南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 2018,41(3):429-439 http:/nauxb.njau.edu.cnJ o u r n a l o f N a n j i n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y DOI:10.7685/jnau.201706045 收 稿 日 期 :2017-06-29 基 金 項(xiàng) 目 : 中 國(guó) 博 士 后 第 七 批 特 別 資 助 項(xiàng) 目(2014T70533); 江 蘇 省 農(nóng) 業(yè) 科 技 自 主 創(chuàng) 新 資 金 項(xiàng) 目CX(16)1013; 國(guó) 家 博 士 后 基 金 面 上 項(xiàng) 目 (2013M531373) 作 者 簡(jiǎn) 介 : 崔 夢(mèng) 杰, 碩 士 研 究 生。 * 通 信 作 者: 王 晨, 副 教 授, 研 究 方 向 為 葡 萄 遺 傳 育 種 與 基 因 組 學(xué),E-mail:wangchennjau.edu.cn。 崔 夢(mèng) 杰, 王 晨, 冷 翔 鵬, 等. 葡 萄SBP-box 轉(zhuǎn) 錄 因 子 家 族 的 生 物 信 息 學(xué) 分 析 及 其 應(yīng) 答 激 素 調(diào) 控 葡 萄 果 實(shí) 成 熟 的 作 用J. 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào), 2018,41(3):429-439. 葡 萄SBP-box 轉(zhuǎn) 錄 因 子 家 族 的 生 物 信 息 學(xué) 分 析 及 其 應(yīng) 答 激 素 調(diào) 控 葡 萄 果 實(shí) 成 熟 的 作 用 崔 夢(mèng) 杰 1 , 王 晨 1* , 冷 翔 鵬 1 , 吳 偉 民 2 , 湯 崴 1 , 張 文 穎 1 , 朱 旭 東 1 , 賈 海 鋒 1 , 沈 文 飚 3 , 房 經(jīng) 貴 1 (1. 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 園 藝 學(xué) 院, 江 蘇 南 京210095;2. 江 蘇 省 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 院, 江 蘇 南 京210014; 3. 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 生 命 科 學(xué) 學(xué) 院, 江 蘇 南 京210095) 摘 要 : 目 的 本 文 旨 在 分 析 已 知 葡 萄( V i t i s v i n i f e r aL.)SBP-box 家 族 基 因 基 本 信 息, 研 究 其 在 葡 萄 果 實(shí) 發(fā) 育 成 熟 過 程 中 的 調(diào) 控 作 用。 方 法 利 用 葡 萄 轉(zhuǎn) 錄 因 子PlantTF 數(shù) 據(jù) 庫(kù)(http:/planttfdb.cbi.pku.edu.cn/index.php?sp=Vvi) 查 詢 并 獲 得 S B P - b o x 基 因, 采 用ClustalX2、DNAMAN6、WebLogo3、MEGA4.1 和GeneStructureDisplayServer 等 軟 件 對(duì) 其 基 因 與 蛋 白 序 列 進(jìn) 行 生 物 信 息 學(xué) 分 析。 利 用Plantcare 軟 件 分 析 葡 萄 轉(zhuǎn) 錄 因 子SBP-box 家 族 成 員 的 啟 動(dòng) 子 元 件, 預(yù) 測(cè) 其 與 果 實(shí) 發(fā) 育 及 成 熟 過 程 相 關(guān) 的 潛 在 作 用。 采 用RT-qPCR 技 術(shù) 研 究 V v S B P 基 因 在 果 實(shí) 發(fā) 育 成 熟 過 程 中 的 作 用。 結(jié) 果 從 轉(zhuǎn) 錄 因 子 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 中 共 得 到19 個(gè) 葡 萄 S B P - b o x 基 因。 SBP-box 結(jié) 構(gòu) 域 分 析 顯 示, 多 達(dá)61 個(gè) 位 點(diǎn) 氨 基 酸 具 有 較 高 的 保 守 性。 進(jìn) 化 樹 分 析 結(jié) 果 顯 示, 葡 萄 S B P - b o x 基 因 共 分 為3 個(gè) 亞 組。 染 色 體 定 位 分 析 顯 示, V v S B P 基 因 在1 號(hào) 染 色 體 上 分 布 最 多(4 個(gè)), 其 次 是 染 色 體5、15、 4、7、8、10、11、12、14、17、18 和19, 染 色 體2、3、6、9、13 和16 則 沒 有 分 布。 啟 動(dòng) 子 作 用 元 件 分 析 表 明,SBP-box 家 族 所 有 成 員 的 啟 動(dòng) 子 均 含 有 與 果 實(shí) 發(fā) 育 和 成 熟 相 關(guān) 的 作 用 元 件。 結(jié) 合RT-qPCR 結(jié) 果, 發(fā) 現(xiàn) 約9 個(gè) 成 員 可 能 促 進(jìn) 了 葡 萄 果 實(shí) 的 成 熟 過 程, 且 大 部 分 成 員 屬 于 第1 亞 組 和 第3 亞 組; 約7 個(gè) 成 員 可 能 促 進(jìn) 了 葡 萄 果 實(shí) 的 生 長(zhǎng) 發(fā) 育, 但 抑 制 了 果 實(shí) 的 轉(zhuǎn) 色 與 成 熟 過 程, 且大部分 成員屬于第2 亞組。 結(jié) 論 葡 萄 S B P - b o x 基 因結(jié) 構(gòu) 高度保 守, 多數(shù) 成員 參 與調(diào) 控果 實(shí) 發(fā)育 與成 熟 過程。 關(guān) 鍵 詞 : 葡 萄;SBP-box; 轉(zhuǎn) 錄 因 子; 生 物 信 息 學(xué) 分 析; 表 達(dá) 分 析 中 圖 分 類 號(hào) :S663.1    文 獻(xiàn) 標(biāo) 志 碼 :A    文 章 編 號(hào) :1000-2030 (2018 )03-0429-11 BioinformaticanalysisoftheSBP-boxtranscriptionfactor andfunctionoftheirregulationmodesonberryripening processbyrespondingtohormones CUIMengjie 1 ,WANGChen 1* ,LENGXiangpeng 1 ,WUWeimin 2 ,TANGWei 1 ,ZHANGWenying 1 , ZHUXudong 1 ,JIAHaifeng 1 ,SHENWenbiao 3 ,FANGJinggui 1 (1.CollegeofHorticulture,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China; 2.JiangsuAcademyofAgriculturalSciences,Nanjing210014,China; 3.CollegeofLifeSciences,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China) Abstract:ObjectivesTheaimofthispaperistoanalyzethebasicinformationof S B P - b o xgenesofgrape( V i t i s v i n i f e r aL.),and studytheirregulationfunctiononberryripeningprocess.MethodsSBP-boxfamibygenesintranscriptionfactordatabasePlantTF (http:/planttfdb.cbi.pku.edu.cn/index.php?sp=Vvi)werequeriedandobtained,andtheaminoacidsequenceswereanalyzedwith ClustalX2,DNAMAN6,WebLogo3,MEGA4.1andGeneStructureDisplayServerbioinformaticssoftwares.Thepotentialfunction ofSBP-boxtranscriptionfactormembersingrapedevelopmentandmaturationprocesswaspredictedbyanalyzingtheirpromotermotif elements using the Plantcare software. And the regulation function on berry ripening process was studied by RT-qPCR. ResultsTotally19 S B P - b o xgeneswerefoundintranscriptionfactordatabase.Theresultsofdomainanalysisindicatedthat48 aminoacidsofgrapeSBP-boxdomainwerehighlyconserved(exceptfor V v S B P - l i k e 1and V v S B P - l i k e 2).Theresultsofphylogenetic treerevealedthatgrape S B P - b o xgenesweredividedinto3subclasses.Chromosomemappinganalysisshowedthatthelargestnumber ofgrape S B P - b o xgeneswerefoundonchromosome1(fourgenes),followedbychromosome5,15,4,7,8,10,11,12,14,17,18and 19,andno S B P - b o xgenesonchromosome2,3,6,9,13and16.AllSBP-boxmemberscontainedelementsrelatedtograpeberry 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 第41 卷 developmentandripening.RT-qPCRresultsindicatedthatninemembers,thefirstandsecondsubclass,probablypromoteberryripe- ningprocess,andnearlysevenmembers,thesecondsubclass,promotethegrowthanddevelopmentofgrapeberrybutinhibitthe berryripening process. Conclusions V v S B P genes are highly and structurally conserved and most members participated in regulatingberrydevelopmentandripeningprocess. Keywords:grape( V i t i s v i n i f e r aL.);SBP-box;transcriptionfactor;bioinformaticanalysis;expressionanalysis 葡 萄( V i t i s v i n i f e r aL.) 是 世 界 四 大 水 果 之 一, 其 栽 培 面 積 和 產(chǎn) 量 位 居 世 界 第 二 1 , 是 我 國(guó) 主 要 栽 培 果 樹。 葡 萄 果 實(shí) 發(fā) 育 與 成 熟 是 果 樹 生 長(zhǎng) 發(fā) 育 的 重 要 階 段, 是 果 實(shí) 品 質(zhì) 形 成 的 生 物 學(xué) 基 礎(chǔ)。 所 以, 利 用 分 子 生 物 學(xué) 手 段 改 善 和 改 良 葡 萄 外 在 和 內(nèi) 在 品 質(zhì) 應(yīng) 該 是 今 后 的 重 點(diǎn) 發(fā) 展 趨 勢(shì)。 SBP-box 是 植 物 特 有 的 調(diào) 控 生 長(zhǎng) 發(fā) 育 的 重 要 轉(zhuǎn) 錄 因 子 家 族, 它 最 早 是 從 金 魚 草( A nt i r r hi nu m m a j u s) 花 序cDNA 文 庫(kù) 中 篩 選 到 的, 因 其 能 夠 識(shí) 別 并 結(jié) 合 到SQUAMOSA(SQ-UA) 的 啟 動(dòng) 子 上 而 得 名 2-3 。 SPL(SQUAMOSApromoter-bindingprotein- like) 是 類 似SBP-box 的 一 類 轉(zhuǎn) 錄 因 子 的 總 稱。 SPL 基 因 編 碼 了 一 個(gè) 高 度 保 守 的SPL 區(qū), 該 區(qū) 域 含 有 約80 個(gè) 氨 基 酸 殘 基, 包 括2 個(gè) 鋅 指 結(jié) 構(gòu) 和1 個(gè) 核 定 位 信 號(hào),2 個(gè) 鋅 指 結(jié) 構(gòu) 域Zn 2+ 的 順 序 結(jié) 合 模 式,Zn 2+ 和 核 定 位 信 號(hào) 在 蛋 白 與DNA 結(jié) 合 過 程 中 是 必 需 的 4 。 研 究 表 明SBP-box 轉(zhuǎn) 錄 因 子 在 植 物 中 廣 泛 存 在, 且 在 植 物 生 長(zhǎng) 發(fā) 育 的 多 個(gè) 方 面 起 著 重 要 作 用 5-8 。 據(jù) 報(bào) 道,SBP-box 轉(zhuǎn) 錄 因 子 在 植 物 花 的 形 成 及 后 期 發(fā) 育, 植 物 的 育 性, 營(yíng) 養(yǎng) 生 長(zhǎng) 向 生 殖 生 長(zhǎng) 的 轉(zhuǎn) 型, 葉 的 形 態(tài) 建 成, 環(huán) 境 信 號(hào) 應(yīng) 答 等 方 面 均 發(fā) 揮 重 要 作 用 7-8 。 目 前, 模 式 植 物 中 已 鑒 定 出 大 量 的SBP-box 家 族 成 員, 但 不 同 物 種 間 家 族 成 員 的 數(shù) 量 與 功 能 存 在 重 要 差 異, 且 該 類 轉(zhuǎn) 錄 因 子 的 研 究 主 要 集 中 在 花 器 官 形 成 與 開 花 時(shí) 間 的 發(fā) 育 調(diào) 控 方 面。 相 比 之 下, 葡 萄 方 面 相 關(guān) 研 究 很 少, 有 關(guān) SBP-box 調(diào) 控 葡 萄 果 實(shí) 成 熟 的 研 究 更 無(wú) 報(bào) 道。 本 研 究 對(duì) 葡 萄 S B P - b o x 基 因 進(jìn) 行 系 統(tǒng) 分 類 并 分 析 其 在 果 實(shí) 發(fā) 育 過 程 中 的 表 達(dá) 情 況 及 其 應(yīng) 答 激 素 的 模 式, 旨 在 從 轉(zhuǎn) 錄 因 子 角 度 認(rèn) 識(shí) 葡 萄 果 實(shí) 成 熟 發(fā) 育 過 程, 也 為 開 展 葡 萄 果 實(shí) 發(fā) 育 與 成 熟 過 程 的 分 子 調(diào) 控 提 供 一 定 的 理 論 依 據(jù)。 1 材 料 與 方 法 1.1 試 驗(yàn) 處 理 及 指 標(biāo) 測(cè) 定 試 驗(yàn) 于2016 年5 月31 日2016 年9 月4 日 在 江 蘇 省 農(nóng) 博 園 葡 萄 園 內(nèi) 進(jìn) 行。 園 區(qū) 位 于 句 容 市, 屬 于 亞 熱 帶 季 風(fēng) 氣 候, 年 均 氣 溫15.4, 年 降 雨 量1150mm。 供 試 材 料 為5 年 生、 歐 亞 種 葡 萄 魏 可(Muscat BaileyARubelMuscatX), 株 距 為1.0m, 行 距 為2.5m, 雙 十 字V 型 架, 避 雨 栽 培。 選 取 生 長(zhǎng) 勢(shì)、 負(fù) 載 量 較 為 一 致 的 魏 可 葡 萄, 根 據(jù) 前 人 研 究 9-11 和 預(yù) 試 驗(yàn) 結(jié) 果, 用100mgL -1 脫 落 酸 (ABA) 和200mgL -1 萘 乙 酸(NAA) 水 溶 液 進(jìn) 行 處 理, 以 清 水 處 理 作 為 對(duì) 照。 每 個(gè) 處 理 選 定6 株 長(zhǎng) 勢(shì) 較 為 一 致 的 植 株, 每2 株 為1 個(gè) 重 復(fù), 共 設(shè)3 次 重 復(fù)。 于 果 實(shí) 轉(zhuǎn) 色 前1 周(7 月28 日) 進(jìn) 行 噴 施 果 穗 處 理, 從 上 午08:00 開 始, 每 小 時(shí) 噴 施1 次, 共 噴 施3 次, 每 次 均 噴 施 果 穗 至 完 全 淋 濕 狀 態(tài)。 于 葡 萄 幼 果 期( 花 后3d,5 月31 日)、 第1 次 果 實(shí) 膨 大 期( 花 后13d,6 月10 日)、 硬 核 期( 花 后37d, 7 月4 日)、 果 皮 褪 綠 期( 花 后47d,7 月14 日)、 轉(zhuǎn) 色 前1 周( 花 后61d,7 月28 日)、 轉(zhuǎn) 色 初 期( 花 后69d, 8 月5 日)、 轉(zhuǎn) 色 中 期( 花 后84d,8 月20 日) 和 完 熟 期( 花 后99d,9 月4 日) 進(jìn) 行 取 樣, 分 別 從 對(duì) 照 與 處 理 的 植 株 中 隨 機(jī) 選 擇4 果 穗, 每 穗 上、 中、 下3 個(gè) 部 位 隨 機(jī) 采 取3 個(gè) 果 粒。 樣 品 采 集 后 立 即 投 入 液 氮 中 速 凍 后 帶 回 實(shí) 驗(yàn) 室 于-70 冰 箱 中 保 存 備 用。 1.2 葡 萄 S B P - box 基 因 在 果 實(shí) 發(fā) 育 過 程 中 的 表 達(dá) 采 用CTAB 方 法 12 提 取 葡 萄 果 實(shí)8 個(gè) 發(fā) 育 時(shí) 期 樣 品, 以 及ABA 和NAA 處 理 及 對(duì) 照 果 實(shí) 樣 品 的 總 RNA。 cDNA 的 合 成 以 提 取 的 果 實(shí) 總RNA 為 模 板, 參 考PrimeScript TM RT-PCR 試 劑 盒(TaKaRa) 說 明 書 進(jìn) 行 反 轉(zhuǎn) 錄。 采 用 葡 萄 V v A c t i n( 登 錄 號(hào):XM 002273532) 作 為 內(nèi) 參 基 因。 從 葡 萄 轉(zhuǎn) 錄 因 子 數(shù) 據(jù) 庫(kù)(http:/ planttfdb.cbi.pku.edu.cn/index.php?sp=Vvi) 下 載 葡 萄 的19 個(gè)SBP-box 家 族 成 員 的 基 因 序 列, 通 過NCBI 中 Nucleotide Blast(https:/blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi? PROGRAM = blastn945s,6015s,7210s,40 個(gè) 循 環(huán)。 試 驗(yàn)3 次 重 復(fù)。 反 應(yīng) 結(jié) 束 后 分 析 熒 光 值 變 化 曲 線 以 及 熔 解 曲 線 13-14 。 試 驗(yàn) 數(shù) 據(jù) 用 C T 法 15 分 析, 采 用Excel2013 軟 件 繪 圖。 表1 引 物 序 列 Table1 Primersofsequences 基 因 名 稱Genename 引 物 對(duì) 序 列(53)Primerpairssequence V v S B P 1 - l i k e 1 CCTTGCTGGGAAAGTCGAAC/TTGGGATGCACGTTGGAAAG V v S B P 1 - l i k e 2 CCTTGCTGGGAAAGTCGAAC/TTGGGATGCACGTTGGAAAG V v S B P 1 - l i k e 3 TGCACTGCTGATCTCACTGA/TCATTGTGTCCTGCCAAACG V v S B P 1 - l i k e 4 TGGGTTAGGGTTTGGAGAGG/GTGCCGCTTGTGGTATCTTT V v S B P 1 - l i k e 5 TGCTTGATGGTACTGTGGGT/ATCCCTACCAGCTGCAATGT V v S B P 2 GCCAACAGTGTAGCAGGTTC/TGCTGCTTCCCACCATAGAA V v S B P 3 - l i k e 1 AGAGGTACCACAGAAGGCAC/CTTCTGCGCTGGTTATGTCC V v S B P 3 - l i k e 2 CCAAGTCTTCTACCACCCCA/CTTAAACAGCGCCCTACCAC V v S B P 6 TGCTTCCCAGTAACCCAAGT/ACAATCAGCCAATCTCCCCA V v S B P 7 - l i k e 1 GAGGAGATTAGCAGGGCACA/AGTTCTGCTGAGGAAACCCA V v S B P 7 - l i k e 2 ATCATCGACGGCATAGGGTT/TTCCTTTTCAACCGTGCCTC V v S B P 8 CCCGCTCATATTCACTCCCT/AATTCTCGCCGTGAAATCCG V v S B P 9 CGGGTTGAAATTTGGGCAGA/TGACCGTTGGAGACTTCGAA V v S B P 1 0 TTTGTCAACAGTGCAGCAGG/GGAGTTGCAACAGGGATTGG V v S B P 1 2 TGGGTTGGCTGCTTCATAGA/ATGAAGGAGGCACATGTCCA V v S B P 1 3 AAGGCTCGGGATTGTTACCA/GGTGGTCAGCTTGCAAGAAA V v S B P 1 4 TGAGGGAAAGAGAAGCTGCA/TGTTCCCTTGTGTACGAGCT V v S B P 1 6 AGCTTAGGAGGAGGACAGGA/CAGACTTTATGGCGACGGTG V v S B P 1 8 TTCCTCGGACTGTGCTTTCT/CTGGACTGATTGGCATGCTC 1.3 序 列 分 析 利 用 序 列 分 析 軟 件ClustalX2 16 、DNAMAN6 17 和 在 線 軟 件WebLogo3(http:/weblogo.threeplus one.com/create.cgi) 分 析 V v SB P 基 因 保 守 序 列。 利 用 同 樣 的 方 法 從 轉(zhuǎn) 錄 因 子 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 中 得 到 擬 南 芥 和 楊 樹 SBP-box 蛋 白。 利 用 進(jìn) 化 樹 分 析 軟 件MEGA4.1(https:/mega.co.nz/) 18 對(duì) V v SB P 進(jìn) 行 亞 組 分 類。 葡 萄 SB P - b o x 基 因 內(nèi) 含 子、 外 顯 子 和 基 因 組 定 位 均 下 載 自 葡 萄 功 能 基 因 組 數(shù) 據(jù) 庫(kù)(http:/www.genoscope.cns.fr/ cgi-bin/ggb/vitis/12X/gbrowse/vitis/)。 葡 萄 SB P - b o x 基 因 內(nèi) 含 子 和 外 顯 子 結(jié) 構(gòu) 利 用 在 線 軟 件Gene StructureDisplayServer(http:/gsds.cbi.pku.edu.cn/) 制 作 完 成。 1.4 葡 萄 S B P - box 基 因 家 族 成 員 啟 動(dòng) 子 作 用 元 件 分 析 從 葡 萄 轉(zhuǎn) 錄 因 子 數(shù) 據(jù) 庫(kù)(http:/planttfdb.cbi.pku.edu.cn/) 下 載SBP-box 家 族 成 員 的 基 因 編 號(hào), 再 在 GrapeGenomeBrowser(http:/www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/) 中, 尋 找 到 每 一 個(gè) 基 因 序 列 上 游1500bp 的 片 段, 即 獲 得 基 因 的 啟 動(dòng) 子 序 列, 將 其 放 入PlantCARE 中(http:/bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/), 即 可 查 找 到 每 個(gè) 基 因 的 啟 動(dòng) 子 所 對(duì) 應(yīng) 的 作 用 元 件, 從 而 預(yù) 測(cè) 每 一 個(gè) 基 因 潛 在 的 生 物 學(xué) 功 能。 1.5 數(shù) 據(jù) 處 理 對(duì) 所 有 數(shù) 據(jù) 進(jìn) 行 方 差 分 析, 采 用 新 復(fù) 極 差 法 進(jìn) 行 顯 著 性 檢 驗(yàn), 并 采 用Excel2013 軟 件 繪 圖。 2 結(jié) 果 與 分 析 2.1 葡 萄SBP-box 轉(zhuǎn) 錄 因 子 家 族 成 員 序 列 分 析 通 過 轉(zhuǎn) 錄 因 子 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 得 到 葡 萄 SB P - b o x 基 因, 已 在 轉(zhuǎn) 錄 因 子 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 中 注 冊(cè) 的 葡 萄 SB P - b o x 基 因 有19 個(gè), 下 載 其 編 碼 區(qū) 并 獲 得 基 因 登 錄 號(hào)。 根 據(jù) 基 因 登 錄 號(hào), 在 葡 萄 基 因 組 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 獲 得 其 相 關(guān) 的 蛋 白 序 列, 詳 細(xì) 信 息 見 表2。 1 3 4 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 第41 卷 表2 葡 萄 中 已 知 S B P - b o x 基 因 家 族 成 員 Table2 Theknown S B P - b o xgenesfamillymembersingrape 基 因 名 稱 Genename 登 錄 號(hào) AccessionNo. 染 色 體 定 位Chromosomelocalization 位 置Location 染 色 體Chromosome 開 放 閱 讀 框/bp Openingreadingframe 氨 基 酸 Aminoacid V v S B P 1 - l i k e 1 GSVIVT01020050001 1112469011127549 1 351 116 V v S B P 1 - l i k e 2 GSVIVT01020051001 1108025311083113 1 348 115 V v S B P 1 - l i k e 3 GSVIVT01020578001 41082974110237 12 510 160 V v S B P 1 - l i k e 4 GSVIVT01021087001 13463971348752 10 423 140 V v S B P 1 - l i k e 5 GSVIVT01028208001 46281424637596 7 2583 860 V v S B P 2 GSVIVT01010496001 2106430521071687 1 1257 418 V v S B P 3 - l i k e 1 GSVIVT01003836001 2053634920537931 4 624 207 V v S B P 3 - l i k e 2 GSVIVT01014302001 24842972485658 19 615 204 V v S B P 6 GSVIVT01012247001 230334235218 1 1497 499 V v S B P 7 - l i k e 1 GSVIVT01018205001 1324504113249262 15 1215 404 V v S B P 7 - l i k e 2 GSVIVT01017835001 38851493896071 5 2079 693 V v S B P 8 GSVIVT01018204001 1325686513259160 15 1167 388 V v S B P 9 GSVIVT01033519001 2004648920051103 8 1050 350 V v S B P 1 0 GSVIVT01032239001 1358859513606856 11 981 326 V v S B P 1 2 GSVIVT01017678001 25653432574143 5 2943 981 V v S B P 1 3 GSVIVT01008556001 904847907405 17 1134 378 V v S B P 1 4 GSVIVT01013452001 347645353985 18 2766 922 V v S B P 1 6 GSVIVT01010522001 2141277621417820 1 1266 422 V v S B P 1 8 GSVIVT01033064001 2548681825489754 14 1137 378利 用ClustalX2、DNAMAN6 序 列 分 析 軟 件 和 在 線 軟 件WebLogo3 對(duì) 葡 萄SBP-box 保 守 結(jié) 構(gòu) 域 進(jìn) 行 分 析, 結(jié) 果 發(fā) 現(xiàn),17 個(gè) S B P - b o x 基 因 的SBP-box 保 守 結(jié) 構(gòu) 域 含 有74 個(gè) 氨 基 酸 序 列, 且 大 部 分 成 員 具 有 較 高 保 守 性; V v SB P 1 - l i k e 1 和 V v SB P 1 - l i k e 2 不 包 含 完 整 的SBP-box 結(jié) 構(gòu) 域, 其 只 含 有 完 整 結(jié) 構(gòu) 域 中 的28 個(gè) 氨 基 酸, 缺 少 其 他46 個(gè) 氨 基 酸( 圖1 和 圖2)。 在SBP-box 保 守 結(jié) 構(gòu) 域 中, 氨 基 酸14(CQVE)、6(C)、910 (DL)、1314(AK)、1624(YHRRHKVCE)、2628(HSK)、32(V)、34(V)、36(G)、39(Q)、4049(QRFC- QQCSRFH)、51(L)、5355(EFD)、5369(EFDEGKRSCRRRLAGHN)、7174(RRRK) 多 達(dá)61 個(gè) 位 點(diǎn) 具 有 較 高 的 保 守 性( 圖1 和 圖2)。 圖1 葡 萄SBP-box 蛋 白 家 族 的SBP-box 保 守 結(jié) 構(gòu) 域 分 析 Fig.1 SequenceanalysisoftheSBP-boxconserveddomainingrapeSBP-boxproteins 2.2 葡 萄SBP-box 蛋 白 家 族 進(jìn) 化 樹 分 析 通 過 進(jìn) 化 樹 分 析 軟 件MEGA4.1 對(duì) 已 知19 個(gè) 葡 萄SBP-box、30 個(gè) 擬 南 芥SBP-box、 楊 樹32 個(gè)SBP-box 蛋 白 結(jié) 構(gòu) 域 序 列 進(jìn) 行 進(jìn) 化 分 析。 基 于 進(jìn) 化 樹 亞 組 的 分 類 標(biāo) 準(zhǔn), 即 根 據(jù) 進(jìn) 化 樹 中 成 員 的 聚 類 分 支, 若 成 員 位 于 同 一 分 支, 具 有 較 近 的 親 緣 關(guān) 系, 即 定 義 為 同 一 個(gè) 亞 組; 從 進(jìn) 化 樹 分 析 結(jié) 果 可 以 看 出, 葡 萄SBP-box 家 族 2 3 4  第3 期 崔 夢(mèng) 杰, 等: 葡 萄SBP-box 轉(zhuǎn) 錄 因 子 家 族 的 生 物 信 息 學(xué) 分 析 及 其 應(yīng) 答 激 素 調(diào) 控 葡 萄 果 實(shí) 成 熟 的 作 用 共 分 為 3 個(gè) 亞 組。 VvSBP1-like1、VvSBP1-like2、VvSBP2、VvSBP3-like1、VvSBP6、VvSBP8、VvSBP10、 VvSBP13、VvSBP16、VvSBP18 屬 于 第1 亞 組;VvSBP1-like3、VvSBP1-like4、VvSBP1-like5、VvSBP3-like2、 VvSBP7-like1、VvSBP9、VvSBP12、VvSBP14 屬 于 第2 亞 組;VvSBP7-like2 屬 于 第3 亞 組( 圖3)。 圖2 葡 萄SBP-box 蛋 白 家 族 的SBP-box 保 守 結(jié) 構(gòu) 域 序 列 標(biāo) 簽 Fig.2 TheconserveddomainlogooftheSBP-boxingrapeSBP-boxproteins 圖3 葡 萄 、 擬 南 芥 和 楊 樹SBP-box 保 守 域 進(jìn) 化 關(guān) 系 和 亞 組 分 類 Fig.3 PhylogeneticrelationshipandsubgroupdivisionofSBP-boxconserveddomainofgrape , A r a b i d o p s i s t h a l i a n aand P o p u l u s e u p h r a t i c a 3 3 4 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 第41 卷 2.3 葡 萄 S B P - box 基 因 家 族 內(nèi) 含 子 與 外 顯 子 分 析 通 過 葡 萄 功 能 基 因 組 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 下 載SBP-box 家 族 每 個(gè) 基 因 的 編 碼 區(qū) 序 列 及 基 因 組 信 息, 并 利 用 在 線 軟 件GeneStructureDisplayServer(http:/gsds.cbi.pku.edu.cn/) 繪 圖。 從 圖4 可 以 看 出: 葡 萄 SB P - b o x 家 族 的 外 顯 子 和 內(nèi) 含 子 數(shù) 量 各 異, 且 結(jié) 合 圖3 發(fā) 現(xiàn), 第2 亞 組 中 基 因 成 員 的 外 顯 子 和 內(nèi) 含 子 數(shù) 量 普 遍 多 于 第1 和 第3 亞 組。 圖4 葡 萄 S B P - b o x 基 因 內(nèi) 含 子 和 外 顯 子 結(jié) 構(gòu) 圖 Fig.4 Intron-extronstructuresofgrape S B P - b o xgenes 2.4 葡 萄 S B P - box 基 因 染 色 體 定 位 分 析 通 過 葡 萄 功 能 基 因 組 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 下 載 葡 萄SBP-box 相 關(guān) 染 色 體 定 位 信 息, 繪 制 染 色 體 定 位 分 布 圖。 從 圖5 可 以 看 出: 葡 萄 S B P - b o x 基 因 分 布 于 葡 萄13 條 染 色 體 上, 呈 不 均 勻 分 布。 其 中, 染 色 體1 分 布 最 多, 為 5 個(gè); 其 次 是 染 色 體5 和15, 均 分 布2 個(gè); 染 色 體4、7、8、10、11、12、14、17、18 和19 均 分 布1 個(gè); 染 色 體2、 3、6、9、13 和16 則 沒 有 分 布。 圖5 葡 萄 S B P - b o x 基 因 染 色 體 定 位 Fig.5 Chromosomelocationsofgrape S B P - b o xgenes 4 3 4  第3 期 崔 夢(mèng) 杰, 等: 葡 萄SBP-box 轉(zhuǎn) 錄 因 子 家 族 的 生 物 信 息 學(xué) 分 析 及 其 應(yīng) 答 激 素 調(diào) 控 葡 萄 果 實(shí) 成 熟 的 作 用 2.5 葡 萄 S B P - box 基 因 家 族 成 員 啟 動(dòng) 子 作 用 元 件 分 析 由 表3 可 見:SBP-box 啟 動(dòng) 子 元 件 可 分 為5 個(gè) 類 型, 分 別 為 光 反 應(yīng) 相 關(guān) 響 應(yīng) 元 件、 激 素 相 關(guān) 的 響 應(yīng) 元 件、 脅 迫 相 關(guān) 響 應(yīng) 元 件、 組 織 特 異 性 響 應(yīng) 元 件、 周 期 節(jié) 律 相 關(guān) 的 元 件。 葡 萄 S B P - b o x 基 因 家 族 中 每 一 個(gè) 成 員 均 含 有 這5 種 作 用 元 件 類 型, 其 中 光 響 應(yīng) 元 件 數(shù) 量 最 多, 激 素 相 關(guān) 響 應(yīng) 元 件 和 脅 迫 相 關(guān) 響 應(yīng) 元 件 的 數(shù) 量 次 之, 再 次 是 組 織 特 異 性 響 應(yīng) 元 件, 周 期 節(jié) 律 性 相 關(guān) 元 件 數(shù) 量 最 少, 甚 至 個(gè) 別 基 因 為0。 不 同 轉(zhuǎn) 錄 因 子 不 僅 含 有 不 同 數(shù) 量 的 激 素 相 關(guān) 響 應(yīng) 元 件, 如 V v SB P 7 - l i k e 1 有14 個(gè), V v S B P 8 和 V v SB P 18 分 別 有2 個(gè), 而 且 元 件 的 類 型 也 存 在 一 定 差 異, 如 V v SB P 2 分 別 含 有 脫 落 酸 類( 如ABRE)、 乙 烯 類( 如ERE)、 赤 霉 素 類( 如 GARE) 等 作 用 元 件, 而 V v SB P 3 - l i k e 2 則 含 有 乙 烯 類( 如ERE)、 生 長(zhǎng) 素 類( 如TGA-box)、 赤 霉 素 類( 如 GARE、TATC) 等 作 用 元 件, 且 各 類 型 作 用 元 件 的 數(shù) 量 不 同( 圖6), 說 明 它 們 可 能 通 過 響 應(yīng) 不 同 的 激 素 信 號(hào), 在 果 實(shí) 發(fā) 育 成 熟 過 程 起 不 同 的 調(diào) 控 作 用。 表3 SBP-box 家 族 不 同 成 員 基 因 的 啟 動(dòng) 子 元 件 分 類 及 功 能 數(shù) 量 分 析 Table3