園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (1)： 168 176. Acta Horticulturae Sinica   168                                                doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0522； http： /www. ahs. ac. cn  收稿日期 ： 2017 09 18； 修回日期 ： 2018 01 12 基金項(xiàng)目 ： 國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（ 31471909） ；山東省高等學(xué)校科技計(jì)劃（ J15LF01）  * 并列第一作者  * 通信作者  Author for correspondence（ E-mail： wanglshibcas.ac.cn）  基于牡丹類(lèi)黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因建立 VIGS 技術(shù)體系  舒慶艷1,*，朱 瑾1,2,*，門(mén)思琦1,2，郝  青3，王倩玉1,2，劉政安1，曾秀麗4，王亮生1,2,*（1中國(guó)科學(xué)院北方資源植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 /中國(guó)科學(xué)院植物研究所北京植物園，北京  100093；2中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京  100049；3青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與林學(xué)院，山東青島  266109；4西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院蔬菜研究所，拉薩  850032）  摘  要： 牡丹（ Paeonia suffruticosa Andrews）花色的化學(xué)基礎(chǔ)研究較為深入，但因其無(wú)遺傳轉(zhuǎn)化體系，導(dǎo)致花色相關(guān)基因的功能驗(yàn)證只能利用其他植物進(jìn)行旁證。利用保守區(qū)段長(zhǎng)分別為 413 和 418 bp 的牡丹花瓣類(lèi)黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因 PsUF3GT 和 PsUF5GT，通過(guò) VIGS 表達(dá)載體，采用二因素三水平的試驗(yàn)體系對(duì)目的基因進(jìn)行沉默。結(jié)果表明， PsUF3GT 和 PsUF5GT 的表達(dá)量在花斑中（盛開(kāi)期花瓣，真空抽濾 15 min）和非斑中（蕾期花瓣，真空抽濾 10 min）分別比空載體處理的花斑中（盛開(kāi)期花瓣，真空抽濾 10 min）和非斑中（蕾期花瓣，真空抽濾 15 min）降低了 65.0%和 85.0%；花斑中總花青苷含量分別降低了 24.2%和 28.2%， 尤其是盛開(kāi)期花瓣 （真空抽濾 15 min） 處理后 3G 型糖苷降低了 92.2%， 蕾期花瓣  （真空抽濾 10 min）處理后 3G5G 型糖苷降低了 54.9 %。由此獲得了沉默 PsUF3GT 和 PsUF5GT 的適宜體系：以盛開(kāi)期或者花蕾期帶花柄的花朵為材料，抽真空滲透 10 15 min 后，置于去離子水中暗培養(yǎng) 1 d（ 8 ，濕度 60%） ；之后轉(zhuǎn)移至 23 25 、濕度 60%的環(huán)境，光照培養(yǎng) 3 d 后可用于檢測(cè)和分析。本研究中建立的 VIGS 體系可有效沉默花瓣中的內(nèi)源基因， 為牡丹基因功能驗(yàn)證及其花色形成的分子機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。  關(guān)鍵詞： 牡丹；花色； VIGS；類(lèi)黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因（ UFGT） ；功能驗(yàn)證  中圖分類(lèi)號(hào)： S 685.11       文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A        文章編號(hào)： 0513-353X（ 2018） 01-0168-09 Establishing Virus Induced Gene Silencing（ VIGS） System in Tree Peony Using PsUFGT Genes SHU Qingyan1,*， ZHU Jin1,2,*， MEN Siqi1,2， HAO Qing3， WANG Qianyu1,2， LIU Zhengan1，ZENG Xiuli4， and WANG Liangsheng1,2,*（1Key laboratory of Plant Resources and Beijing Botanical Garden， Institute of Botany， The Chinese Academy of Sciences，Beijing 100093， China；2University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China；3Landscape and Forestry College， Qingdao Agricultural University， Qingdao， Shandong 266109， China；4Institute of Vegetables， Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandary Sciences， Lhasa 850032， China）  Abstract： Considerable progress has been made on the phytochemical basis of flower color formation 舒慶艷，朱   瑾，門(mén)思琦，郝   青，王倩玉，劉政安，曾秀麗，王亮生 . 基于牡丹類(lèi)黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因建立 VIGS 技術(shù)體系 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (1)： 168 176.                                                                                      169 on tree peony（ Paeonia suffruticosa Andrews） . However， due to lack of genetic transformation system，function of the genes related to flower color formation has to be characterized using other model plant systems. We utilized virus induced gene silencing（ VIGS） for establishing the functional characterizing technique to study UDP-glucose： flavonoid glycosyltransferases（ UFGTs） genes in tree peony. The fragments with 413 bp and 418 bp length with a putatively conserved domain of PsUF3GT and PsUF5GT were selected for constructing VIGS recombinant vectors， respectively. Nine treatments with two factors and three levels were conducted to test the gene silencing effects. The results showed that the expression level of PsUF3GT after infiltrating petals of blooming for 15 min， or the expression level of PsUF5GT after infiltrating petals of bud stage for 10 min， were reduced 65.0% and 85.0% as compared with that of control petals of blooming or bud stage infiltrated using empty vectors for 10 min or 15 min， respectively. Meanwhile， total anthocyanins content in petal blotch were also decreased 24.2% and 28.2% after treatment of flowers at blooming or bud stage by infiltration for 15 min or 10 min， respectively， in which，cyanidin 3-O-glucoside reduced 92.2% in petals at blooming stage infiltrated for 15 min and cyanidin 3,5-O-diglucoside reduced 54.9 % in petals at bud staged infiltrated for 10 min. Therefore， an optimal VIGS system has been established in tree peony， namely， flowers at blooming or bud stage were subjected to vacuum infiltration for 10 15 min， then kept in dark for 1 d at 8  with relative 60% humidity，afterwards， kept at 23 25  with normal light and relative 60% humidity for 3 d， then， treated samples could be used for further functional characterization of the silenced genes. Our VIGS method would be beneficial to functional characterization of the genes related to flower color formation， and study the molecular mechanism of flower color variation. Keywords： tree peony； flower color； VIGS； flavonoid； UDP-glucose； flavonoid glycosyltransferases （ UFGTs） ； functional characterization 牡丹（ Paeonia suffruticosa Andrews）花色形成的化學(xué)基礎(chǔ)研究較為深入，花瓣中含有 12 種花青苷，其中天竺葵素 3葡萄糖苷（ Pg3G） 、天竺葵素 3,5二葡萄糖苷（ Pg3G5G） 、矢車(chē)菊素 3葡萄糖苷（ Cy3G） 、矢車(chē)菊素 3,5二葡萄糖苷（ Cy3G5G） 、芍藥花素 3葡萄糖苷（ Pn3G）和芍藥花素 3,5二葡萄糖苷（ Pn3G5G）是主要的花青苷（ Wang et al.， 2001， 2004；張晶晶  等， 2006；李崇暉， 2010） 。牡丹栽培品種，尤其是西北牡丹品種群，花瓣基部具有鮮艷碩大的色斑，不僅增加了其觀(guān)賞價(jià)值，而且色斑常作為品種分類(lèi)的重要依據(jù)之一。這些牡丹花瓣中色斑部分的花青苷主要由 Pn3G5G、 Cy3G5G 和 Cy3G 組成， Pn3G 含量很低，幾乎不含 Pg 型色素，推測(cè)花瓣基部 Cy 的糖苷化、甲基化和高花青苷含量是形成色斑的主要原因（ Wang et al.， 2001， 2004） 。 Zhang 等（ 2007）分析了 35 個(gè)西北牡丹品種花瓣的花青苷組成，斑中以 Cy3G 為主，非斑以 Pn3G5G 為主，斑中的花青苷含量明顯高于非斑。  類(lèi)黃酮是植物中一類(lèi)重要的次生代謝產(chǎn)物，通常需要在合成的最后一步進(jìn)行糖苷化修飾，以增加其在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性、溶解性并影響花的顯色（田鵬和劉占林， 2011；陳嘉景  等， 2016） 。類(lèi)黃酮糖苷化由糖基轉(zhuǎn)移酶（ UDP-glucose： flavonoid glycosyltransferases， UFGTs）完成，其糖基供體通常是核苷酸糖（ nucleotide sugar， Uridine diphosphate， UDP） ，如 UDP葡萄糖等。最早發(fā)現(xiàn)的是控制玉米粒色素的基因 Bronze1，其編碼類(lèi)黃酮 UDP糖基轉(zhuǎn)移酶（ Dooner & Nelson， 1997） 。已經(jīng)在很多植物中發(fā)現(xiàn)了類(lèi)黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因， 如玉米、 金魚(yú)草、 龍膽和牽牛等的 UF3GT（ Schiefelbein Shu Qingyan， Zhu Jin， Men Siqi， Hao Qing， Wang Qianyu， Liu Zhengan， Zeng Xiuli， Wang Liangsheng. Establishing virus induced gene silencing（ VIGS） system in tree peony using PsUFGT genes. 170                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 168 176. et al.， 1985； Martin et al.， 1991； Tanaka et al.， 1996； Morita et al.， 2015） ，及龍膽和葡萄的 UF5GT等（ Nakatsuka et al.， 2008； Yang et al.， 2014） 。此外，在月季中還有一種糖基轉(zhuǎn)移酶先將花青苷5 O糖苷化后再繼續(xù)將 3 O修飾形成 3,5雙 O糖苷，聚類(lèi)分析表明其與花青苷 3GT和5GT糖基轉(zhuǎn)移酶亞家族明顯不同（ Ogata et al.， 2005） ?？梢?jiàn)在不同物種中，類(lèi)黃酮糖苷化修飾基因存在多樣性并由超家族基因組成。牡丹花瓣中類(lèi)黃酮（包括花青苷）合成途徑中部分相關(guān)酶基因已有克隆和表達(dá)分析（周琳  等， 2010， 2011； Du et al.， 2015； Zhao et al.， 2015） ，而類(lèi)黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。  牡丹再生和遺傳轉(zhuǎn)化非常困難，尚未見(jiàn)其遺傳轉(zhuǎn)化體系的報(bào)道，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)驗(yàn)證牡丹基因的功能，存在技術(shù)瓶頸。而牡丹從實(shí)生苗到開(kāi)花需要 3 4 年的時(shí)間，開(kāi)花相關(guān)的表型鑒定困難較大。病毒誘導(dǎo)的基因沉默 VIGS（ Virus-induced gene silencing）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，可引起內(nèi)源 mRNA 序列特異性降解（ Ratcliff et al.， 2001） 。 VIGS 已作為一種高效的反向遺傳學(xué)新技術(shù)應(yīng)用于植物基因功能研究（ Purkayastha & Dasgupta， 2009） ，包括蝴蝶蘭（ Hsieh et al.，2013） 、矮牽牛（ Broderick & Jones， 2014） 、月季（ L et al.， 2014）和番茄（季娜娜  等， 2016）等。從技術(shù)、材料自身角度考慮，利用 VIGS 技術(shù)建立牡丹基因功能研究的技術(shù)體系，可能是克服牡丹遺傳轉(zhuǎn)化困難瓶頸的手段。  利用同源克隆技術(shù)克隆了牡丹類(lèi)黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因 PsUF3GT 和 PsUF5GT 的保守區(qū)段作為靶基因構(gòu)建 TRV2 載體，成功建立了 VIGS 沉默體系，有效地降低了這兩個(gè)基因的表達(dá)量和總花青苷含量。本研究結(jié)果對(duì)牡丹基因功能研究具有重要意義，也為解析牡丹色斑形成的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。  1  材料與方法  1.1  材料  紫斑牡丹青海湖銀波 （ Paeonia suffruticosa Qinghaihu Yinbo ）栽植于中國(guó)科學(xué)院植物研究所牡丹芍藥種質(zhì)資源圃，其斑為紫紅色，非斑為白色，非斑部分未檢測(cè)出花青苷，斑部花青苷有 4種：矢車(chē)菊素 3葡萄糖苷（ Cy3G） 、矢車(chē)菊素 3,5二葡萄糖苷（ Cy3G5G） 、芍藥花素 3葡萄糖苷（ Pn3G）和芍藥花素 3,5二葡萄糖苷（ Pn3G5G） （ Zhang et al.， 2007） 。  VIGS 載體來(lái)自煙草脆裂病毒載體（ tobacco rattle virus， TRV） ， TRV1/TRV2 為中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)觀(guān)賞植物采后和逆境生理實(shí)驗(yàn)室馬男教授饋贈(zèng)，載體信息參考 Tian 等（ 2014）的文獻(xiàn)。所用標(biāo)準(zhǔn)品矢車(chē)菊素 3葡糖苷（ Cy3G）購(gòu)自法國(guó) Extrasynthese 公司（ Genay， France） 。  1.2  基因克隆  花瓣總 RNA 的提取參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行 RNAprep Pure Plant Kit， FastQuant cDNA 天根生化科技（北京）有限公司。根據(jù)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中 3GT 和 5GT 序列設(shè)計(jì)上、下游引物克隆靶片段（ AQZ26785、 ARA67360 和 AF171902）。用于 VIGS 沉默的 PsUF3GT 和 PsUF5GT 片段設(shè)計(jì)上、下游引物并添加 BamH和 Xho酶切位點(diǎn)。  擴(kuò)增引物見(jiàn)表 1。  舒慶艷，朱   瑾，門(mén)思琦，郝   青，王倩玉，劉政安，曾秀麗，王亮生 . 基于牡丹類(lèi)黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因建立 VIGS 技術(shù)體系 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (1)： 168 176.                                                                                      171 表 1  本研究所用引物序列相關(guān)信息  Table 1  Primer lists and related information used in this study 用途 Purpose 編號(hào) Code 引物序列（ 5 3） Primer sequence 長(zhǎng)度 /bpLengthqRT-PCR 3GT F： TGGGGTTGCCTTTTTATGGTCACTT； R： TCCACCTCCGATACTCTCTA 198 5GT F： TCGTTTGGAAGCGTCTCTGTTTTAC； R： CCATTCCTTGCTTTTCCAAATCTTC 169 內(nèi)參 Reference PsTub F： GCACCAAAGAAGTGGACGAACAAAT； R： AGTAAACTGTTCACTCACACGCCTG 183 陽(yáng)性克隆檢測(cè) PCR check  for positive clone TRV1 F： TTACAGGTTATTTGGGCTAG； R： CCGGGTTCAATTCCTTATC 646 TRV2 F： TGGGAGATGATACGCTGTT； R： CCTAAAACTTCAGACACG 280 載體構(gòu)建 Vector construction 3GT-V F： AAGGATCCCATGGCTCAATGACCAAAAGGCTAA；  R： TTACTCGAGCATTCTTCGTAAATACT CCACCGTCG 413 5GT-V F： AAGGATCCTTTGGAAAAGCAAGGAATGGTGGTG；  R： ACGCTCGAGTCACAAATCACCACC TTTCCCCACC 418 注：下劃線(xiàn)表示堿基酶切位點(diǎn)。  Note： Underline indicated restriction enzyme cutting sites. 1.3  VIGS 體系建立  采用二因素三水平試驗(yàn)體系共設(shè) 9 個(gè)處理進(jìn)行 VIGS 試驗(yàn)。花發(fā)育因素設(shè)盛開(kāi)期（斑色紫紅，非斑部分花瓣白色） 、半開(kāi)期（斑色深紫紅，非斑部分花瓣白色） 、蕾期（斑淺紅色，非斑部分花瓣黃綠色） 3 個(gè)水平；真空抽濾時(shí)間因素設(shè) 3 個(gè)水平分別為 10、 15 和 20 min。  TRV2-3GT 和 TRV2-5GT 為目標(biāo)基因， 相應(yīng)的 TRV2 空載體為對(duì)照 （表 2） 。 轉(zhuǎn)化方法參照 Tian等（ 2014）的抽真空法，重懸菌液的吸光值 A600= 1.0， pTRV2-3/5GT、 pTRV1 和 pTRV2 菌液的A600值相同。將 pTRV2-3/5GT 和 pTRV1、 pTRV2 和 pTRV1 菌液按體積比 1 1 分別混合，暗處?kù)o置4 h。  將牡丹花朵帶 5 cm 花柄剪下，分別置于 9 個(gè)處理的菌液中，抽真空至 0.7 atm，負(fù)壓處理，緩慢放氣。每處理 3 朵花，單花重復(fù)。將抽吸后的花瓣用去離子水漂洗，去除多余菌液。花柄沒(méi)于去離子水中， 8 ，濕度 60%，暗培養(yǎng) 1 d；之后轉(zhuǎn)移至 23 25 ，相對(duì)濕度 60%左右，正常光照下培養(yǎng) 3 d。侵染 4 d 后采樣，將花瓣的斑部與非斑部分分開(kāi)。選取花瓣作為 RNA 提取檢測(cè)樣本和色素抽提樣本， RNA 檢測(cè)樣本置于液氮中速凍并存于 80 ，色素抽提樣本經(jīng)冷凍干燥處理后保存于茶色干燥器中。之后檢測(cè)目的基因的表達(dá)水平以及花青苷積累量相對(duì)于對(duì)照的變化。因非斑部分不積累花青苷，所以侵染后僅測(cè)斑部花青苷成分及含量。  1.4  基因表達(dá)分析  基因表達(dá)分析參照 Du 等（ 2015），提取所有樣品總 RNA，并反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，作為熒光定量PCR 的模板， 具體方法參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行 FastQuant cDNA 和 SYBR Green， 天根生化科技 （北京）有限公司。采用 2-CT（ Livak）法計(jì)算實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 試驗(yàn)中基因的相對(duì)表達(dá)量，以 PsTubulin作為內(nèi)參基因（ Du et al.， 2015） 。將花瓣斑與非斑分開(kāi)進(jìn)行表達(dá)量分析，分 3 次生物學(xué)重復(fù)和 3 次技術(shù)重復(fù)。1.5  斑部花青苷測(cè)定  將干燥后的花斑稱(chēng)重后提取花青苷（ Li et al.， 2009）。采用 Dionex HPLC-DAD 分析系統(tǒng)，色譜柱為 TSK gel ODS-80Ts QA， 4.6 mm（內(nèi)徑） 150 mm（柱長(zhǎng)）（日本 Tosoh 株式會(huì)社）?；ㄇ嘬盏亩ㄐ院投糠治鰠⒄?Zhang 等（ 2007）和 Li 等（ 2009）的方法。利用 Agilent 1100 LC/MSD Trap Shu Qingyan， Zhu Jin， Men Siqi， Hao Qing， Wang Qianyu， Liu Zhengan， Zeng Xiuli， Wang Liangsheng. Establishing virus induced gene silencing（ VIGS） system in tree peony using PsUFGT genes. 172                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 168 176. VL 液質(zhì)聯(lián)用儀（ Agilent Technologies， Palo Alto， CA， USA）進(jìn)行 HPLC 分析。標(biāo)準(zhǔn)品為矢車(chē)菊素3 O葡萄糖苷（ Cy3G），通過(guò)半定量法計(jì)算花青苷含量（ Wang et al.， 2001）?？偦ㄇ嘬蘸縏A（ mAU） = 0.0012Cy3G（ g mL-1）  + 0.0121， R2 = 0.994，花青苷含量以 mg g-1干燥花瓣計(jì)。用 Chameleon 軟件（ Ver. 6.60）分析結(jié)果。  1.6  數(shù)據(jù)分析  熒光定量 PCR 和花青苷測(cè)定數(shù)據(jù)采用軟件 SPSS 13.0 v （ SPSS Inc., Chicago, IL）進(jìn)行顯著性差異分析 （ P < 0.05） 。 采用 Excel 2007 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及繪制圖表， 利用 DNAMAN5.0 及公共網(wǎng)站 （ https：/www.ncbi.nlm. nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)等進(jìn)行序列分析。   2  結(jié)果與分析  2.1  PsUF3GT 和 PsUF5GT 靶片段的克隆和序列分析  根據(jù)上、 下游引物擴(kuò)增的 PsUF3GT 靶片段長(zhǎng)度為 413 bp， 對(duì)推測(cè)編碼的氨基酸序列進(jìn)行 Blast P分析， 與滇牡丹 （ P. delavayi） 同源序列花青苷 3 O糖基轉(zhuǎn)移酶 PdA3GT_AQZ26785 和 PsUF3GT_ ARA67360）相似性為 94%和 89%、與葡萄（ Vitis vinifera， VvUF3GT_BAB41024）和忍冬（ Lonicera japonica， LjA3GT_ALL32290） 同源序列相似性分別為 69%和 66%。 利用在線(xiàn)網(wǎng)絡(luò)軟件 （ http： /prosite. expasy.org/mydomains/）分析，其屬于 Glycosyltransferase_GTB_type 超家族，含有 PSPG 基序（ plant secondary product glycosyltransferase box，圖 1） 。  WLNDQKAESV AYISFGTAAT PPPTEILAIA EALEASGVAF LWSLKDHLNV HLPKGFLDKT RACGMVVPWA PQLQILAHGA VGVFITHCGW NSVLESIGGG VPMICRPFFG DQKLNACMVE DVWEIGVKID GGVFTKN 圖 1  PsUF3GT 靶片段核苷酸推測(cè)編碼的氨基酸序列  下劃線(xiàn)表示 PSPG 基序。  Fig. 1  The deduced amino acid sequences of the target fragment of PsUF3GT Underline indicated plant secondary product glycosyltransferase box（ PSPG-box） . 克隆的 PsUF5GT 靶片段長(zhǎng)度為 418 bp， 與芍藥 （ Paeonia lactiflora， 黃酮醇 5 O糖基轉(zhuǎn)移酶，PlF5GT_AF171902） 和滇牡丹 （ P.  d e l a v a y i， PdF5GT_ARA67364） 同源序列相似性分別為 99%和 71%，與矮牽牛（ Petunia hybrida，花青苷 5 O糖基轉(zhuǎn)移酶， PhA5GT_BAA89009）同源序列相似性為73%。利用在線(xiàn)網(wǎng)絡(luò)軟件（ http： /prosite.expasy.org/mydomains/）分析，其屬于 Glycosyl-transferase_ GTB_type 超家族，其氨基酸在 337 380 處有 UDPG（ UDP-glycosyltransferases）特征序列（圖 2） 。  LEKQGMVVPW CNQLEVLSHK SVGCFLTHCG WNSSLESLVC GVPVVAFPQW ADQATNAKLI EDVWKTGVRM VVNEDGVVEG CEIKRCLEMV MGGGERGEEM RRNVEKWKEL AREAVKDGES SDKNLKAFVN EVGKGGDL * 圖 2  PsUF5GT 靶片段推測(cè)編碼的氨基酸序列  下劃線(xiàn)表示 UDPG 特征序列。  Fig. 2  The deduced amino acid sequences of the target fragment of PsUF5GT Underline indicated UDPG characteristic sequence. 舒慶艷，朱   瑾，門(mén)思琦，郝   青，王倩玉，劉政安，曾秀麗，王亮生 . 基于牡丹類(lèi)黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因建立 VIGS 技術(shù)體系 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (1)： 168 176.                                                                                      173 2.2  VIGS 沉默 UFGTs 體系建立  2.2.1  花瓣中沉默 PsUFGT 后的表達(dá)量  利用所擴(kuò)增保守區(qū)片段長(zhǎng)分別為 413 和 418 bp 的 PsUF3GT 和 PsUF5GT 基因片段構(gòu)建 TRV2載體，用于沉默目的基因。通過(guò)二因素三水平 9 個(gè)試驗(yàn)處理，尋找 UFGT 基因沉默的最佳處理?xiàng)l件，對(duì)沉默后的基因表達(dá)量進(jìn)行分析（表 2） 。  通過(guò)對(duì)不同處理花瓣的斑與非斑中 PsUF3GT 和 PsUF5GT 基因表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)， 9 個(gè)處理中，盛開(kāi)期花瓣經(jīng)過(guò)真空抽濾 15 min（處理 2）沉默 PsUF3GT 基因，其表達(dá)量在斑中降低最多，比對(duì)照空載體盛開(kāi)期花瓣真空抽濾 10 min（處理 1） 、半開(kāi)期花瓣真空抽濾 20 min（處理 6）和蕾期花瓣真空抽濾 15 min（處理 8） ，分別降低了 65.0%、 45.0%和 71.0%，但在非斑中表達(dá)量沒(méi)有顯著降低。蕾期花瓣真空抽濾 10 min 沉默 PsUF5GT 后（處理 7） ，其在非斑中的表達(dá)量降低最多，比處理 8 降低了 85.0%（表 2） 。因此， PsUF3GT 的最佳沉默處理?xiàng)l件是將盛開(kāi)期的花真空抽濾 15 min；而PsUF5GT 的最佳沉默處理?xiàng)l件是將蕾期的花真空抽濾 10 min。  表 2  不同處理沉默 PsUFGT 后牡丹花瓣中的表達(dá)量  Table 2  Relative expression levels of petals after silencing PsUFGT by VIGS treatment 2.2.2  沉默 PsUFGT 后的花斑中花青苷的含量 對(duì) 9 個(gè)處理花斑中花青苷組分和含量進(jìn)行了測(cè)定（表 3） ，檢測(cè)結(jié)果與基因熒光定量結(jié)果基本一致。即：盛開(kāi)期花瓣真空抽濾 15 min（處理 2）和半開(kāi)期花瓣真空抽濾處理 10min（處理 4）后，沉默 PsUF3GT 的花斑中檢測(cè)出的 4 種花青苷總含量比對(duì)照空載體、真空抽濾處理 10 min 后的盛開(kāi)期花斑中總花青苷含量（處理 1）降低了 24.2%，其中降低最多的是 Pn3G 為 20.0%，其次是 Cy3G、  表 3  不同處理沉默 PsUFGT 后牡丹花斑中花青苷成分和含量  Table 3  Anthocyanin component and content of petal blotch after silencing PsUFGT by VIGS treatment 發(fā)育時(shí)期  Stage 抽濾時(shí)間 /min Infiltration 處理  Treatment 靶基因  Target gene 花青苷成分和含量 /（ mg g-1）  Cy3G5G Cy3G Pn3G5G Pn3G 盛開(kāi)期 Blooming 10 1 TRV2 0.26 0.02 a 0.92 0.04 a 0.93 0.04 a 13.68 0.31 a 15 2 TRV2-3GT 0.18 0.06 ab 0.56 0.28 abc 0.71 0.15 ab 10.52 2.36 ab20 3 TRV2-5GT 0.16 0.01 bc 0.63 0.01 ab 0.68 0.03 abc 10.04 0.37 b 半開(kāi)期 Semi-blooming 10 4 TRV2-3GT 0.05 0.01 d 0.46 0.02 bc 0.79 0.11 ab 4.92 0.18 cd 15 5 TRV2-5GT 0.08 0 cd 0.38 0.02 bc 0.59 0.08 bcd 5.91 0.84 c 20 6 TRV2 0.02 0 d 0.34 0.02 bc 0.54 0.04 bcd 1.88 0.06 d 蕾期 Bud 10 7 TRV2-5GT 0.02 0 d 0.17 0.01 c 0.28 0.01 d 1.53 0 d 15 8 TRV2 0.03 0.01 d 0.25 0.07 bc 0.37 0.08 cd 1.90 0.44 d 20 9 TRV2-3GT 0.03 0 d 0.39 0.06 bc 0.63 0.09 abc 2.82 0.37 cd 發(fā)育時(shí)期  Stage 抽濾時(shí)間 /min Infiltration  處理  Treatment 靶基因  Target gene PsUF3GT 表達(dá)量  PsUF5GT 表達(dá)量  斑 Blotch 非斑 Non-blotch 斑 Blotch 非斑 Non-blotch盛開(kāi)期 Blooming 10 1 TRV2 1.00 0.07 cd 1.00 0.10 cd 1.00 0.01 b 1.01 0.16 b 15 2 TRV2-3GT 0.35 0.06 f 1.23 0.23 c 1.00 0.13 b 0.91 0.07 bc 20 3 TRV2-5GT 1.32 0.04 b 3.24 0.27 a 1.41 0.12 a 1.10 0.12 b 半開(kāi)期 Semi-blooming 10 4 TRV2-3GT 1.76 0.15 a 1.48 0.10 bc 0.29 0.01 d 0.51 0.05 bc 15 5 TRV2-5GT 0.79 0.09 de 1.99 0.33 b 0.54 0.05 c 1.20 0.05 b 20 6 TRV2 0.64 0.03 e 1.02 0.09 cd 0.24 0.02 d 0.21 0.02 c 蕾期 Bud 10 7 TRV2-5GT 1.69 0.11 a 2.72 0.20 a 0.72 0.05 c 0.85 0.08 bc 15 8 TRV2 1.21 0.11 bc 0.43 0.23 d 0.17 0.03 d 5.67 0.37 a 20 9 TRV2-3GT 1.10 0.12 bc 0.91 0.17 cd 0.35 0.01 d 1.00 0.59 b Shu Qingyan， Zhu Jin， Men Siqi， Hao Qing， Wang Qianyu， Liu Zhengan， Zeng Xiuli， Wang Liangsheng. Establishing virus induced gene silencing（ VIGS） system in tree peony using PsUFGT genes. 174                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 168 176. Pn3G5G、 Cy3G5G，分別為 2.3%、 1.4%和 0.1%； 3G 型糖苷降低了 92.2%， 3G5G 型降低了 7.8%。利用蕾期花瓣真空抽濾 10 min 沉默 PsUF5GT（處理 7） ，其斑中檢測(cè)出的 4 種花青苷總含量比對(duì)照空載體真空抽濾 15 min 的蕾期花斑（處理 8）中降低了 28.2%，其中降低最多的是 Pn3G 為 12.5%，其次是 Pn3G5G、 Cy3G5G、 Cy3G 分別降低了 9.3%、 6.1%和 0.01%；其中 3G5G 型糖苷比對(duì)照（處理 8）降低了 54.9%，而 3G 型糖苷降低了 45.1%。  3  討論  影響 VIGS 沉默效果的因素很多。首先是沉默基因片段長(zhǎng)度和位置的選擇，前人研究結(jié)果表明3