理試驗田中真菌、細(xì)菌和放線菌的數(shù)量都會回升。 2016 年，張超等28在溫室大棚條件下研究發(fā)現(xiàn)棉隆劑量越高對辣椒疫霉病的防效越顯著，對微生物活性影響越大，高劑量處理能明顯抑制土壤微生物的活性，降低土壤微生物的多樣性。  本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)， T2 組（棉隆生物有機(jī)肥）的西瓜枯萎病發(fā)病率平均僅為 18%，遠(yuǎn)低 于 T1（ 54%），CK（ 93%）?？梢?，施用棉隆生物有機(jī)肥可以通過重建土壤生態(tài)環(huán)境，提高土壤細(xì)菌多樣性，從而對西瓜枯萎病有顯著的防治作用。  土壤微生物的數(shù)量和種類是影響植物生長發(fā)育的重要因子之一，土壤微生物的數(shù)量和種類與植物病害也有密切的關(guān)系29-32。 Philippot 等33研究表明土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性是反應(yīng)土壤健康狀態(tài)的重要指標(biāo)，土壤微生物群落是土壤生態(tài)系統(tǒng)持續(xù)發(fā)揮作用的重要媒介。土壤微生物群落的多樣性受土壤特性影響較大，不同的施肥制度對微生物產(chǎn)生的影響不同。了解各種施肥處理對土壤微生物群落特性的影響十分重要34。因此，本試驗進(jìn)一步通過 Illumina Miseq 平臺進(jìn)行測序，比較不同施肥處理后土壤微生物中細(xì)菌多樣性差異。 CK、 T1、 T2 三組之間存在共有細(xì)菌 OTU 數(shù)量為 860，占到各組分平均總 OTUs 數(shù)量的 50%以上，說明各組分優(yōu)勢菌基本組成相似。其中， Simpson 指數(shù)和  Shannon 指數(shù)說明施用 T2（棉隆生物有機(jī)肥）的土壤細(xì)菌多樣性最高。通過對各個樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析，在門水平上發(fā)現(xiàn)變形菌門 Proteobacteria 在各組分中占比均為最高， T2 在 TM7，芽單胞菌門 Gemmatimonadetes，以及 OD1中相對豐度較高。 而在屬水平上， unclassified_TM7-1（ c） ， unclassified_Ellin329（ o） ， 芽胞桿菌屬 Bacillus，腸球菌屬 Enterococcus 在 T2 組中相對豐度較高，其中 unclassified_TM7-1（ c） 最為顯著。通過 RDA 分析可將菌群結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)與環(huán)境因素互相擬合（ pH，電導(dǎo)率 EC1，發(fā)病率 MORBILIT），發(fā)現(xiàn) T2 組受三者影響均等， T2 組 3 個樣品在 pH 與 EC1 上為負(fù)相關(guān)。結(jié)果表明，不同組間微生物群落結(jié)構(gòu)的差異可能對西瓜枯萎病的發(fā)生起到主要調(diào)控作用。 T2 組中特有的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在數(shù)量增減和種類的差異，說明這些屬菌在西瓜植株健康中起重要作用，可能抑制西瓜枯萎病的發(fā)生。  本試驗研究結(jié)果表明，不同處理對照組（不施肥）、 T1（生物有機(jī)肥）、 T2（棉隆生物有機(jī)肥）三組土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著差異，說明土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異可能是調(diào)控西瓜枯萎病發(fā)生的主要因子之一。其中 T1 組對西瓜枯萎病的發(fā)生有一定的防治作用，從而驗證了生物有機(jī)肥由于本身含有益菌群，從而提高土壤微生物活性，改善微生物結(jié)構(gòu)和功能，實現(xiàn)土壤微生物生態(tài)平衡，達(dá)到抑制作物病害的效果。且 T2 組對西瓜枯萎病防治效果最好，可能是因為棉隆對合土壤熏蒸消毒的作用加上生物有機(jī)肥施用后對土壤生態(tài)系統(tǒng)的重建有利于西瓜植株的健康生長。通過以上研究，有利于我們更進(jìn)一步通過調(diào)節(jié)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，從而有效防治西瓜枯萎病。但是由于 16S rDNA 測序僅能開展在菌屬層面的分析，因此，我們需要通過宏基因組和轉(zhuǎn)錄組等分子生物學(xué)手段進(jìn)一步探索影響西瓜枯萎病發(fā)生的關(guān)鍵菌種及其功能基因，為克服西瓜連作障礙提供理論依據(jù)。  參  考  文  獻(xiàn)  1 Ling N, Deng K, Song Y, et al. Variation of rhizospHere bacterial community in watermelon continuous mono-cropping soil by long-term application of 596             中  國  生  物  防  治  學(xué)  報    第 34 卷  a novel bioorganic fertilizerJ. Microbiological Research, 2014, 169(7-8): 570. 2 馬利平 , 高芬 , 喬雄梧 . 家畜漚肥浸漬液對黃瓜枯萎病的防治及作用機(jī)理探析 J. 植物病理學(xué)報 , 1999, 29(3): 270-274. 3 蔡燕飛 , 廖宗文 , 章家恩 . 生態(tài)有機(jī)肥對番茄青枯病及土壤微生物多樣性的影響 J. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報 , 2003, 14(3): 349-353. 4 蔡燕飛 , 廖宗文 . FAME 法分析施肥對番茄青枯病抑制和土壤健康恢復(fù)的效果 J. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué) , 2003, 36(8): 922-927. 5 張樹生 , 楊興明 , 黃啟為 , 等 . 施用氨基酸肥料對連作條件下黃瓜的生物效應(yīng)及土壤生物性狀的影響 J. 土壤學(xué)報 , 2007, 44(4): 689-694. 6 朱林 , 彭宇 , 袁飛 , 等 . 幾種有機(jī)物對連作黃瓜生長的影響 J. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) , 2001, 29(2): 214-216. 7 徐福利 , 梁銀麗 , 張成娥 , 等 . 日光溫室土壤生物學(xué)特性與施肥的關(guān)系 J. 水土保持研究 , 2004, 11(1): 20-22. 8 呂衛(wèi)光 , 張春蘭 , 袁飛 . 有機(jī)肥減輕連作對黃瓜自毒作用的機(jī)制 J. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報 , 2002, 18(2): 52-56. 9 孫紅霞 , 武琴 , 鄭國祥 , 等 . 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