園藝學報， 2018， 45 (3)： 530 540. Acta Horticulturae Sinica   530                                                   doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0343； http： /www. ahs. ac. cn 收稿日期 ： 2017 09 01； 修回日期 ： 2018 03 05 基金項目 ： 國家自然科學基金項目（ 31260484） ；云南省科技人才和平臺計劃項目（ 2017HB083） ；云南省科技創(chuàng)新人才計劃科技領軍人才項目（ 2016HA005） ；國家高技術研究發(fā)展計劃“ 863”項目（ 2011AA100208）  * 通信作者  Author for correspondence（ E-mail： ynfh2007163.com， wjh0505gmail.com）  百合抗病無性系抗枯萎病的蛋白質組學分析  張藝萍1,2，瞿素萍2，楊秀梅2，馬璐琳2，許  鳳2，王繼華2,*，何月秋1,*（1云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，昆明  650205；2云南省農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所，國家觀賞園藝工程研究中心，云南省花卉育種重點實驗室，云南省花卉工程技術研究中心，昆明  650205）  摘  要： 以百合抗病無性系和感病無性系為試驗材料，開展了百合抗尖孢鐮刀菌枯萎病的蛋白質組學研究，以期明確抗病無性系參與抗病反應的關鍵蛋白。利用蛋白質雙向凝膠電泳技術，對被百合尖孢鐮刀菌誘導 0、 24、 48 和 72 h 的抗病無性系和感病無性系進行差異蛋白分析。經(jīng)質譜檢測及數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定了 25 個差異蛋白質點，其中 10 個鑒定為未知功能的蛋白，其余 15 個依據(jù)其相關功能分為 4 類，即防御反應相關蛋白、光合作用相關蛋白、糖類及能量代謝相關蛋白和熱激蛋白。其中參與防御反應的病程相關蛋白（推定的抗病蛋白 RPS2、推定的抗晚疫病同族蛋白 R1C-3、過氧化物酶 Q、抗壞血酸過氧化物酶和 NBS-LRR 類似蛋白）可能是百合抗病無性系介入抗病防御反應的關鍵蛋白。  關鍵詞： 百合；總蛋白提?。浑p向電泳；尖孢鐮刀菌百合?；?；差異蛋白質組  中圖分類號： S 682.2       文獻標志碼： A        文章編號： 0513-353X（ 2018） 03-0530-11 Proteomics Analysis of Lily Blight Disease-resistant Clones  ZHANG Yiping1,2， QU Suping2， YANG Xiumei2， MA Lulin2， XU Feng2， WANG Jihua2,*， and HE Yueqiu1,*（1College of Plant Protection， Yunnan Agricultural University， Kunming 650205， China；2 Flower Research Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences， National Engineering Research Center for Ornamental Horticulture， Yunnan Flower Breeding Key Laboratory， Yunnan Flower Engineering Center， Kunming 650205， China）  Abstract： To elucidate the key proteins related to disease-resistance of lily induced by Fusarium oxysporum f. sp. lilii， protein two-dimensional gel electrophoresis technology was used to analyze profiles of the disease-resistant and susceptible clones after inoculation of Fusarium oxysporum f. sp. lilii for 0，24， 48 and 72 h. Tweenty-five differentially expressed proteins were successfully identified， including 10 differentially expressed proteins identified as unknown function proteins. The rest of the 15 differentially expressed proteins can be categorized into 4 classes according to the function， namely the defense reaction， photosynthesis， carbohydrate and energy metabolism， and heat shock-related proteins. The disease related proteins participated in the defense reaction including presumption of disease-resistant protein RPS2， putative late blight resistant protein homolog R1C-3， peroxidase Q， ascorbate peroxidase and NBS-LRR-like protein， which may play key roles in the resistance against lily blight. Keywords： lily； protein extraction； two-dimensional electrophoresis； Fusarium oxysporum f. sp. lilii；differential proteomics 張藝萍，瞿素萍，楊秀梅，馬璐琳，許   鳳，王繼華，何月秋 . 百合抗病無性系抗枯萎病的蛋白質組學分析 . 園藝學報， 2018， 45 (3)： 530 540.                                                                                     531 尖孢鐮刀菌百合專化型（ Fusarium oxysporum f. sp. lilii）是引起百合枯萎病的土傳真菌，很難有效防治（ van Heusden et al.， 2002； Lim et al.， 2005），選育和利用抗病品種成為主要的防治措施。采用蛋白質雙向電泳技術來挖掘百合的抗病相關蛋白，可為百合抗病細胞工程育種提供理論依據(jù)。  當植物受到病原菌侵害時，植物將改變體內(nèi)蛋白質的表達來完成信號的感應和傳遞，引起植物相應的反應機制。所以病害的發(fā)生和抗病性的形成與蛋白質的數(shù)量和功能的改變密切相關。病原菌是誘發(fā)寄主植物發(fā)病的主要生物脅迫因子。以往關于模式植物抗病分子機制研究表明，植物受病原菌脅迫時，體內(nèi)先天免疫受體（即抗病蛋白）會識別病原菌效應因子，引發(fā)寄主抗病反應，實現(xiàn)對病原菌脅迫信號的響應、傳遞以及生物學防御（ Volk et al.， 2008； Bednarek & Osbourn， 2009； Soh et al.， 2012） 。理永霞（ 2011）利用蛋白質雙向電泳技術研究了楊樹與潰瘍病菌的互作機制，鑒定出606 個差異蛋白，其中 18 個是植物與病原菌互作相關蛋白， 10 個是過氧化蛋白， 31 個是苯丙氨酸合成代謝相關蛋白。高巍（ 2014）利用蛋白質雙向電泳技術研究了棉花響應黃萎病菌的分子機制，共得到 188 個差異蛋白，其中參與細胞過程、代謝過程和應激反應的蛋白數(shù)量最多，這些蛋白共同參與了棉花對黃萎病菌入侵的響應。王曉清（ 2014）利用蛋白質雙向電泳技術研究了擬南芥抗病突變體 cpr30 的抗病機制，鑒定出了 33 個差異蛋白點，這些差異表達蛋白包括防御相關蛋白、氧化還原相關蛋白、能量代謝相關蛋白、信號轉導相關蛋白等。  目前，關于百合枯萎病的研究主要集中于防治方法、 病原菌鑒定、 種質資源抗性評價等方面 （張麗麗， 2013；魏志剛， 2014；羅建讓和謝松林， 2015） 。有關百合抗病機制的研究報道較少（饒建，2013） 。前期通過百合尖孢鐮刀菌毒素加壓篩選獲得了百合抗病性無性系（ Zhang et al.， 2014） ，為揭示其抗性機制，開展了百合抗病無性系和感病無性系的差異蛋白質組研究，通過對抗性相關蛋白的差異表達分析，可從分子水平直接了解百合抗病無性系所啟動的抗性機制。  1  材料與方法  1.1  植物材料和取樣方法  供試菌種百合枯萎病菌和東方百合品種卡薩布蘭卡抗病無性系和感病無性系均來自本實驗室， 2014 年反復篩選并經(jīng)過抗性鑒定獲得?？ㄋ_布蘭卡抗病無性系為中抗，病情指數(shù)為 28。本試驗在 2015 2016 年在云南省農(nóng)業(yè)科學院花卉育種重點實驗室進行。 取抗病無性系和感病無性系生長健壯、長勢一致的組培生根苗，以 1 106個   mL-1（含 0.01%吐溫 20，體積比）百合尖孢鐮刀菌孢子懸浮液浸泡組培苗根部（根部切去一部分以便創(chuàng)造傷口） ， 25 下光照 12 h/黑暗 12 h 交替培養(yǎng)。分別于接種前和接種后 24、 48 和 72 h 隨機選取 9 株組培苗的葉片，液氮固定后于 80 冰箱保存?zhèn)溆?，?3 株作為 1 個重復，共 3 次重復。  1.2  百合葉片總蛋白提取   采用三氯乙酸（ TCA）丙酮法提取蛋白質（ Blacks & Wei， 1999）。準確稱取東方百合品種卡薩布蘭卡抗病無性系和感病無性系、接種百合枯萎病菌后 24 和 48 h 的百合葉片各 2 g，于液氮中迅速研磨成粉末。取 20 mL 10%三氯乙酸丙酮溶液（含 1%苯甲基磺酰氟和 1 mg mL-1二硫蘇糖醇） ， 將研缽內(nèi)粉狀物清洗至 50 mL 離心管中， 迅速置于 20 冰箱中保存過夜； 而后 20 000 r min-1離心 20 min； 棄上清液； 量取 20 mL 80%的預冷丙酮溶液 （含 1%苯甲基磺酰氟和 1 mg mL-1二硫蘇糖醇）加入離心管中，振蕩后于 20 冰箱中放置 2 h，使蛋白質沉降； 4 ， 20 000 r min-1Zhang Yiping， Qu Suping， Yang Xiumei， Ma Lulin， Xu Feng， Wang Jihua， He Yueqiu. Proteomics analysis of lily blight disease-resistant clones. 532                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 530 540. 離心 15 min，棄上清液；重懸沉淀于等體積 80%的預冷丙酮溶液各洗滌 2 次； 4 ， 15 000 r min-1離心 15 min；沉淀進行真空冷凍干燥后，置于 80 超低溫冰箱中保存。  1.3  蛋白質樣品溶解與定量  將 450 L 裂解液（ 7 mol L-1尿素， 2 mol L-1硫脲， 40 mg mL-1 CHAPS， 65 mmol L-1DTT和 0.2% Bio-Lyte）加入到 30 mg 蛋白干粉中，裂解 1 h； 4 ， 12 000 r min-1離心 15 min，上清液中加入 1 600 2 000 L 無水丙酮（含 1 mg mL-1二硫蘇糖醇） ，邊加邊搖勻， 20 冰箱中放置2 h， 4 ， 15 000 r min-1離心 30 min，棄上清液；加入 1 mL 4 預冷的超純水（含 1 mg mL-1二硫蘇糖醇） ， 4 ， 15 000 r min-1離心 25 min，棄上清液；加入 7 mol L-1水化液（含 0.2%載體兩性電解質和 0.1 mg mL-1二硫蘇糖醇） 150 200 L。蛋白質的定量參考 Bradford 的方法進行測定（ Gurusamy & Christof， 2006） 。  1.4  雙向電泳  第一向等點聚焦選用 11 cm 非線性 pH 4 7 的 IPG 膠條（ Bio-Rad 公司） 。蛋白樣品溶液中加入水化緩沖液（ 2 mol L-1的硫脲， 7 mol L-1的尿素， 40 mg mL-1的 CHAPS， 10 mg mL-1的 DTT，0.4%的 Bio-Lyte 和 0.001%溴酚藍）至終體積 300 L，蛋白樣品上樣量為 600 g； 20 下按 Bio-Rad 公司提供的等電聚焦程序設定后聚焦。聚焦完畢，將 IPG 膠條放入平衡液（ 6 mol L-1尿素， 20 mg mL-1SDS， 0.375 mol L-1 pH 8.8 Tris-HCl， 20%甘油， 10 mg mL-1DTT）中并置于搖床上， 30 40 r min-1，搖動 15 min，隨后再放入平衡液（ 6 mol L-1 的尿素， 20 mg mL-1的 SDS， 0.375 mol L-1pH 8.8 Tris-HCl， 20%甘油， 5%碘乙酰胺）中并置于搖床上， 30 40 r min-1，搖動 15 min，平衡結束后進行第二向凝膠電泳。將平衡好的 IPG 膠條推進 12.5%的聚丙烯酰胺凝膠上，使用Bio-Rad PROTEAN XL/PowerPac（ 11 cm IPG 膠條）的電泳系統(tǒng)進行電泳， 11 的循環(huán)水冷卻；開始時電壓設置為每板 100 V（ Bio-Rad PROTEAN XL/PowerPac） ，當溴酚藍完全進入凝膠后加大電壓為每板 400 V（ Bio-Rad PROTEAN XL/PowerPac） ，待溴酚藍跑至聚丙烯酰胺凝膠底部的距離為 0.5 cm 時，終止電泳（李勤， 2011） 。  1.5  染色及圖像采集分析  凝膠先用固定液（ 40%乙醇和 10%乙酸）固定 1 3 h，用超純水清洗 2 次，再用染色液（ 100 mg mL-1硫酸銨， 10%磷酸， 0.12 mg mL-1G-250， 20%甲醇）染色 1 d，而后用超純水漂洗后再用脫色液（ 50 mg mL-1硫酸銨， 10%甲醇）脫色，直到背景干凈，蛋白質點清晰為止。采用伯樂蛋白質掃描儀（ Bio-Rad GS900）掃描凝膠圖像（分辨率為 300 dpi） ，用 Bio-Rad 的 PD Quest 8.0 軟件進行凝膠電泳圖譜的斑點檢測。  1.6  差異蛋白點酶解處理及質譜分析  將差異表達蛋白點從凝膠上切下來，通過膠內(nèi)原位酶解方法，抽提酶解肽段，再經(jīng)過 Zip Tip脫鹽、酶解液真空濃縮等完成酶解處理（張彩霞  等， 2015）。濃縮后的酶液用 ABI 4800 MALDI TOF/TOF 串聯(lián)飛行時間質譜儀（ Applied Biosystems， Foster City， CA）進行肽指紋圖譜（ PMF）鑒定。質譜操作采用正離子反射模式，質譜分析使用標準肽混合物 904.458， Gradykinin； 1296.685，Angiotensin； 1570.677 Glul-Fibrinopeptide； 2093.08， ACTH（ 1-17）； 2465.199， ACTH（ 18-39）；3657.929， ACTH（ 7-38）（ ABI4700 Calibration Mixture）作為外標校正，每個樣品質譜信號累張藝萍，瞿素萍，楊秀梅，馬璐琳，許   鳳，王繼華，何月秋 . 百合抗病無性系抗枯萎病的蛋白質組學分析 . 園藝學報， 2018， 45 (3)： 530 540.                                                                                     533 計掃描 600 800 次，掃描范圍為 800 4 000 D 得到鑒定蛋白的肽指紋圖譜。從一級質譜的肽質量指紋圖譜中選擇信噪比（ S/N）大于 50 的 7 個得分最高的前體離子做 MS/MS 分析，質譜信號累計掃描 900 1 200 次，得到其序列信息，對一級質譜鑒定的蛋白質進行進一步確認。  1.7  數(shù)據(jù)庫檢索  酶解樣品經(jīng)過質譜檢測后得到 PMF 圖譜數(shù)據(jù)， 從 GPS Explorer 軟件 （ V3.6， Applied Biosystems）得到 MS 和 MS/MS 的數(shù)據(jù)，然后進行 NCBI 數(shù)據(jù)庫搜庫。搜庫的參數(shù)設置如下：種類 all species，切割酶 Trypsin，允許最大未酶切位點（ Missed cleavage）數(shù)為 1，部分修飾為 cysteine carboamido methylated 和 methionine oxidized，無固定修飾。 MS 的誤差 150 200 mg mL-1， MS/MS 的誤差為0.2 0.3 D， 去除已知污染物 keratin。 得分 （ MS 和 MS/MS 聯(lián)合） 超過 65 被認為超過閾值 （ P  0.05） ，為可信的鑒定結果。  1.8  鑒定蛋白質不同時間點的表達  從鑒定出的蛋白質中選取與抗病性緊密相關的蛋白質，并以百合感病無性系為對照，計算其在百合抗病無性系中 24、 48 和 72 h 的表達倍數(shù)。  2  結果與分析  2.1  百合抗病無性系和感病無性系接種尖孢鐮刀菌后的癥狀表現(xiàn)  百合抗病無性系和感病無性系接種尖孢鐮刀菌 7 d 后，抗病無性系僅見輕微的癥狀，小鱗莖基部稍發(fā)褐， 而感病無性系則發(fā)生明顯的枯萎病癥狀，葉片萎蔫，小鱗莖基部褐化， 并見白色菌絲 （圖 1） 。  圖 1  百合抗病無性系和感病無性系接種尖孢鐮刀菌后的癥狀  Fig. 1  Symptom induced by Fusarium oxysporum f. sp. lilii in disease-resistant and susceptible clones 2.2  百合抗病無性系和感病無性系的雙向電泳圖譜分析  對抗病無性系和感病無性系及其接種尖孢鐮刀菌后 24、 48 和 72 h 的葉片總蛋白進行分析，經(jīng)雙向電泳分離后獲得清晰的蛋白質表達譜（圖 2）。  Zhang Yiping， Qu Suping， Yang Xiumei， Ma Lulin， Xu Feng， Wang Jihua， He Yueqiu. Proteomics analysis of lily blight disease-resistant clones. 534                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 530 540. 圖 2  百合抗病無性系和感病無性系接菌不同時間點蛋白質雙向電泳圖  Fig. 2  Separation 2-D profiles of lily disease-resistant and susceptible clones for different time inoculated by Fusarium oxysporum f. sp. lilii 張藝萍，瞿素萍，楊秀梅，馬璐琳，許   鳳，王繼華，何月秋 . 百合抗病無性系抗枯萎病的蛋白質組學分析 . 園藝學報， 2018， 45 (3)： 530 540.                                                                                     535 4 組凝膠圖譜經(jīng) PD Quest 2-D Analysis Software 8.0 軟件分析，每張圖譜上均有 800 個以上可重復清晰蛋白點被檢測到， 蛋白點主要分布在 pH 4 7， 分子量為 10 000 150 000 D 的區(qū)域內(nèi)。  通過 PD Quest 軟件計算蛋白點相對豐度的變化，可初步獲得差異表達的蛋白點。 4 組圖譜差異分析結果顯示，有 25 個蛋白質點發(fā)生變化（相對體積增加或者降低   1.5 倍）。  2.3  差異蛋白質點質譜分析及功能鑒定  對檢驗出的 25 個差異蛋白點進行質譜（ MALDI-TOF/TOF MS）分析，根據(jù)各蛋白點鑒定所得PMF 圖譜數(shù)據(jù)，去除雜峰后，進入蛋白質數(shù)據(jù)庫進行匹配檢索。在鑒定的差異蛋白中共包括 4 個下調(diào)蛋白和 21 個上調(diào)蛋白（圖 3，表 1）。  圖 3  百合抗病無性系和感病無性系接種尖孢鐮刀菌后  0、 24、 48 和 72 h 差異蛋白點表達圖譜放大圖  Fig. 3  Enlarged views of differential protein spots of lily disease-resistant and susceptible clones for  0， 24， 48 and 72 h inoculated by Fusarium oxysporum f. sp. lilii Zhang Yiping， Qu Suping， Yang Xiumei， Ma Lulin， Xu Feng， Wang Jihua， He Yueqiu. Proteomics analysis of lily blight disease-resistant clones. 536                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 530 540. 表 1  通過質譜和數(shù)據(jù)庫搜索鑒定出來的差異蛋白點  Table 1  Identification of differential proteins of lily disease-resistant clone and susceptible clone with MALDI-TOF/TOF and database searching 斑點編號  Spot No.  蛋白名稱  Protein name 登錄號  Accession No. 蛋白分子量 /等電點Protein MW/pI 物種  Species 蛋白得分  Protein  score 可能的功能  Possible function S1 二磷酸核酮糖羧化 /加氧酶  Ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activase gi|134035003 15 036.4/4.35 花生  Arachis hypogaea 204 光合作用  Phytosynthesis S2 未知 Unknown gi|217072704 29 191.6/4.7 蒺藜狀苜蓿  Medicago truncatula 57 未知蛋白  Unknown protein S3 未知蛋白 Uncharacterized  protein LOC100286153 gi|226531522 84 417.3/5.85 玉米  Zea mays 157 未知蛋白  Unknown protein S4 琥珀酸脫氫酶  Succinate dehydrogenase gi|255579273 68 462.8/6.18 蓖麻  Ricinus communis 49 三羧酸循環(huán)代謝  TCA metabolic A1 代謝轉運超級家族  Drug/Metabolite transporter  superfamily gi|303277003 37 909.1/10.07 微胞藻  Micromonas pusilla CCMP1545 51 能量代謝  Energy metabolismA2 假設蛋白 Hypothetical  protein VITISV_001216 gi|147804938 97 671.3/6.12 葡萄 Vitis vinifera 43 未知蛋白  Unknown protein A3 假設蛋白  Hypothetical protein OsI_04745 gi|125528674 102 532.4/6.35 秈稻 Oryza sativa  Indica Group 64 未知蛋白  Unknown protein A4 預測蛋白  Predicted protein gi|224094841 50 820.5/6.4 毛果楊  Populus trichocarpa 51 未知蛋白  Unknown protein A5 放氧增強蛋白 1 Oxygen-evolvingenhancer protein 1， chloroplasticgi|11133881 34 847.8/6.26 田野貝母  Fritillaria agrestis 247 光合作用  Photosynthesis A6 抗病蛋白 RPS2 Disease resistant protein RPS2 gi|255581680 128 309.3/5.84 蓖麻  Ricinus communis 54 防御反應  Defense response A7 熱激蛋白  Heat shock protein gi|255545176 80 723.1/ 4.99 蓖麻  Ricinus communis 164 保護反應  Protect response A8 預測蛋白  Predicted protein gi|326490934 48 201.4/5.39 青稞 Hordeum vulgare  subsp. vulgare 61 未知蛋白  Unknown protein A9 二磷酸核酮糖羧化酶 /加氧酶大  亞基結合蛋白 Rubisco large  subunit-binding protein subunit  beta， chloroplastic gi|2506277 62 945.3/5.85 豌豆 Pisum sativum 226 光合作用  Phytosynthesis A10 假設蛋白  Hypothetical protein gi|50726121 15 823.1/11.7 粳稻 Oryza sativa  Japonica Group 58 未知蛋白  Unknown protein B1 假設蛋白 Hypothetical protein OsJ_11623 gi|222625312 65 595.5/9.68 粳稻 Oryza sativa  Japonica Group 60 未知蛋白  Unknown protein B2 推定抗晚疫病蛋白同族 R1C-3 Putative late blight resistant  protein homolog R1C-3 gi|75261520 149 682.2/5.84 馬鈴薯野生種  Solanum demissum 43 防御反應  Defense response B3 熱激蛋白  Heat shock protein 90 gi|260505494 90 303.7/4.92 牽牛花  Ipomoea nil 121 保護反應  Protect response B4 Os07g0136500 gi|297606704 13 014.7/10.88 粳稻 Oryza sativa  Japonica Group 51 未知蛋白  Unknown protein B5 過氧化物酶  Peroxiredoxin Q gi|215254425 23 574.1/9.37 海篷子  Salicornia herbacea 66 防御反應  Defense response B6 熱激蛋白  Heat shock protein 70 gi|189380223 75 068.5/5.54 茶樹  Camellia sinensis 193 保護反應  Protect response C1 假設蛋白 Hypothetical protein  CHLNCDRAFT_20689 gi|307109747 14 424.3/7.04 小球藻  Chlorella variabilis 60 未知蛋白  Unknown protein C2 推定的烏頭酸水合酶  Putative aconitate hydratase，cytoplasmic gi|75225211 98 020.6/5.67 粳稻 Oryza sativa  Japonica Group 54 糖類代謝  Carbohydrate metabolism C3 抗壞血酸過氧化物酶  Ascorbate peroxidase gi|223931154 27 282.7/5.21 五唇蘭   蝴蝶蘭的雜交種 Doritis pulcherrima Phalaenopsis hybrid 160 防御反應  Defense response C4 推定的乙烯反應蛋白 Putative ethylene-responsive protein gi|21536534 18 726.4/5.59 擬南芥  Arabidopsis thaliana 45 防御反應  Defense response C5 NBS-LRR 類似蛋白  NBS-LRR-like protein gi|332002196 19 088.0/8.65 山荊子 Malus baccata 50 防御反應  Defense response 張藝萍，瞿素萍，楊秀梅，馬璐琳，許   鳳，王繼華，何月秋 . 百合抗病無性系抗枯萎病的蛋白質組學分析 . 園藝學報， 2018， 45 (3)： 530 540.                                                                                     537 將所鑒定的蛋白點進行數(shù)據(jù)庫檢索及相關的文獻查閱，共獲得 25 個蛋白質點的功能信息。其中 10 個蛋白質點鑒定為未知功能蛋白（ S2、 S3、 A2、 A3、 A4、 A8、 A10、 B1、 B4、 C1），其余15 個依據(jù)其相關功能分為 4 類。防御反應相關蛋白共包括 6 個，即推定的抗病蛋白 RPS2（ A6）、推定的晚疫病同族蛋白 R1C-3（ B2）、過氧化物酶 Q（ B5）、抗壞血酸過氧化物酶（ C3）、推定的乙烯反應蛋白（ C4）和 NBS-LRR 類似蛋白（ C5），呈明顯上調(diào)表達。光合作用相關蛋白（ S1、 A5、A9）除了二磷酸核酮糖羧化加氧酶（ S1）下調(diào)表達外，其他 2 個蛋白均呈明顯上調(diào)表達。鑒定獲得3 個糖類及能量代謝相關蛋白（ S4、 A1、 C2），均呈上調(diào)表達。此外，還鑒定得到 3 個熱激蛋白（ A7、B3、 B6），均呈下調(diào)表達。  2.4  百合受尖孢鐮刀菌侵染后的蛋白質差異表達  對差異蛋白 A6、 B5 和 C5 的分析發(fā)現(xiàn)，三者在百合抗病無性系中的表達量均比在感病無性系中高，呈上調(diào)表達， A6 在抗病無性系中的表達量隨著時間的延長而增加； B5 在抗病無性系中的表達量呈先上升后降低的趨勢； C5 在抗病無性系中的表達量隨著時間的延長而降低（圖 4，表 2）。  圖 4  差異蛋白 A6、 B5、 C5 在百合抗病無性系和感病無性系中不同時間的表達  Fig. 4  The A6， B5 and C5 expression of differential time points in lily disease-resistant and susceptible clones 表 2  相對于感病無性系 A6、 B5 和 C5 在百合抗病無性系中不同時間點的表達  Table 2  The A6， B5 and C5 expression of differential time points in lily disease-resistant clones  蛋白點 Protein 24 h 48 h 72 h A6 + 2.6 + 2.0 + 1.8 B5 + 2.5 + 3.7 + 1.6 C5 + 2.7 + 2.5 + 2.4 注： + 表示增量。  Note： + Indicates increment. Zhang Yiping， Qu Suping， Yang Xiumei， Ma Lulin， Xu Feng， Wang Jihua， He Yueqiu. Proteomics analysis of lily blight disease-resistant clones. 538                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 530 540. 3  討論  3.1  光合作用和能量代謝相關蛋白參與百合的防衛(wèi)反應  病原菌的侵入對寄主植物最明顯的影響就是干擾其光合作用（ Christelle et al.， 2017）。 Rubisco是卡爾文循環(huán)中的關鍵酶之一。有學者經(jīng)過分析外源 JA 誘導下馬鈴薯葉片蛋白質組的變化，發(fā)現(xiàn)其中兩個 Rubisco 蛋白表現(xiàn)為下調(diào)表達（楊艷麗， 2010）。還有學者證明了 Rubisco 可因活性氧的產(chǎn)生而受到抑制，從而表現(xiàn)下調(diào)表達（ Chen et al.， 2013）。本研究中通過分析百合抗病無性系和感病無性系的差異蛋白質，鑒定獲得了 3 個與光合作用相關的蛋白。其中兩個為 Rubisco（ S1、 A9）的蛋白質， S1 的表達量表現(xiàn)為下調(diào)，而 A9 的表達量表現(xiàn)為上調(diào)，這可能與百合抗病無性系植株細胞內(nèi)復雜的防衛(wèi)反應有關。  本研究鑒定獲得 4 個糖類代謝及能量代謝相關的蛋白，有 2 個蛋白（ S4、 A10）參與三羧酸循環(huán)， 1 個蛋白（ A1）參與代謝轉運， 1 個蛋白（ C2）參與碳水化合物的代謝，均呈現(xiàn)明顯上調(diào)表達。這就表明百合抗病無性系植株可能是通過調(diào)控能量代謝途徑，從而為完成抗病反應提供物質能量。  3.2  防衛(wèi)反應相關蛋白是抗病的關鍵因素  病程相關（ pathogenesis-related， PR）蛋白是寄主植物中普遍存在的一類具有廣譜抗病性的可溶性蛋白（ Gloria et al.， 2013），病程相關蛋白主要有 1,3葡聚糖酶（ PR-2）、幾丁質酶（ PR-3）、過氧化物酶類（ PR-9）、過敏反應相關的 PR 蛋白（ PR-10）（ Loon et al.， 2006； I