分子植物育種 Molecular Plant Breeding ISSN 1672-416X,CN 46-1068/S 分子植物育種網(wǎng)絡(luò)首發(fā)論文 題目： 安徽省甜查理草莓紅葉病病原菌的分離與鑒定 作者： 寧志怨，伊興凱，蘭偉，黃錫桂，張殿興，董玲，錢小強(qiáng) 網(wǎng)絡(luò)首發(fā)日期： 2018-10-18 引用格式： 寧志怨，伊興凱，蘭偉，黃錫桂，張殿興，董玲，錢小強(qiáng)安徽省甜查理草莓紅葉病病原菌的分離與鑒定J/OL分子植物育種. http:/kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20181016.1720.018.html 網(wǎng)絡(luò)首發(fā)：在編輯部工作流程中，稿件從錄用到出版要經(jīng)歷錄用定稿、排版定稿、整期匯編定稿等階段。錄用定稿指內(nèi)容已經(jīng)確定，且通過同行評(píng)議、主編終審?fù)饪玫母寮?。排版定稿指錄用定稿按照期刊特定版式（包括網(wǎng)絡(luò)呈現(xiàn)版式）排版后的稿件，可暫不確定出版年、卷、期和頁(yè)碼。整期匯編定稿指出版年、卷、期、頁(yè)碼均已確定的印刷或數(shù)字出版的整期匯編稿件。錄用定稿網(wǎng)絡(luò)首發(fā)稿件內(nèi)容必須符合出版管理?xiàng)l例和期刊出版管理規(guī)定的有關(guān)規(guī)定；學(xué)術(shù)研究成果具有創(chuàng)新性、科學(xué)性和先進(jìn)性，符合編輯部對(duì)刊文的錄用要求，不存在學(xué)術(shù)不端行為及其他侵權(quán)行為；稿件內(nèi)容應(yīng)基本符合國(guó)家有關(guān)書刊編輯、出版的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，正確使用和統(tǒng)一規(guī)范語言文字、符號(hào)、數(shù)字、外文字母、法定計(jì)量單位及地圖標(biāo)注等。為確保錄用定稿網(wǎng)絡(luò)首發(fā)的嚴(yán)肅性，錄用定稿一經(jīng)發(fā)布，不得修改論文題目、作者、機(jī)構(gòu)名稱和學(xué)術(shù)內(nèi)容，只可基于編輯規(guī)范進(jìn)行少量文字的修改。 出版確認(rèn)：紙質(zhì)期刊編輯部通過與中國(guó)學(xué)術(shù)期刊（光盤版）電子雜志社有限公司簽約，在中國(guó)學(xué)術(shù)期刊（網(wǎng)絡(luò)版）出版?zhèn)鞑テ脚_(tái)上創(chuàng)辦與紙質(zhì)期刊內(nèi)容一致的網(wǎng)絡(luò)版，以單篇或整期出版形式，在印刷出版之前刊發(fā)論文的錄用定稿、排版定稿、整期匯編定稿。因?yàn)橹袊?guó)學(xué)術(shù)期刊（網(wǎng)絡(luò)版）是國(guó)家新聞出版廣電總局批準(zhǔn)的網(wǎng)絡(luò)連續(xù)型出版物（ISSN 2096-4188，CN 11-6037/Z），所以簽約期刊的網(wǎng)絡(luò)版上網(wǎng)絡(luò)首發(fā)論文視為正式出版。 研究報(bào)告Research Report安徽省甜查理草莓紅葉病病原菌的分離與鑒定寧志怨 1 伊興凱 1 蘭偉 2* 黃錫桂 1 張殿興 1 董玲 1 錢小強(qiáng) 11 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所, 合肥, 230031; 2 阜陽(yáng)師范學(xué)院生命與食品工程學(xué)院, 阜陽(yáng), 236037*通訊作者, ahfyygp163.com摘 要 紅葉病的主要危害甜查理草莓的葉片，造成死苗現(xiàn)象，發(fā)病速度非?？欤瑖?yán)重時(shí)可造成整行或整個(gè)大棚草莓死亡。病原菌的鑒定是病害防控的基礎(chǔ)，本研究對(duì)來源于皖北地區(qū)的草莓紅葉病的病原菌進(jìn)行了分離、純化、形態(tài)觀察以及分子生物學(xué)鑒定。研究結(jié)果顯示該病原菌在 PDA 平板上呈放射狀，菌絲的顏色逐漸從白色變?yōu)楹谏?，菌絲體具有分枝的和隔膜。分生孢子是梭形，并且由五個(gè)細(xì)胞組成。使用 PCR法擴(kuò)增該病原菌的 ITS 和 18S rDNA 的序列并進(jìn)行 DNA 測(cè)序。根據(jù)測(cè)序的結(jié)果，對(duì)病原菌的 ITS 和 18SrDNA 序列的 BLAST 同源性對(duì)比和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。根據(jù)病原菌的外部特征和分子鑒定的結(jié)果證明引起安徽省甜查理草莓紅葉病的病原菌為 Pestalotiopsis clavispora。本研究為草莓紅葉病的病害防控提供科學(xué)依據(jù)。關(guān)鍵詞 草莓紅葉病, rDNA-ITS 序列 , 擬多盤鞭毛菌 , 進(jìn)化樹分析Isolation and identification of the Pathogen of Red Spot Leaf Diseasein “Sweet Charlie“ Strawberry inAnhui ProvinceNing Zhiyuan 1 Yi Xingkai 1 Lan Wei 2* Huang Xigui 1 Zhang Dianxing 1 Dong Ling 1Qian Xiaoqiang11 Horticultural Research Institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei, 230031; 2 College of Biotechndogy and FoodEngineering, Fuyang Teachers College, Fuyang, 236037* Corresponding author, ahfyygp163.comAbstract This kind of disease mainly infect the strawberry leaves, and eventually caused the phenomenon ofdead plants with very fast the incidence rate. In serious cases, the strawberry plants in whole line or the wholegreenhouse can be destroyed. The identification of pathogenic bacteria is the basis of disease prevention andcontrol. In this study, the pathogens of strawberry red leaf disease originating from northern Anhui were isolated,purified, morphologically and molecularly identified. The results showed that the pathogen was radial on the PDAplate, and the color of the hyphae gradually changed from white to black, and the mycelium had branches and theconidia are were fusiform and five-celled. The sequences of the ITS and 18S rDNA of the pathogen wereamplified by PCR amplification and sequenced by Shanghai Sangon Cooperation. According to the sequenceresult, the BLAST homology comparison and phylogenetic tree analysis were conducted based on the cloned ITSand 18S rDNA sequences of isolated pathogen. Finally, the pathogen causing “Sweet Charlie“ strawberry red leafdisease was identified as Pestalotiopsis clavispora based on the external characteristics and molecularidentification. This study pay the way for the prevention and control of strawberry red leaf disease.Keywords Strawberry red leaf disease, rDNA-ITS sequence, Pestalotiopsis clavispora, Phylogenetic treeanalysis草莓 (Fragaria ananassa Duch.)屬薔薇科草莓屬植物，具有產(chǎn)量高、經(jīng)濟(jì)效益好等特點(diǎn)，是冬季時(shí)令的水果之一。近年來，隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，草莓種植已經(jīng)逐漸發(fā)展到全國(guó)各地 (聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù) ) (Kurze et al., 2001)。尤其是草莓品種甜查理，該品種休眠期淺、開花早、豐產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)、大果型，植株生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，因此在中國(guó)廣泛種植。但是隨著生產(chǎn)發(fā)展、種植面積擴(kuò)大、連作年限增加以及長(zhǎng)期的無性繁網(wǎng)絡(luò)首發(fā)時(shí)間：2018-10-18 10:52:05網(wǎng)絡(luò)首發(fā)地址：http:/kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20181016.1720.018.html殖 ， 近 年 來 在 湖 北 、 山 東 、 安 徽 和 江 蘇 等 省 北 部 大 量 種 植 的 甜 查 理 草 莓 紅 葉 病 經(jīng) 常 發(fā) 生 ， 嚴(yán) 重 時(shí) 造 成 整 行或 整 棚 甜 查 理 草 莓 苗 死 亡 ， 并 呈 現(xiàn) 逐 年 加 重 的 趨 勢(shì) ， 給 農(nóng) 戶 造 成 了 極 大 的 損 失 ， 已 成 為 制 約 中 國(guó) 草 莓 產(chǎn) 業(yè)發(fā) 展 的 重 要 障 礙 之 一 。 2017 年 對(duì) 安 徽 省 北 部 的 多 個(gè) 草 莓 種 植 基 地 進(jìn) 行 病 害 調(diào) 查 ， 結(jié) 果 發(fā) 現(xiàn) 甜 查 理 草 莓 紅 葉病 在 這 些 地 區(qū) 時(shí) 有 發(fā) 生 。 發(fā) 病 植 株 癥 狀 表 現(xiàn) 為 葉 片 下 部 由 外 緣 向 內(nèi) 緣 變 灰 色 ， 葉 片 上 面 呈 現(xiàn) 紅 色 斑 點(diǎn) 狀 ，嚴(yán) 重 時(shí) 整 個(gè) 葉 片 枯 死 ， 而 根 莖 結(jié) 合 部 剖 面 未 見 有 明 顯 的 變 色 ， 最 終 導(dǎo) 致 整 個(gè) 植 株 枯 萎 死 亡 。 該 病 害 具 有 較強(qiáng) 的 傳 染 性 ， 導(dǎo) 致 附 近 的 草 莓 苗 表 現(xiàn) 出 類 似 的 癥 狀 ， 給 生 產(chǎn) 上 帶 來 較 大 的 損 失 (圖 1)。 導(dǎo) 致 該 病 害 難 以 控制 的 主 要 原 因 是 草 莓 紅 葉 病 的 病 原 菌 不 清 楚 ， 針 對(duì) 這 一 現(xiàn) 狀 ， 本 試 驗(yàn) 在 對(duì) 該 我 省 北 部 地 區(qū) 甜 查 理 草 莓 紅 葉病 病 原 分 離 的 基 礎(chǔ) 上 ， 進(jìn) 行 了 形 態(tài) 學(xué) 、 分 子 生 物 學(xué) 鑒 定 和 致 病 性 檢 測(cè) ， 旨 在 確 定 該 地 區(qū) 草 莓 紅 葉 病 的 病 原菌 ， 為 草 莓 紅 葉 病 的 防 治 提 供 理 論 依 據(jù) 。圖 1“甜 查 理 ”草 莓 紅 葉 病 的 發(fā) 病 照 片注 :A: 草 莓 紅 葉 病 的 田 間 表 現(xiàn) ; BC: 紅 葉 病 的 發(fā) 病 初 期 葉 片 正 面 和 反 面 的 照 片 ; D: 病 斑 的 顯 微 照 片 ; E: 病 癥 擴(kuò) 大 時(shí) 導(dǎo) 致 葉片 干 枯 卷 曲 ; F: 感 病 植 株 的 根 莖 結(jié) 合 部 剖 面 未 見 明 顯 的 變 色Figure 1 Photographs of red leaf disease in “Sweet Charlie“ strawberryNote: A: field performance of strawberry red leaf disease; BC: front and back pictures of leaves at the onset of strawberry red leafdisease; D: the micrograph of lesion; E: when lesions enlarge and eventually leading to dry and curl leaves; F: Obviously nodiscoloration in the section of roots and stems of disease plants1 結(jié) 果 與 分 析1.1 病 原 菌 的 分 離 和 病 原 體 的 特 征在 采 樣 點(diǎn) 附 近 不 同 地 點(diǎn) ， 隨 機(jī) 選 取 的 12 株 具 有 上 述 紅 葉 病 發(fā) 病 特 征 的 草 莓 病 株 。 經(jīng) 過 葉 片 沖 洗 和 表面消毒后，在實(shí)驗(yàn)室中切取上述感染的葉片的病健交界處用于病原菌的分離。 25下培養(yǎng) 5 d 后，三個(gè)平板被霉菌污染，一個(gè)平板未能分離出任何病原體。最后，從感病的葉片中分離出 8 種病原菌。然后將分離的 病 原 體 轉(zhuǎn) 移 到 新 的 PDA 培 養(yǎng) 基 中 并 通 過 單 孢 子 分 離 法 進(jìn) 行 純 化 。 在 PDA 培 養(yǎng) 基 上 產(chǎn) 生 的 這 些 菌 落 是 白色 放 射 狀 ， 邊 緣 不 規(guī) 則 ， 表 面 粗 糙 ， 隨 著 培 養(yǎng) 時(shí) 間 的 延 長(zhǎng) ， 菌 落 的 顏 色 逐 漸 由 白 色 轉(zhuǎn) 變 為 黑 色 (圖 2)。 在形 態(tài) 學(xué) 物 種 鑒 定 中 ， 將 這 些 分 離 物 在 PDA 培 養(yǎng) 基 平 板 上 培 養(yǎng) ， 并 置 于 連 續(xù) 熒 光 下 的 培 養(yǎng) 箱 中 。 收 獲 孢 子并 用 顯 微 鏡 進(jìn) 行 觀 察 。 這 些 培 養(yǎng) 物 覆 蓋 有 黑 色 和 球 狀 的 孢 子 ， 直 徑 為 100200 mol/L。 每 個(gè) 分 生 孢 子 的 基部略顯腫脹和球狀。這些分離株的成熟的分生孢子呈紡錘形并且由五個(gè)細(xì)胞組成，測(cè)量大約為17.026.56.18.2 mol/L，并且五細(xì)胞中的二個(gè)中間細(xì)胞顏色且比兩端細(xì)胞更深。頂端細(xì)胞呈透明三角狀(圖 2)。上述研究表明這些分離物在外觀上和形態(tài)學(xué)鑒定與 Pestalotiopsis sp.相似。圖 2 草 莓 紅 葉 病 的 病 原 菌 的 形 態(tài) 學(xué) 研 究注:A B: 分 離 出 的 病 原 菌 PDA培 養(yǎng) 基 上 的 形 態(tài) 特 征; C : 菌 絲 體 在 顯 微 鏡 下 的 形 態(tài) 特 征 研 究 ; D: 梭 型 的 五細(xì)胞 組 成 的 成 熟 的孢 子Figure 2 Morphological examination of the isolate from infected strawberry leavesNote: AB: the morphological characteristics of the isolated pathogen on PDA medium; C: morphological study of mycelia in themicroscope; D: the mature fusiform conidia with five-celled1.2 致 病 性試驗(yàn)通過上述方 法 用 每 種 分 離 物 的 分 生 孢 子 對(duì) 健 康 的 甜 查 理 草莓嫩葉進(jìn)行 重 接 種 試 驗(yàn) ， 三 次 重 復(fù) 。 接 種 7 d后 ， 接 種 葉 片 上 的 癥 狀 逐 漸 出 現(xiàn) ， 并 且 與 之 前 在 田 間 采 集 的 病 株 葉 片 上 的 癥 狀 基 本 相 似 (圖 3a; 圖 3b)。 用無 菌 水 模擬接 種 的 對(duì) 照 植 物 未 顯 示 出任何 癥 狀 (圖 3c; 圖 3d)。從 接 種 后 發(fā) 病 的 葉 片 上 將病原 菌 按 照 上 述 方法 進(jìn) 行 重 新 分 離 、 培 養(yǎng) 和鑒定 為 Pestalotiopsis clavispora。 重 新 分 離 出 的 病 原菌培 養(yǎng) 物 的 外 部 形 態(tài) 也 和 先前從 田 間 植 物 中 分 離 的 病 原 菌 基 本 一 致 。圖 3 利用病原菌的孢子懸浮液對(duì)甜查理草莓葉片進(jìn)行重接種試驗(yàn)注: AB: 使用孢子懸浮液接種; CD: 使用無菌水接種對(duì)照Figure 3 Re-inoculation of “ Sweet Charlie “ strawberry leaves with spore suspension of isolated pathogenic bacteriaNote:AB: stand for inoculation with a spore suspension of pathogen; CD: stand for inoculation with sterile water as a control1.3 分 子 鑒 定從 PDA 培 養(yǎng) 基 收 集 分 離 物 的 菌 絲 體 并 冷 凍 干 燥 ， 在 液 氮 中 研 磨 成 細(xì) 粉 。 收 集 約 5070 mg 的 菌 絲 體 粉末 用 于 病 原 菌 基 因 組 DNA 的 提 取 。 提 取 的 基 因 組 DNA 經(jīng) 過 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 后 ， 基 本 上 都 呈 一 條 亮 帶 說 明提 取 的 DNA 可 以 滿 足 PCR 擴(kuò) 增 的 需 要 。 在 對(duì) 每 個(gè) 提 取 的 DNA 中 特 異 性 擴(kuò) 增 ITS 和 18S-rDNA 序 列 后 ，從 這 些 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 中 分 離 出 大 約 500 bp 和 1 300 bp 的 PCR 產(chǎn) 物 (圖 4)。 在 對(duì) 這 些 特 異 性 DNA 條 帶 進(jìn) 行 回 收 、純 化 和 測(cè) 序 后 ， 通 過 Clustal X 分 別 比 對(duì) 這 些 獲 得 的 序 列 。 結(jié) 果 顯 示 這 些 序 列 是 基 本 相 同 并 分 成 兩 個(gè) 獨(dú) 立 的組 (IS102 和 IS126 序 列 )。 然 后 將 這 些 序 列 提 交 給 NCBI 上 的 GenBank 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 進(jìn) 行 登 錄 (基 因 登 錄 號(hào) 分 別 為MF399813 和 MF399814)， 并 與 已 經(jīng) 登 錄 在 NCBI 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 中 的 序 列 進(jìn) 行 同 源 性 比 對(duì) 。 根 據(jù) 比 對(duì) 結(jié) 果 ， 分 離克 隆 出 的 18S rDNA 序 列 與 GenBank 登 錄 號(hào) AF34561.1 具 有 99.76%同 源 性 ， ITS 序 列 與 GenBank 登 錄 號(hào)KY810807.1 序 列 具 有 100%同 源 性 ， 這 兩 個(gè) 序 列 分 別 來 源 于 Pestalotiopsis sp.和 Pestalotiopsis clavispora。圖 4 ITS 和 18S-rDNA 序 列 的 電 泳注 : DNAMaker: SM0337 (上 海 生 工 ); IS126 為 ITS 序 列 ; IS102 為 18S-rDNA 序 列Figure 4 the electrophoresis pattern of ITS and 18S-rDNAsequenceNote: DNA Ladder Mix maker: SM0337 (Sangon Co., Shanghai); IS126 and IS102 standed for ITS and 18S-rDNA sequence,respectively在 進(jìn) 化 樹 分 析 中 ， 從 GenBank 獲 得 的 總 共 25 個(gè) 來 源 于 Pestalotiopsis sp.的 序 列 和 克 隆 的 18S rDNA 序列 和 ITS 序 列 (IS102 和 IS126 序 列 )來 用 于 構(gòu) 建 進(jìn) 化 樹 。 使 用 MEGA6.0 軟 件 分 析 核 苷 酸 序 列 用 于 進(jìn) 化 樹 分析。 18S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果表明分離出的病原菌與 Pestalotiopsis sp.的同源性較高。然而，在更進(jìn)一步的 ITS 序列水平上分析結(jié)果顯示，該病原菌被鑒定為 Pestalotiopsis clavispora (圖 5)。因此， DNA分子鑒定的結(jié)果表明分離的病原菌是 Pestalotiopsis clavispora。綜上所述，根據(jù)病原菌的外部特征和 DNA分 子 鑒 定 的 結(jié) 果 都 證 明 引 起 “甜 查 理 ”草 莓 紅 葉 病 的 病 原 菌 為 Pestalotiopsis clavispora。圖 5 利用 MEGA 軟件對(duì)病原菌的 ITS 和 18S rDNA 序列的進(jìn)化樹分析Figure 5 Phylogenetic tree constructed by MEGA software based on an alignment of ITS and 18S rDNA sequence data from isolatedpathogen2 討 論雖 然 Chamorro (2016)等 報(bào) 道 Pestalotiopsis clavispora 能 夠 引 起 草 莓 病 害 ， 他 發(fā) 現(xiàn) 病 原 菌 只 會(huì) 導(dǎo) 致 冠 和根 的 變 色 或 壞 死 ， 但 不 會(huì) 在 葉 子 上 產(chǎn) 生 斑 點(diǎn) 。 然 而 ， 這 項(xiàng) 研 究 表 明 ， 這 種 新 型 的 Pestalotiopsis clavispora只 能 導(dǎo) 致 葉 片 感 病 ， 但 冠 和 根 中 沒 有 變 色 或 棕 色 壞 死 區(qū) 域 (圖 1f)。 因 此 ， 從 這 兩 種 Pestalotiopsis clavispora之 間 的 主 要 癥 狀 ， 我 們 認(rèn) 為 這 種 新 菌 株 可 能 由 于 病 菌 的 變 異 等 原 因 可 能 與 Chamorro 等 (2016)報(bào) 道 的 分 離 的Pestalotiopsis clavispora 不同。但是這項(xiàng)研究也存在一些局限性，例如缺乏 -微管蛋白和 tef 基因差異的分子 證 據(jù) 。 因 此 ， 下 一 步 是 在 這 個(gè) 新 菌 株 中 克 隆 和 測(cè) 序 這 些 特 定 基 因 。 該 研 究 表 明 該 菌 株 是 一 種 新 的Pestalotiopsis clavispora， 而 與 以 前 報(bào) 道 的 Pestalotiopsis clavispora 可 能 不 同 。 據(jù) 報(bào) 道 ， Pestalotiopsisclavispora 具 有 廣 泛 的 地 理 和 寄 主 范 圍 ， 并 且 已 經(jīng) 報(bào) 道 了 芒 果 (Ismail et al., 2013)， 楊 梅 (Lu et al., 2015)， 月季 (Feng et al., 2014)， 藍(lán) 莓 (Gonzlez et al., 2012; Luan et al., 2008)， 枇 杷 (Palou et al., 2013)和 美 國(guó) 山 核 桃(Lazarotto et al., 2012; Shi et al., 2015)等 。 然 而 ， 上 述 分 析 無 法 推 斷 出 這 種 分 離 的 病 原 體 的 來 源 。 安 徽 省 位于 中 國(guó) 東 部 ， 該 地 區(qū) 廣 泛 種 植 藍(lán) 莓 、 楊 梅 、 枇 杷 和 月 季 等 ， 因 此 可 能 成 為 草 莓 紅 葉 病 的 病 菌 來 源 。 因 此 ，在未來的工作中，有必要通過病原體接種試驗(yàn)尋找能夠在附近被感染的植物的搜索來確定該病原菌的來源 。 它 還 為 我 們 更 好 地 理 解 Pestalotiopsis clavispora 感 染 的 分 子 適 應(yīng) 機(jī) 制 提 供 了 依 據(jù) 。據(jù) 我 們 所 知 ， 這 是 國(guó) 內(nèi) 首 次 報(bào) 道 Pestalotiopsis clavispora 可 以 在 “ 甜 查 理 ” 草 莓 上 引 起 紅 葉 病 的 研 究 ，最 后 通 過 形 態(tài) 學(xué) 鑒 定 和 分 子 鑒 定 被 認(rèn) 為 是 該 病 害 的 主 要 致 病 菌 。 由 于 Pestalotiopsis clavispora 在 世 界 范 圍內(nèi)的流行和廣泛的寄主范圍，這是一種有效的植物病原體，在很大程度上未被認(rèn)識(shí)到。該病原菌有可能導(dǎo)致重要經(jīng)濟(jì)作物的產(chǎn)量嚴(yán)重?fù)p失，需要對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究。3 材 料 與 方 法3.1 病 樣 采 集 和 病 原 菌 的 分 離 和 形 態(tài) 學(xué) 鑒 定2017 年 11 月在皖北地區(qū)的阜陽(yáng)、宿州和淮北等地進(jìn)行“甜查理”草莓紅葉病的發(fā)病情況調(diào)查，共隨機(jī)采集草莓病株 12 份，在病株的病葉的病健交界處切取 810 mm2的組織塊，首先用流水沖洗感染的葉片組 織 30 min， 然 后 用 表 面 滅 菌 的 0.5 (w/v)次 氯 酸 鈉 處 理 35 min， 然 后 在 無 菌 水 中 漂 洗 三 次 。 然 后 用 無菌剪刀將組織切成 23 mm 的正方形，以確保每個(gè)樣品來自葉片的病健交界處。將組織置于 PDA 平板，在28下培養(yǎng) 35 d。一旦病原菌在 PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)起來，在菌塊的邊緣處挑取菌絲并轉(zhuǎn)移到新的 PDA中。將新 PDA 培養(yǎng)基置于 28恒溫培養(yǎng)箱中 5 d，從每種分離物中分離出單個(gè)分生孢子。培養(yǎng)物在 PDA上 于 25培 養(yǎng) ， 進(jìn) 行 DNA 提 取 和 形 態(tài) 學(xué) 鑒 定 。 選 擇 代 表 不 同 位 點(diǎn) 的 分 離 物 進(jìn) 行 形 態(tài) 學(xué) 物 種 鑒 定 。 將 這 些分 離 物 在 PDA 培 養(yǎng) 基 上 于 黑 暗 中 于 25培 養(yǎng) 5 d。 從 菌 落 的 生 長(zhǎng) 邊 緣 取 出 菌 絲 體 盤 (5 mm)并 轉(zhuǎn) 移 到 新 的PDA 培 養(yǎng) 基 平 板 上 。 將 新 板 置 于 25連 續(xù) 熒 光 燈 下 的 培 養(yǎng) 箱 中 。 14 d 后 ， 在 新 的 PDA 培 養(yǎng) 基 平 板 上 收 獲產(chǎn) 生 的 分 生 孢 子 。 將 孢 子 置 于 水 中 ， 使 用 Olympus 光 學(xué) 顯 微 鏡 檢 查 尺 寸 和 形 狀 。 在 25下 ， 12 h 光 照 和12 h 黑 暗 交 替 循 環(huán) 的 條 件 下 ， 在 PDA 上 7 d 后 測(cè) 定 菌 落 顏 色 。3.2 病 原 菌 的 致 病 性 鑒 定為 了 確 定 分 離 的 病 原 菌 是 否 能 在 “ 甜 查 理 ” 草 莓 上 引 起 紅 葉 病 ， 本 研 究 通 過 在 健 康 的 葉 片 上 滴 注 并 接種 病 原 菌 孢 子 懸 浮 液 進(jìn) 行 重 接 種 ， 三 次 重 復(fù) 。 首 先 ， 用 滅 菌 水 對(duì) 甜 查 理 草 莓 植 株 上 的 嫩 葉 片 進(jìn) 行 流 水 沖 洗30 min。 待 葉 片 干 燥 后 ， 將 葉 片 分 成 兩 個(gè) 獨(dú) 立 的 試 驗(yàn) 組 ： 陰 性 對(duì) 照 組 和 病 原 菌 侵 染 組 ， 每 個(gè) 試 驗(yàn) 組 包 含 36株 甜 查 理 草 莓 葉 片 。 在 病 原 菌 侵 染 試 驗(yàn) 組 中 ， 在 葉 片 表 面 接 種 每 種 分 離 物 的 孢 子 懸 浮 液 (2106個(gè) 分 生 孢 子/mL)， 重 復(fù) 三 次 。 作 為 對(duì) 照 ， 用 無 菌 水 模 擬 接 種 草 莓 葉 片 的 表 面 ， 重 復(fù) 三 次 。 將 兩 組 接 種 的 葉 子 分 別 置 于透 明 塑 料 袋 中 包 好 并 在 25的 生 長(zhǎng) 室 中 在 光 照 下 孵 育 16 h， 在 19下 在 黑 暗 中 孵 育 8 h。 34 d 后 取 出 塑料 袋 ， 將 植 物 保 持 在 相 同 的 溫 濕 度 條 件 下 ， 相 對(duì) 濕 度 為 70%80%， 直 至 葉 片 出 現(xiàn) 癥 狀 。3.3 分 子 鑒 定將真菌分離物在黑暗中于 25培養(yǎng) 67 d。使用滅菌的小鏟子從 PDA 培養(yǎng)基表面收獲菌絲體并冷凍干燥 ， 在 液 氮 中 研 磨 成 細(xì) 粉 末 ， 然 后 在 -70冰 箱 中 儲(chǔ) 存 。 將 約 5070 mg 菌 絲 體 粉 末 移 入 無 菌 的 1.5 mL 的離 心 管 中 ； 通 過 CTAB 方 法 收 集 基 因 組 DNA (Cubero et al., 1999)。 然 后 ， 在 溴 化 乙 錠 染 色 后 ， 將 基 因 組DNA 置 于 1% (w/v) 瓊 脂 糖 凝 膠 中 進(jìn) 行 電 泳 驗(yàn) 證 。 內(nèi) 部 轉(zhuǎn) 錄 間 隔 區(qū) (ITS) 側(cè) 翼 的 引 物 (ITS15-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3, ITS4 5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3) (Gardes and Bruns, 1993;Glass and Donaldson, 1995; Pereira et al., 2010; 鄭 秋 霞 等 , 2015) 和 18S rDNA 基 因 (NS15-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3 和 NS6 5-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3) (Noda and Kodama,1996)用 于 從 單 孢 子 培 養(yǎng) 物 提 取 的 DNA 中 擴(kuò) 增 ITS 和 18S rDNA 序 列 。 聚 合 酶 鏈 反 應(yīng) (PCR)擴(kuò) 增 在 總 體 積50 L 中 進(jìn) 行 ， 含 有 40 mmol/L 的 Tris-HCl (pH 8.4)， 100 mmol/L 的 KCl， 3 mmol/L 的 MgCl2， 200 mol/LdNTP， 每 種 引 物 1 mol/L， 和 0.5U Taq DNA 聚 合 酶 (Sangon Co., Shanghai, China)。 使 用 PTC-200 (MJResearch Corp.,America)進(jìn) 行 PCR 擴(kuò) 增 。 在 95初 始 變 性 4 min 后 ， 將 DNA 模 板 擴(kuò) 增 35 個(gè) 循 環(huán) 。 每 個(gè) 循環(huán) 包 括 95變 性 步 驟 45 s， 55退 火 步 驟 45 s， 72延 伸 步 驟 1.5 min。 最 后 包 括 最 后 的 延 伸 步 驟 (72, 10min)。 將 等 份 的 4 L 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 在 1% (w/v)瓊 脂 糖 凝 膠 上 電 泳 ， 隨 后 用 溴 化 乙 錠 染 色 PCR 產(chǎn) 物 。 使 用 PCR純化試劑盒 (Sangon Co., Shanghai, China)根據(jù)說明純化單個(gè) DNA 條帶的 PCR 產(chǎn)物。純化的 PCR 產(chǎn)物交給上 海 生 工 生 物 工 程 有 限 公 司 進(jìn) 行 DNA 片 段 的 雙 向 測(cè) 序 。 在 組 裝 和 編 輯 序 列 文 件 時(shí) 使 用 DNAMAN 4.0(Lynnon-BioSoft, Ontario, Canada)構(gòu) 建 共 有 序 列 。 將 ITS 和 18S rDNA 序 列 提 交 至 NCBI 上 的 GenBank 數(shù) 據(jù)庫(kù) 。 為了研究分離病原菌的進(jìn)化關(guān)系。將保存在 GenBank (https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的序列，并使用BLAST 搜索與已在 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中找到的序列進(jìn)行比較。從 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)下載參考已分離出病原菌的ITS 和 18S rDNA 序 列 。 使 用 Clustal X (Thompson et al., 1997)比 對(duì) 序 列 。 使 用 MEGA6.0 (Tamura et al., 2013)通 過 neighbor-joining method 法 (www.me-gasoftware.net)進(jìn) 行 系 統(tǒng) 進(jìn) 化 樹 分 析 。 Bootstrap 值 從 1 000 次bootstrap 重 復(fù) 獲 得 。 為 了 比 較 本 研 究 中 所 獲 得 的 真 菌 序 列 ， 來 自 NCBI 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 中 不 同 物 種 的 25 個(gè)Pestalotiopsis sp.的被用于此次分析。作 者 貢 獻(xiàn)寧 志 怨 和 蘭 偉 是 本 研 究 的 實(shí) 驗(yàn) 設(shè) 計(jì) 和 實(shí) 驗(yàn) 研 究 的 執(zhí) 行 人 ； 伊 興 凱 和 董 玲 完 成 數(shù) 據(jù) 分 析 和 論 文 初 稿 的 寫作 ； 黃 錫 桂 和 錢 小 強(qiáng) 參 與 實(shí) 驗(yàn) 設(shè) 計(jì) ， 試 驗(yàn) 結(jié) 果 分 析 ； 蘭 偉 是 項(xiàng) 目 的 構(gòu) 思 者 及 負(fù) 責(zé) 人 ， 指 導(dǎo) 實(shí) 驗(yàn) 設(shè) 計(jì) ， 數(shù) 據(jù)分 析 ， 論 文 寫 作 與 修 改 。 全 體 作 者 都 閱 讀 并 同 意 最 終 的 文 本 。致謝 本研究由安徽省科技廳國(guó)際科技合作項(xiàng)目 (1604b0602013)、安徽省 2017 年公益性技術(shù)應(yīng)用研究聯(lián)動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目 (1704f0704071)和安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院特色小漿果資源研究與利用創(chuàng)新團(tuán)隊(duì) (18C0308)共同資助資助。參 考 文 獻(xiàn)Chamorro M., Aguado A., and De los Santos B., 2016, First report of root and crown rot caused by Pestalotiopsis clavispora(Neopestalotiopsis clavispora) on strawberry in Spain, Plant Disease, 100(7): 1495Cubero O.F., Crespo A., Fatehi J., and Bridge P.D., 1999, DNA extraction and PCR amplification method suitable for fresh,herbarium-stored, lichenized, and other fungi, Plant Syst. 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