生物質(zhì)炭對(duì)酸性菜地土壤N2O排放及相關(guān)功能基因豐度的影響李雙雙，陳  晨，段鵬鵬，許  欣，熊正琴*（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210095）摘要: 【目的】生物質(zhì)炭顯著影響土壤氧化亞氮 (N2O) 排放，但關(guān)于其相關(guān)微生物機(jī)理的研究相對(duì)匱乏，尤其是生物質(zhì)炭對(duì)酸性菜地土壤N2O排放的微生物作用機(jī)理。本文通過(guò)研究氮肥配施生物質(zhì)炭對(duì)酸性菜地土壤N2O排放以及硝化和反硝化過(guò)程相關(guān)功能基因豐度的影響，探討酸性菜地土壤N2O排放與功能基因豐度的關(guān)系，闡釋生物質(zhì)炭對(duì)酸性菜地土壤試驗(yàn)N2O排放的微生物作用機(jī)理?！痉椒ā吭谔镩g一次性施入生物質(zhì)炭 40 t/hm2，試驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行了3年，共9茬蔬菜。設(shè)置4個(gè)處理：對(duì)照 (CK)、氮肥 (N)、生物質(zhì)炭 (Bc) 和氮肥 + 生物質(zhì)炭 (N +Bc)。在施用后第三年，采集土壤樣品進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)，應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)硝化過(guò)程氨氧化古菌(AOA)、氨氧化細(xì)菌 (AOB) 功能基因amoA和反硝化過(guò)程亞硝酸還原酶基因 (nirK、nirS) 以及N2O還原酶基因(nosZ) 等相關(guān)功能基因豐度，同時(shí)監(jiān)測(cè)土壤pH值、無(wú)機(jī)氮 (銨態(tài)氮、硝態(tài)氮) 含量及N2O排放?！窘Y(jié)果】與CK相比，生物質(zhì)炭 (Bc) 處理的土壤有機(jī)碳 (SOC) 提高了27.1%，總氮 (TN) 提高了8.2%，amoA-AOB基因豐度顯著降低了11.0%，nosZ基因豐度增加了21.2% (P  0.05)。與CK相比，施用氮肥 (N) 顯著降低土壤pH (P  0.05)；在715 d，N和N + Bc處理N2O排放速率迅速降低，且此階段N處理N2O排放速率顯著高于N + Bc處理 (P < 0.05)。方差分析表明，培養(yǎng)時(shí)間、處理以及其交互作用均顯著影響培養(yǎng)期間N2O排放速率 (P < 0.01)。培養(yǎng)期內(nèi)CK和Bc處理N2O累積排放量顯著低于N和N + Bc處理，且二者之間沒(méi)有顯著差異；N處理N2O累積排放量顯著高于CK處理 (P < 0.001)，表 2   田間施用生物質(zhì)炭3年后土壤基本性質(zhì)Table 2   Soil physicochemical properties after 3 years of field treatment with N fertilizer and biochar applicationin the acidic vegetable field處理Treatment有機(jī)碳SOC(g/kg)全氮Total N(g/kg)pH(15 H2O)CEC(cmol/kg)NH4+-N(mg/kg)NO3-N(mg/kg)CK 16.17 1.07 c 1.69 0.05 c 5.15 0.07 a 20.75 1.25 b 101.42 4.53 c   26.47 0.13 cN 19.45 0.57 b 2.05 0.01 a 3.91 0.07 c 23.60 1.21 b   208.10 13.04 a 111.23 2.84 bBc 22.17 0.84 a 1.84 0.01 b 5.26 0.09 a 21.66 0.31 b 106.20 2.98 c   19.03 0.21 dN + Bc 23.09 0.39 a 2.12 0.01 a 4.78 0.01 b 27.35 1.68 a 129.19 3.19 b 139.98 1.90 a處理TreatmentamoA-AOA( 106 gene copies)amoA-AOB( 106 gene copies)nirK( 108 gene copies)nirS( 109 gene copies)nosZ( 106 gene copies)(nirS + nirK)/nosZCK 1.11 0.14 a 10.27 0.39 a   1.03 0.07 c 0.97 0.04 c 1.34 0.03 d 1.50 0.11 bcN 0.22 0.03 c   3.24 0.25 c   9.19 0.02 b 3.30 0.18 b 4.17 0.11 b 3.00 0.05 a  Bc 0.95 1.37 a   9.14 0.78 b   1.13 0.04 c 1.00 0.80 c 1.70 0.14 c 1.27 0.50 c  N + Bc 0.69 0.06 b   5.34 0.87 b 11.64 0.73 a 4.11 0.08 a 8.08 0.24 a 1.95 0.14 b  注（Note）：表中值為平均值 標(biāo)準(zhǔn)差 (n = 3)，同列數(shù)值后不同字母表示處理間差異顯著 (P < 0.05) Values were mean standarddeviation (n = 3). Different letters in the same column represented significant difference among treatments (P < 0.05).2 期李雙雙，等：生物質(zhì)炭對(duì)酸性菜地土壤N2O排放及相關(guān)功能基因豐度的影響417  是CK處理的6.7倍 (圖1)；與N處理相比，N +Bc處理顯著降低N2O累積排放量33.3% (P < 0.001)。雙因子方差分析結(jié)果顯示，氮肥和生物質(zhì)炭對(duì)N2O累積排放量的影響具有顯著的交互作用 (P < 0.001)。2.3    室內(nèi)培養(yǎng)各處理土壤pH和無(wú)機(jī)氮含量的動(dòng)態(tài)變化及方差分析采集前述田間試驗(yàn)處理土壤樣品進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)，在初始加入 (NH4)2SO4溶液后，各處理土壤pH值都呈現(xiàn)降低的趨勢(shì) (圖2a)；N處理土壤pH值在7 d后則呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)；整個(gè)培養(yǎng)期間N處理的pH值均顯著低于N + Bc處理 (P < 0.05)。N和N + Bc處理土壤NH4+-N含量在初始加入(NH4)2SO4溶液后，迅速上升后則呈現(xiàn)緩慢降低的趨勢(shì)，CK和Bc處理土壤NH4+-N含量降幅更加顯著(圖2b)。整個(gè)培養(yǎng)期間N處理的NH4+-N含量顯著高于N + Bc處理，且顯著高于CK和Bc處理 (P < 0.05)；CK和Bc處理之間土壤NH4+-N含量差異不顯著。CK和Bc處理土壤NO3 含量呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)，施用氮肥的N和N + Bc處理培養(yǎng)期內(nèi)土壤NO3含量呈現(xiàn)降低趨勢(shì) (圖2c)。整個(gè)培養(yǎng)期間，施用氮肥的N和N + Bc處理土壤NO3-N含量基礎(chǔ)值顯著高于CK處理 (P < 0.05)；N + Bc處理的NO3-N含量均顯著高于N處理 (P < 0.05)；除第28 d外，CK和Bc處理的土壤NO3 含量沒(méi)有顯著差異。方差分析表) TrTreatment; ns表示差異不顯著 ns denoted notsignificant; *和*表示處理間在0.05和0.01水平上差異顯著Represented significant difference at 0.05 and 0.01 levels, respectively.418植 物 營(yíng) 養(yǎng) 與 肥 料 學(xué) 報(bào)24 卷明，培養(yǎng)時(shí)間、處理以及其交互作用均顯著影響土壤NO3-N含量 (P < 0.01)。2.4    室內(nèi)培養(yǎng)各處理微生物功能基因豐度的動(dòng)態(tài)變化及方差分析采集前述田間試驗(yàn)處理土壤樣品進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)，在初始加入 (NH4)2SO4溶液后，CK和Bc處理土壤amoA-AOB和amoA-AOA功能豐度均迅速上升，amoA-AOB豐度在第1 d達(dá)到峰值，分別為24.3 107 (CK)、20.3 107 (Bc) 拷貝數(shù)g1d.w.s，之后逐漸下降；而amoA-AOA豐度在第14 d達(dá)到峰值，分別為19.1 105 (CK)、18.7 105 (Bc) 拷貝數(shù)g1d.w.s，1421 d迅速下降，之后趨于平緩 (圖3a, 3b)。N處理土壤在整個(gè)培養(yǎng)期間amoA-AOB和amoA-AOA豐度均呈緩慢上升，但其amoA-AOB和amoA-AOA豐度均顯著低于CK處理 (P < 0.05)。N + Bc處理的amoA-AOB和amoA-AOA豐度在第1 d顯著降低，但降幅不同；隨后amoA-AOB豐度緩慢上升，amoA-AOA豐度呈現(xiàn)緩慢降低的趨勢(shì)。培養(yǎng)期間各處理土壤nirK、nirS豐度顯著增加，之后均呈現(xiàn)緩慢降低的趨勢(shì) (圖3c，圖3d)；CK和Bc處理土壤nirK、nirS豐度沒(méi)有顯著差異 (除第14 d，Bc處理的nirS基因豐度顯著高于CK處理)。N處理土壤nirK、nirS功能基因豐度均顯著高于CK處理 (P < 0.05)，N + Bc處理土壤nirK、nirS基因豐度均顯著高于N處理 (P < 0.05)。培養(yǎng)期間CK和Bc處理土壤nosZ功能基因豐度呈現(xiàn)上下波動(dòng)趨勢(shì)，波動(dòng)幅度不大 (圖3e)；N和N +Bc處理土壤nosZ基因豐度迅速上升，在第14天達(dá)到峰值，1435 d迅速下降；N和N + Bc處理土壤nosZ基因豐度均顯著高于CK處理。除第1、28和35 d外，N + Bc處理的nosZ功能基因豐度均顯著高于N處理 (P < 0.05)。方差分析表明，培養(yǎng)時(shí)間、處理以及其交互作用均顯著影響amoA-AOA和nosZ (P < 0.01)，而該交互作用對(duì)nirK、nirS豐度沒(méi)有顯著影響。2.5    菜地土壤室內(nèi)培養(yǎng)各處理N2O排放與土壤理化性質(zhì)間的關(guān)系菜地各處理土壤室內(nèi)培養(yǎng)期間，amoA-AOB、amoA-AOA基因豐度與pH呈顯著正相關(guān) (r分別為0.85、0.78，P < 0.01)(表3)，與NO3-N呈顯著負(fù)相) TrTreatment; ns表示差異不顯著 ns denoted notsignificant; *和*表示處理間在0.05和0.01水平上差異顯著Represented significant difference at 0.05 and 0.01 levels, respectively.2 期李雙雙，等：生物質(zhì)炭對(duì)酸性菜地土壤N2O排放及相關(guān)功能基因豐度的影響419  關(guān) (r分別為0.58、0.68，P < 0.01)，nosZ基因豐度與NH4+-N呈顯著正相關(guān) (r = 0.60，P < 0.01)，nirS基因豐度與pH呈顯著正相關(guān) (r = 0.45，P <0.05)。 N2O排放速率與氧化亞氮還原酶的標(biāo)記基因nosZ基因拷貝數(shù)呈顯著正相關(guān) (r = 0.45，P < 0.05)，與NH4+-N含量也呈現(xiàn)顯著正相關(guān) (r = 0.54，P <0.01)，與pH則呈顯著負(fù)相關(guān) (r = 0.54，P < 0.01)。3    討論3.1    氮肥和生物質(zhì)炭聯(lián)合施用對(duì)菜地土壤N2O排放的影響微生物主導(dǎo)的N2O產(chǎn)生包括多種過(guò)程，如硝化作用、硝化細(xì)菌反硝化作用、反硝化作用、聯(lián)合反硝化及硝酸鹽異化還原過(guò)程30，受土壤pH、無(wú)機(jī)氮含量、SOC含量等眾多因素的影響。本研究CK和Bc處理的N2O累積排放量很低 (圖1)，培養(yǎng)期間土壤NH4+-N含量迅速下降，NO3-N含量相應(yīng)地迅速上升，具有較強(qiáng)的硝化作用，同時(shí)反硝化作用較弱，推測(cè)硝化作用并不是該菜地土壤N2O產(chǎn)生的主要來(lái)源。CK和Bc處理反硝化作用弱，N2O排放量也很低 (圖1)。大量研究表明，氮肥施用是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)N2O排放的重要來(lái)源1，施用氮肥能夠顯著增加酸性土壤N2O排放3133。本研究添加外源氮肥后，與CK和Bc處理相比，N和N + Bc處理顯著刺激土壤的N2O排放 (圖1)。這可能是由于：1) 長(zhǎng)期施用N肥顯著增加土壤SOC含量 (表2，P < 0.05)，為反硝化微生物的生長(zhǎng)提供充足的碳源34；2) 較高的NO3 含量為反硝化微生物提供充足的底物35 (表2)。培養(yǎng)期間N和N + Bc處理NO3-N與NH4+-N含量變化不成比例 (圖2)；添加外源氮肥后，各施氮處理土壤NH4+-N濃度維持較高水平，NO3-N被明顯消耗，NO3-N濃度維持在較低水平，表明該菜地施氮處理土壤硝化作用較弱，反硝化作用較強(qiáng)，因此推測(cè)N和N +Bc處理土壤N2O排放主要來(lái)源于反硝化過(guò)程。前人研究也表明，酸性菜地土壤中硝化作用較弱36。施用生物質(zhì)炭能夠減緩N2O排放3739。本研究中施用生物質(zhì)炭顯著減少培養(yǎng)期間菜地土壤N2O累積排放量 (圖1)，與該地區(qū)施用相同生物質(zhì)炭的大田試驗(yàn)結(jié)果一致31, 40。在本研究中，施用生物質(zhì)炭提高了土壤pH (表2)，因此土壤pH增加可能是減少酸性菜地土壤N2O排放的原因之一6。Cayuela等11分析發(fā)現(xiàn)，施用生物質(zhì)炭平均降低54%農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)N2O的排放，推測(cè)主要是由于生物質(zhì)炭的“石灰效應(yīng)”影響土壤理化性質(zhì)和微生物數(shù)量，進(jìn)而影響N2O排放。3.2    氮肥和生物質(zhì)炭聯(lián)合施用對(duì)菜地土壤氮循環(huán)相關(guān)功能基因豐度的影響氮肥施用影響土壤NH4+-N、NO3-N的含量以及pH值，進(jìn)而影響硝化過(guò)程功能基因amoA-AOA、amoA-AOB41以及反硝化過(guò)程功能基因nirK、nirS、nosZ豐度 (表2，圖3)。經(jīng)過(guò)近3年田間試驗(yàn)后，與CK和Bc相比，N和N + Bc顯著降低了amoA-AOA和amoA-AOB豐度。據(jù)報(bào)道，長(zhǎng)期施用氮肥導(dǎo)致南方紅壤和北方黑土中的amoA-AOA豐度降低42-43。盡管諸多研究表明，無(wú)機(jī)氮添加能夠顯著刺激AOB種群數(shù)量的增長(zhǎng)44，但本研究結(jié)果顯示，氮表 3   N2O排放速率與氨氧化古菌基因、氨氧化細(xì)菌、以及亞硝酸鹽還原酶基因、氧化亞氮還原酶基因與土壤理化性質(zhì)間的相關(guān)關(guān)系 ( r)Table 3   Correlation coefficients among N2O emission rate, soil physiochemical properties and ammonia-oxidizingarchaea (amoA-AOA), ammonia-oxidizing bacteria (amoA-AOB), abundance of nitrite reductase (nirK, nirS) gene,N2O reductase (nosZ) gene during incubationNER amoA-AOB amoA-AOA nosZ nirK nirS NH4+-N NO3-N pHNER 1amoA-AOB 0.32 1amoA-AOA 0.25 0.91* 1nosZ 0.45* 0.59* 0.54* 1nirK 0.26 0.26 0.23 0.04 1nirS 0.23 0.36 0.34 0.06 0.97* 1NH4+ 0.54* 0.04 0.03 0.60* 0.06 0.04 1NO3 0.18 0.58* 0.68* 0.07 0.12 0.27 0.69* 1pH 0.54* 0.85* 0.78* 0.38 0.4 0.45* 0.01 0.49* 1注（Note）：NERN 2O 排放速率 N2O emission rate; *和* 表示處理間在 0.05 和 0.01 水平上差異顯著 Represented significant differenceat 0.05 and 0.01 levels, respectively.420植 物 營(yíng) 養(yǎng) 與 肥 料 學(xué) 報(bào)24 卷肥施用顯著降低amoA-AOB的豐度，可能是由于長(zhǎng)期的氮肥施用導(dǎo)致土壤酸化，從而超出了細(xì)菌生長(zhǎng)的閾值。Geisseler等研究表明，amoA-AOB生長(zhǎng)的最適pH是5.545。本研究相關(guān)分析表明amoA-AOA豐度與pH呈正相關(guān) (r = 0.97，P < 0.05)，說(shuō)明amoA-AOA拷貝數(shù)隨土壤的酸化而顯著降低。Nicol等對(duì)pH梯度為4.97.5的草地土壤進(jìn)行的研究則發(fā)現(xiàn)amoA-AOA數(shù)量隨土壤pH降低而明顯升高46，與本研究結(jié)果相反，可能與供試土壤養(yǎng)分濃度有關(guān)。此外，amoA-AOB豐度與NO3-N呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P < 0.01，表3)，因此推測(cè)土壤中較高NO3-N含量會(huì)對(duì)amoA-AOB造成不利的影響45。本研究結(jié)果表明，生物質(zhì)炭田間施用近3年后顯著增加amoA-AOA和amoA-AOB豐度 (表2)，培養(yǎng)期間二者差異不顯著 (圖3)。Ducey等22研究也表明，培養(yǎng)6個(gè)月后，生物質(zhì)炭顯著增加了amoA-AOB豐度；也有研究表明，生物質(zhì)炭同時(shí)顯著增加amoA-AOA和amoA-AOB豐度47。生物質(zhì)炭添加對(duì)硝化作用amoA-AOA、amoA-AOB豐度和反硝化作用nirS、nirK、nosZ豐度的影響不一致11, 22, 47。本研究通過(guò)近3年田間試驗(yàn)結(jié)果顯示，N + Bc處理顯著提高土壤nirK、nirS、nosZ型反硝化功能基因豐度(表2，P < 0.05)，這可能是由于N + Bc顯著增加NO3和SOC含量 (P < 0.05，表2)，為反硝化微生物提供充足底物，刺激反硝化微生物生長(zhǎng)。因此，一方面生物質(zhì)炭對(duì)nirK和nirS基因豐度的增加促進(jìn)了土壤反硝化作用進(jìn)程，并促進(jìn)反硝化作用產(chǎn)生N2O；另一方面提高nosZ基因豐度，加速N2O還原為N2釋放到大氣中，促進(jìn)土壤反硝化作用完全進(jìn)行11, 46。重復(fù)方差分析表明，N2O排放具有顯著的培養(yǎng)時(shí)間效應(yīng) (P < 0.01，表3)。本研究中N2O排放主要集中在培養(yǎng)前期，推測(cè)主要是生物質(zhì)炭中含有的溶解性有機(jī)碳刺激反硝化微生物。已有研究表明，當(dāng)土壤中溶解性有機(jī)碳的含量增加時(shí)，N2O排放增加，這可能是由于溶解性有機(jī)碳為反硝化菌的活動(dòng)提供了能量4849。Jones等研究表明，生物質(zhì)炭添加增加土壤溶解性有機(jī)碳濃度，本身含有的溶解性有機(jī)碳在培養(yǎng)36 h以?xún)?nèi)就會(huì)被土壤微生物分解50。本研究中生物質(zhì)炭施用在一定程度上改變了反硝化微生物的組成，顯著增加nosZ型反硝化基因豐度 (圖3e)，降低土壤 (nirS+nirK)/nosZ比值，使得N2O消耗多于產(chǎn)生，最終降低其排放量，與前人研究結(jié)果一致51。這可能是生物質(zhì)炭能夠減少菜地土壤N2O排放的重要原因。Cayuela等11研究了15種農(nóng)業(yè)土壤后也指出，生物質(zhì)炭作為反硝化微生物的電子受體實(shí)現(xiàn)“電子穿梭”，把電子轉(zhuǎn)化到土壤反硝化微生物基團(tuán)中，促進(jìn)N2O還原為N2，降低N2O/(N2O + N2) 的比例，表明生物質(zhì)炭促進(jìn)反硝化作用的最后一步。另外生物質(zhì)炭的酸性緩沖能力和較大的比表面積以及電子轉(zhuǎn)移特性，促進(jìn)N2O還原為N25253。本研究中N +Bc處理的反硝化基因 (nirK、nirS、nosZ) 豐度最高，說(shuō)明其反硝化作用較強(qiáng)；相關(guān)分析也表明， (nirS +nirK)/nosZ比值與pH值呈顯著負(fù)相關(guān) (r = 0.99，P <0.01)，表明生物質(zhì)炭在酸性土壤中是通過(guò)增加土壤pH、改變反硝化的產(chǎn)物比6，進(jìn)而減緩N2O排放。本研究結(jié)果表明，生物質(zhì)炭顯著影響反硝化微生物的功能基因豐度 (nirK、nirS、nosZ)，對(duì)硝化過(guò)程中氨氧化微生物功能基因沒(méi)有顯著影響 (amoA-AOA、amoA-AOB)。因此推測(cè)生物質(zhì)炭主要是通過(guò)促進(jìn)反硝化作用最后一步，實(shí)現(xiàn)減緩酸性菜地土壤的N2O排放。4    結(jié)論在蔬菜生態(tài)系統(tǒng)中氮肥和生物質(zhì)炭聯(lián)合施用可以有效緩解菜地土壤酸化，提高土壤質(zhì)量，減少菜地土壤N2O排放，這主要?dú)w因于酸性土壤反硝化作用中的nosZ基因豐度增加，菜地土壤中 (nirS +nirK)/nosZ比值降低，反硝化作用進(jìn)行完全，促進(jìn)N2O還原為N2。但是土壤中N2O排放是物理、化學(xué)、生物學(xué)等多方面因素綜合作用的結(jié)果，生物質(zhì)炭對(duì)菜地土壤微生物的影響機(jī)制，尤其是田間長(zhǎng)期效應(yīng)及影響機(jī)制仍需深入研究。參 考 文 獻(xiàn)：IPCC. 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