北京、山東和廣東黃瓜病毒檢測.pdf
北京、山東和廣東黃瓜病毒檢測 史利雪 張圣平 苗 晗 薄凱亮 謝 慶 王 燁 顧興芳 * (中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所,北京 100081) 摘 要:采集北京順義和昌平、山東壽光及廣東深圳等地田間感染病毒病的黃瓜材料 284 份,利用黃瓜花葉病毒(CMV) 、 西瓜花葉病毒(WMV) 、小西葫蘆黃花葉病毒(ZYMV) 、黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)及番木瓜環(huán)斑病毒(PRSV)5 種 黃瓜病毒抗體采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法對其進(jìn)行病毒病種類鑒定。結(jié)果表明,順義和昌平采集到的 126 份和 124 份病 毒樣品,均在其葉片上檢測到 CMV、WMV、ZYMV 3 種病毒,其中 CMV 檢出率最高,均為 100.00%;其次是 ZYMV,檢出 率分別為 80.95% 和 66.94%;WMV 檢出率最低,分別為 51.59% 和 53.23%;在感病果實(shí)上只檢測到 CMV。在壽光采集的 28 份發(fā)病葉片中,檢測到 CMV、WMV、ZYMV、PRSV 4 種病毒,其檢出率分別為 100.00%、35.71%、35.71%、17.86%。在深 圳采集的 6 份黃瓜感病材料中,檢測到 CMV、WMV、PRSV 3 種病毒,其檢出率分別為 100.00%、50.00%、50.00%。調(diào)查結(jié) 果還發(fā)現(xiàn),在北京順義和昌平、山東壽光及廣東深圳均存在 2 種或 2 種以上病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象。 關(guān)鍵詞:黃瓜;病毒??;ELISA 檢測;病毒鑒定 表明,在自然條件下侵染葫蘆科作物的病毒至少 有 59 種。 目前,在國內(nèi)發(fā)現(xiàn)侵染黃瓜的病毒主要有: 西瓜花葉病毒(WMV) 、黃瓜花葉病毒(CMV) 、 小西葫蘆黃花葉病毒(ZYMV) 、番木瓜環(huán)斑病毒 (PRSV) 、黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV) 、南瓜 花葉病毒(SqMV)和瓜類褪綠黃化病毒(CCYV) 等(古勤生 等,2003; 陳紅運(yùn) 等,2006; 青玲 等, 2010;Gu et al.,2011) 。 李 淑 菊 等(2003) 利 用 RT-PCR 技術(shù)對天津 98 份黃瓜病毒病樣本進(jìn)行病 毒種類檢測,結(jié)果表明,天津地區(qū)黃瓜主要毒原種 類有 CMV、WMV、煙草花葉病毒(TMV)3 種, 且 CMV 檢出率最高,存在病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象。文 朝慧和南志標(biāo)(2013)對甘肅省河西地區(qū)瓜類作物 病毒病進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)該地區(qū)瓜類病毒病主要病原 為 WMV、CMV、ZYMV 和 PRSV,自然條件下常發(fā) 生復(fù)合侵染。熊艷等(2017)采用 RT-PCR 法對采 自重慶地區(qū)的黃瓜病毒病樣品進(jìn)行病毒種類檢測, 檢測到 CMV、WMV、ZYMV、SqMV 和蕪菁花葉病 毒(TuMV)5 種病毒,且為 4 種病毒以上的復(fù)合 侵染。 到目前為止,關(guān)于黃瓜主要病毒種類的檢測 仍然不夠系統(tǒng),這給生產(chǎn)上防治黃瓜病毒病帶來困 史利雪 ,女 ,碩士研究生 ,專業(yè)方向 :蔬菜遺傳育種 , E - m a i l : 2296228223qq.com * 通訊作者(Corresponding author) : 顧興芳,女,研究員,碩士生導(dǎo)師, 專業(yè)方向:蔬菜遺傳育種,E-mail:guxingfangcaas.cn 收稿日期:2017-12-01;接受日期:2018-03-06 基金項(xiàng)目:國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-23-A) ,中國農(nóng)業(yè) 科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目(CAAS-ASTIP-IVFCAAS) ,農(nóng)業(yè)部園藝作 物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目 黃瓜(Cucumis sativus L.)是我國重要的保護(hù) 地栽培蔬菜之一。近年來,病毒病已成為影響黃瓜 生產(chǎn)的重要病害,黃瓜受到病毒侵染后,早期心葉 出現(xiàn)明脈,逐漸引起花葉和重花葉,嚴(yán)重時葉片皺 縮畸形,有的果實(shí)呈螺旋狀扭曲,果面凹凸不平, 果肉僵硬且苦澀,產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重降低(周健, 2012;田桂麗,2015) 。 關(guān)于侵染葫蘆科作物病毒病的各種病毒種類, Lovisolo(1980)首次報(bào)道了侵染葫蘆科作物的病 毒有 25 種。國際病毒分類委員會(ICTV)在第七 次分類報(bào)告中指出,經(jīng)確認(rèn)的能侵染葫蘆科作物 的病毒有 38 個確定種、9 個暫定種和 1 個類病毒 確定種(古勤生 等,2002) 。顧興芳等(2005)報(bào) 道了從瓜類作物上分離和鑒定的病毒有 28 種,侵 染 黃 瓜 的 主 要 有 7 種。Romay 等(2014) 的 研 究 48 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點(diǎn) 產(chǎn)業(yè)市場 病蟲防控 48 研究論文 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 2018(4) :48 - 52 難。本試驗(yàn)在北京順義和昌平、山東壽光及廣東深 圳地區(qū)采集了284份黃瓜病毒病樣本,并采用酶聯(lián) 免疫吸附(ELISA)法對病毒樣本進(jìn)行鑒定,從而 確定這些地區(qū)黃瓜病毒病的發(fā)病情況和毒原種類, 為病毒病的防治和抗病育種工作提供依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 樣品采集 本試驗(yàn)于2017年分別在北京順義和昌平地 區(qū)、山東壽光、廣東深圳等黃瓜生產(chǎn)田,采集具有 病毒病癥狀的黃瓜幼嫩葉片和果實(shí)作為樣品,將采 集后的樣品放入冰盒中,帶回實(shí)驗(yàn)室放入-70 冰 箱保存?zhèn)溆谩?1.2 病毒病的ELISA檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法對黃瓜葉片 的病毒種類進(jìn)行檢測。購買了5種常見黃瓜病毒 病ELISA試劑盒,分別為WMV、CMV、ZYMV、 PRSV、CGMMV。具體操作步驟如下: 包被抗體:取包被抗體加入包被緩沖液 (Coat Buffer),混合,吸取100 L孔 -1 抗體溶 液于微孔板,酶標(biāo)板于濕潤盒中室溫培養(yǎng)4 h,或 冰箱中4 過夜進(jìn)行孵育,洗板。 加待測樣品:按照110的比例在待測樣 品中加入提取緩沖液(GEB) ,研磨后收集到離心 管,3 000 rmin -1 離心5 min,取上清液,吸取 100 L孔 -1 加于酶標(biāo)板中。室溫培養(yǎng)2 h,或4 過夜進(jìn)行孵育,洗板。 加酶標(biāo)抗體:分加酶標(biāo)抗體溶液,吸取100 L孔 -1 溶液于酶標(biāo)板中。室溫培養(yǎng)2 h進(jìn)行孵育, 洗板。 加酶反應(yīng)底物顯色:其PNP底物,用PNP 緩沖液溶解,吸取100 L孔 -1 底物溶液于酶標(biāo) 板中。在濕潤盒中培養(yǎng)60 min。 檢測:采用酶標(biāo)儀測定法,使用分光光度 計(jì),分別測定其在405 nm下的OD值,樣品OD值/ 陰性對照OD值2.0,則該樣品判斷為陽性,反之, 則為陰性。 1.3 數(shù)據(jù)分析 利用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),采用單方 面分類的方差分析法對北京順義和昌平地區(qū)檢測到 的病毒進(jìn)行差異顯著性分析,所用軟件為SAS 9.2 分析軟件。 2 結(jié)果與分析 2.1 黃瓜病毒病的發(fā)病情況 本試驗(yàn)共采集到黃瓜感病樣品284份,其中順 義126份、昌平124份、壽光28份、深圳6份。 感病材料癥狀主要表現(xiàn)為葉片重花葉,皺縮畸形, 果實(shí)表面斑駁畸形(圖1) ,發(fā)病后期整體植株矮 化,結(jié)果率低。調(diào)查發(fā)現(xiàn),在順義地區(qū)采集的126 份感病黃瓜材料葉片均有感病癥狀,其中38份材 料的果實(shí)有病癥;在昌平地區(qū)采集的124份感病樣 品的葉片都有感病癥狀,有33份材料的果實(shí)有病 癥。在壽光地區(qū)采集的28份黃瓜材料中,葉片均 有感病癥狀,果實(shí)無病癥。深圳地區(qū)感病材料大部 分為水果型黃瓜,且葉片有癥狀,果實(shí)無病癥。 圖1 黃瓜病毒病田間癥狀 a,葉片重花葉;b,葉片重花葉,皺縮畸形;c,果實(shí)表面斑駁畸形;彩色圖版見中國蔬菜網(wǎng)站:www.cnveg.org。 2.2 黃瓜病毒種類的差異與比較 對北京順義和昌平、山東壽光及廣東深圳采 集到的284份黃瓜感病材料進(jìn)行ELISA檢測,結(jié)果 表明,在北京順義和昌平地區(qū)的感病葉片上均檢測 出CMV、WMV、ZYMV 3種,在感病的黃瓜果實(shí) 上只檢測出CMV病毒。在順義地區(qū),CMV的檢出 率最高,為100.00%,WMV、ZYMV的檢出率分別 為51.59%、80.95%。在昌平地區(qū),CMV的檢出率 49 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點(diǎn) 產(chǎn)業(yè)市場 病蟲防控 49 研究論文 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 同樣最高,為100.00%,WMV、ZYMV的檢出率分 別為53.23%、66.94%。北京順義和昌平地區(qū)黃瓜 病毒病的病毒種類沒有差異,均為CMV、WMV、 ZYMV,這2個地區(qū)CMV、WMV的檢出率差異不大, 但ZYMV的檢出率具有顯著差異(表1)。 在山東壽光采集的感病葉片上檢測到CMV、 WMV、ZYMV、PRSV 4種病毒,且CMV的檢 出率最高,為100.00%,WMV、ZYMV、PRSV 的檢出率分別為35.71%、35.71%、17.86%。在 深圳地區(qū)采集的6份黃瓜感病材料中,檢測到 CMV、WMV、PRSV 3種病毒,其檢出率分別為 100.00%、50.00%、50.00%(表1)。 2.3 黃瓜病毒復(fù)合侵染分析 ELISA檢測結(jié)果顯示,順義和昌平地區(qū)分別 有122份(96.83%)和104份(83.87%)材料檢 測到2種或2種以上的病毒,說明北京地區(qū)黃瓜病 毒種類比較豐富,復(fù)合侵染率很高。在黃瓜病毒復(fù) 合侵染中,CMV和ZYMV的復(fù)合檢出率最高,在 順義和昌平分別為45.24%和30.65%;另外,CMV 和WMV的復(fù)合檢出率分別為15.87%和16.93%, WMV和ZYMV的復(fù)合檢出率分別為0和1.61%。 CMV、WMV、ZYMV 3種病毒的復(fù)合侵染率分別為 35.71%和34.68%(表2)。 壽光地區(qū)有17份(60.71%)材料檢測到2種 表1 我國不同地區(qū)黃瓜病毒病發(fā)病情況 采樣時間 地區(qū) 栽培 方式 CMV發(fā) 病株數(shù) CMV檢出 率/% WMV發(fā) 病株數(shù) WMV檢 出率/% ZYMV發(fā) 病株數(shù) ZYMV檢 出率/% PRSV發(fā) 病株數(shù) PRSV檢 出率/% 總采樣 株數(shù) 2017-06-01 順義 露地 126 100.00 65 51.59 102 80.95 * 126 2017-09-01 昌平 露地 124 100.00 66 53.23 83 66.94 124 2017-11-25 壽光 溫室 28 100.00 10 35.71 10 35.71 5 17.86 28 2017-11-14 深圳 大棚 6 100.00 3 50.00 3 50.00 6 注:*表示北京順義與昌平地區(qū)的ZYMV檢出率差異顯著(=0.05)。 表2 黃瓜病毒病復(fù)合侵染類型和檢出率 病毒復(fù)合 侵染種類 復(fù)合侵染類型 順義 昌平 壽光 深圳 感病株數(shù) 檢出率/% 感病株數(shù) 檢出率/% 感病株數(shù) 檢出率/% 感病株數(shù) 檢出率/% 2種 CMV+WMV 20 15.87 21 16.93 7 25.00 1 16.67 CMV+ZYMV 57 45.24 38 30.65 5 17.85 WMV+ZYMV 2 1.61 3種 CMV+WMV+ZYMV 45 35.71 43 34.68 CMV+ZYMV+PRSV 2 7.14 CMV+WMV+PRSV 2 33.33 4種 CMV+WMV+ZYMV+PRSV 3 10.71 或2種以上的病毒,其中CMV和WMV的復(fù)合檢 出率為25.00%,CMV和ZYMV的復(fù)合檢出率為 17.85%,CMV、ZYMV、PRSV 3種病毒的復(fù)合檢出 率為7.14%,CMV、WMV、ZYMV、PRSV 4種病毒 的復(fù)合侵染率為10.71%(表2)。 深圳地區(qū)有3份(50%)材料檢測到2種或2 種以上的病毒,其中CMV、WMV的復(fù)合檢出率為 16.67%,CMV、WMV、PRSV 3種病毒的復(fù)合侵染 率為33.33%(表2)。 3 結(jié)論與討論 近年來,病毒病嚴(yán)重影響黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)。 本試驗(yàn)對北京露地、壽光溫室、深圳大棚的黃瓜病 毒病發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查,發(fā)現(xiàn)病毒病對黃瓜露地栽 培品種的危害最為嚴(yán)重,這可能與病毒病主要依靠 蚜蟲、粉虱等刺吸式口器昆蟲傳播有關(guān)(秦小慶 等,2017) 。由于不同病毒侵染黃瓜表現(xiàn)出的病癥 極其相似,無法根據(jù)病癥判斷病毒種類(David & Mizuki,1987),因此本試驗(yàn)利用ELISA檢測法對 北京、壽光及深圳地區(qū)黃瓜病毒病進(jìn)行病毒種類 鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在這3個地區(qū)均檢測出CMV 且檢出率最高,在北京感病黃瓜果實(shí)上也檢測出 CMV,說明CMV是北京、壽光及深圳的黃瓜優(yōu)勢 病毒。 50 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點(diǎn) 產(chǎn)業(yè)市場 病蟲防控 50 研究論文 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 李淑菊等(2003)對天津黃瓜病毒病進(jìn)行 病毒種類鑒定,發(fā)現(xiàn)該地區(qū)黃瓜主要毒原種類有 CMV、WMV、TMV 3種病毒,且存在病毒復(fù)合侵染。 熊艷等(2017)對重慶地區(qū)黃瓜病毒病進(jìn)行病毒 種類檢測,檢測到CMV、WMV、ZYMV、SqMV和 TuMV 5種病毒,同樣存在復(fù)合侵染。以上研究結(jié) 果與本試驗(yàn)黃瓜病毒病發(fā)病情況和病毒種類具有一 定的相似性。并且我國大部分地區(qū)存在黃瓜田間病 毒復(fù)合侵染現(xiàn)象(熊艷 等,2014;Hameed et al., 2014;Abrahamian et al.,2015)。 本試驗(yàn)在不同地區(qū)的黃瓜上檢測出不同的病毒 種類,可能是病毒的毒源分布具有地區(qū)性的原因。 ZYMV的檢出率在北京順義和昌平地區(qū)存在一定的 差異,這可能與當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境、氣候條件、昆蟲的種 類有關(guān)。黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)是嚴(yán)重 威脅葫蘆科作物生產(chǎn)的重要種傳病毒,是我國農(nóng)業(yè) 植物檢疫性有害生物和進(jìn)境檢疫性有害生物,本試 驗(yàn)在北京、山東及廣東地區(qū)并未檢測到該病毒。本 試驗(yàn)只采用了5種常見黃瓜病毒抗體對我國北京、 山東及廣東地區(qū)黃瓜病毒病進(jìn)行檢測,還需進(jìn)一步 鑒定是否存在其他病毒。 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Virus Detection of Cucumber Produced in Beijing,Shandong and Guangdong Provinces SHI Li-xue,ZHANG Sheng-ping,MIAO Han,BO Kai-liang,XIE Qing,WANG Ye,GU Xing-fang * (Institute of Vegetable and Flowers,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China) Abstract:The 284 cucumber samples affected by virus in the fields of Shunyi and Changping Districts of Beijing,Shouguang of Shandong Province,and Shenzhen of Guangdong Province,were identified on their species of virus diseases and detected them with virus antibodies against 5 cucumber viruses,including Cucumber mosaic virus,Watermelon mosaic virus,Zucchini yellow mosaic virus,Cucumber green mottled mosaic virus and Papaya ring spot virus by ELISA method.The results showed that CMV,WMV,ZYMV were detected 51 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點(diǎn) 產(chǎn)業(yè)市場 病蟲防控 51 研究論文 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 番茄砧 / 穗殘株高效再利用技術(shù)研究 李福凱 王紅飛 尚慶茂 * (農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所,北京 100081) 摘 要:為探明番茄嫁接后砧木、接穗殘株再生性及再利用的可行性,以番茄砧木品種久綠787和接穗品種佳紅4號為試材, 研究砧木、接穗殘株再生苗的生長發(fā)育進(jìn)程,比較再生苗與初次嫁接苗的愈合情況和生長指標(biāo)。結(jié)果表明:番茄嫁接后砧木 殘株可扦插再生、接穗殘株可腋芽再生形成完整的幼苗,與播種形成幼苗相比,砧木殘株扦插苗和接穗殘株腋芽再生苗達(dá)到 嫁接苗齡的時間可縮短16 d;利用砧木、接穗殘株嫁接,嫁接苗成活率、接合力、輸導(dǎo)能力及后期生長參數(shù)與初次嫁接苗差 異不顯著。通過嫁接苗培養(yǎng)成本比較,利用砧/穗殘株進(jìn)行嫁接的幼苗生產(chǎn)成本明顯低于初次嫁接苗,按每萬株嫁接苗計(jì), 可節(jié)約成本875.5元。說明番茄嫁接后砧/穗殘株可以嫁接再利用,并可明顯提高經(jīng)濟(jì)效益。 關(guān)鍵詞:番茄;嫁接;殘株;再利用 的砧木品種與豐產(chǎn)接穗品種進(jìn)行嫁接栽培,可有效 提高番茄植株抵御非生物和生物逆境的能力,促進(jìn) 水肥吸收,改善植株生長發(fā)育,提高產(chǎn)量和品質(zhì) (Venema et al.,2008;Barrett et al.,2012;Mcavoy et al.,2012;Schwarz et al.,2013)。目前韓國、日 本番茄嫁接苗栽培面積分別達(dá)到總栽培面積的25% 和40%,歐美國家的番茄種植也大面積采用嫁接技 術(shù),我國番茄嫁接栽培也占有很大面積,且推廣面 積逐年增加(Lee et al.,2010;別之龍,2012)。 番茄嫁接方法主要有劈接法、靠接法、插接 法、貼接法、套管嫁接法(Oda,2006;Lee et al., 2010) 。劈接法簡單易操作,適用于較粗大的砧木 嫁接??拷臃ǔ苫盥矢?,但嫁接工序繁瑣,人工成 李福凱,男,碩士研究生,專業(yè)方向:蔬菜栽培,E-mail: lifukai_1126163.com *通訊作者(Corresponding author):尚慶茂,男,研究員,博士生導(dǎo)師,專 業(yè)方向:蔬菜栽培生理及分子生物學(xué),E-mail:shangqingmaocaas.cn 收稿日期:2017-11-22;接受日期:2018-02-08 基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31172001) ,國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè) 技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-25) ,公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng) (201303014),中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目(CAAS-ASTIP- IVFCAAS),現(xiàn)代農(nóng)業(yè)人才支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2016) 番茄是世界性主栽茄果類蔬菜之一,全球栽培 面積超過500萬hm 2 ,我國栽培面積達(dá)100萬hm 2 (FAO,2014) 。番茄栽培期間經(jīng)常遭遇低溫、干 旱、鹽漬等非生物逆境和病蟲害等生物逆境,制約 著產(chǎn)量和品質(zhì)的提高,采用抗逆性強(qiáng)和生長勢良好 on the infected leaves of 126 and 124 samples collected in Shunyi and Changping Districts of Beijing.Among them the detection rate of CMV was the highest,all was 100.00% in Shunyi and Changping.The detection rate of ZYMV were 80.95% and 66.94%,respectively.The detection rate of WMV was the lowest - 51.59% and 53.22%,respectively.Only CMV was detected on the infected fruit.CMV,WMV,ZYMV,PRSV 4 viruses were detected on the infected leaves of 28 samples collected in Shouguang of Shandong Province.The detection rates of these 4 viruses were 100.00%,35.71%,35.71% and 17.86%,respectively.CMV,WMV,PRSV were detected on the infected leaves of 6 infected cucumber samples collected in Shenzhen.The detection rates were 100.00%,50.00% and 50.00%,respectively.Investigation discovered that the phenomenon of 2 and over 2 kinds of virus mixed infection on cucumber was very common in Shunyi and Changping Districts of Beijing, Shouguang of Shandong and Shenzhen of Guangdong. Key words:Cucumber;Virus disease;ELISA detection;Virus identification 52 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點(diǎn) 產(chǎn)業(yè)市場 病蟲防控 52 研究論文 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 2018(4):52 - 57