018年第 期 I I 0 18,. 8 . 解淀粉芽孢桿菌 （ Bacillus amyloliquefaciens ） 是 一類重要的植物根際益生菌 ， 能夠促進(jìn)植物生長或 防治土傳病害 1 。 其基因組中 10 的基因參與抗菌 素的合成 ， 能夠直接抑制土壤中多種病原微生物的 生長 2 ， 細(xì)胞內(nèi)合成的一些揮發(fā)性次級代謝產(chǎn)物 ， 例 如 3-羥基丁酮 、 2-氨基苯甲酸及脂肽等 ， 還可以作為 激活因子誘導(dǎo)植物產(chǎn)生免疫反應(yīng) 3 -4 ， 增強(qiáng)植物對病 原微生物的抗性 。 此外 ，噴施解淀粉芽孢桿菌菌劑后 幾乎不會影響根際土壤中微生物群落組成 5 。 因此 ， 解淀粉芽孢桿菌是重要的綠色生防菌劑候選菌株 。 已有的研究表明 ， 一些具有生物防治作用的解淀粉 芽孢桿菌能夠在小麥 1 、 白菜 、 煙草 6 及香蕉 7 等植物 解淀粉芽孢桿菌 B6 在番茄根部定殖及 對番茄枯萎病盆栽防效初步研究 王 靜 ， 寧燕夏 ， 李黃維 ， 劉 娜 ， 邱佳俊 （ 北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 ， 寧夏銀川 750021 ） 摘要 ： 采用利福平選擇標(biāo)記解淀粉芽孢桿菌 B6 ， 于土培及水培條件下研究其在番茄根部定殖情況及對番茄枯萎病 的防治效果 。 結(jié)果表明 ，番茄種子出芽后 4 19 d ， 根表及根際均能成功檢測標(biāo)記菌株 B6 R 。 在根表 ， 標(biāo)記菌株 B6 R 定殖 密度 4 d 時達(dá)最高 ， 后逐漸下降 ， 16 19 d 穩(wěn)定在 7.40 10 5 cfu/g 。 在根際 ， 標(biāo)記菌株 B6 R 定殖密度先升高后降低 ， 菌體 數(shù)量穩(wěn)定在 2.53 10 6 cfu/g 。 水培條件下 ， 能夠觀察到標(biāo)記菌株 B6 R 在番茄根部附著定殖 。 室內(nèi)盆栽試驗顯示 ， 解淀粉 芽孢桿菌 B6 能夠較好防治尖孢鐮刀菌引起的番茄枯萎病 ， 防治效果達(dá) 64 . 35 。 關(guān)鍵詞 ： 解淀粉芽孢桿菌 ； 定殖 ； 番茄枯萎病 ； 防效 中圖分類號 ： 482.292 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ： A 文章編號 ： 1672-6820 （ 2018 ） 03-0019-05 收稿日期 ： 2017-07-12 ； 修回日期 ： 2018-01-03 基金項目 ： 寧夏高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項目 （ GY2016138 ）； 北方民族大學(xué)人才引進(jìn)啟動項目 （ 4400302550 ）； 寧夏科技支撐計劃項目 （ 重大 專項 ）（ 寧科技字 （ 2015 ） 26 號 ） 作者簡介 ： 王靜 ， 博士 ， 講師 ， 研究方向為植物逆境生物學(xué) 。 - mail ： wangjing_imu163 .com 。 e u z Bacillus amyloliquefaciens ee Fusarium w Wang ing, ing Yanxia, Li Huangwei, Liu a, Qiu iajun （ ollege of biological science and engineering, orth Minzu University, Yinchuan ingxia 750021, hina ） : olonization of Bacillus amyloliquefaciens B6 in tomato roots in soil and hydroponic system condition were studied by marker of rifampicin resistant mutant, and its controlling efficiency against tomato Fusarium wilt were assessed. The results showed that B6 R could colonize effectively on tomato roots surface and rhizosphere between 4 d to 19 d after sprouting. On root surface, the colonization density reached the highest level on 4 th day after sprouting, and then declined, and between 16 d to 19 d, quantity of B6 R maintained 7.40 10 5 cfu/g, and the colonization density on rhizosphere maintained 2.53 10 6 cfu/g. n hydroponic system, B6 R was also well colonized on tomato root. Based on pot experiment in lab, B6 strain showed good controlling efficiency of 64.35 against tomato Fusarium wilt. e w: Bacillus amyloliquefaciens ; colonization; Fusarium wilt; control efficiency 19 018 年第 期 I I 0 1 8,. 8 . 根際成功定殖 。 其在植物根際定殖能力的強(qiáng)弱決定 著其作用效果的高低 ， 檢測微生物在植物根際的定 殖行為是確定生防菌株防治潛力的重要依據(jù) 6 。 番茄枯萎病是由番茄?；图怄哏牭毒?（ F . oxysporum f . sp . lycopersicisnyderetet Hansen ） 侵染所 引起的土傳性病害 。 其主要為害番茄的根 、 莖部 ， 大 量繁殖后 ， 阻塞維管束 ， 阻止根部向上輸送水和營養(yǎng) 物質(zhì) ， 致使植株缺乏水分和營養(yǎng)而死亡 ， 是威脅番茄 產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病害之一 8 。 解淀粉芽孢桿菌 B6 是本課題組前期篩選獲得的對尖孢鐮刀菌具有良好 拮抗作用的細(xì)菌 。 筆者研究了該菌在番茄根部的定 殖能力及對番茄枯萎病的防治效果 ， 以期為其商業(yè) 化應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ) 。 1 材料與方法 1 .1 試驗材料 解淀粉芽孢桿菌 （ Bacillus amyloliquefaciens ） B6 和番茄枯萎病菌 （ F . oxysporum f . sp . lycoper - sicisnyderetet Hansen ） 均由本實驗室保存 。 番茄種子 （ 毛粉 1號 ） 為寧夏地區(qū)栽培品種 。 1 . 標(biāo)記菌株 的篩選及遺傳穩(wěn)定性鑒定 將解淀粉芽孢桿菌 B6劃線接種于含 5 g/mL 利福平的 LB 上 ， 待長出菌落后 ， 轉(zhuǎn)入下一個高濃度 利福平 LB 培養(yǎng)基 ， 漸進(jìn)濃度為 10、 20、 40、 60、 80、 100 、 200 、 300 g/mL 。 直至篩選出能夠在含 300 g/ mL 利福平的 LB 培養(yǎng)基上穩(wěn)定生長 ， 且對致病菌拮 抗作用不變的標(biāo)記菌株 B6 R 。 取標(biāo)記菌株 B6 R 單菌落 ， 接種于不含利福平的 10 mL LB 培養(yǎng)基 ， 28 ， 150 r/min ， 培養(yǎng) 12 h ， 從中 取 10 L 培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至不含利福平的 LB 培養(yǎng)基 ， 同 樣條件 ， 培養(yǎng) 12 h ， 以此類推 ， 連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng) 8次后 ， 取 100 L 培養(yǎng)液 ，涂布于不含利福平的 LB 平板 ， 28 ， 倒置培養(yǎng) 24 h 。 隨機(jī)選 100 個 B6單菌落劃線接 種于含 300 g/mL 利福平的 LB 平板 ， 以抗性菌株所 占百分比計算標(biāo)記菌株 B6 R 的遺傳穩(wěn)定性 。 1 . 標(biāo)記菌株 在番茄根部的的定殖能力檢測 取標(biāo)記菌株 B6 R 單菌落接種于 10 mL 含 300 g/mL 利福平的 LB 培養(yǎng)基中 ， 28 ， 150 r/min ， 培 養(yǎng) 12 h 。 取其 1 mL 培養(yǎng)液接種于含 300 g/mL 利 福平 100 mL LB 培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng) ， 28 ， 150 r/min ， 培養(yǎng) 24 h ， 血球計數(shù)板計數(shù) ， 調(diào)整菌體濃度為 1 10 8 cfu/mL ， 待用 。 用升汞對番茄種子 表面消毒 ， 無 菌水 沖洗 8次 ， 30 溫 水 浴催 芽 2 h 后 ， 在 鋪 有 5層無 菌 濾紙 的 15 cm 培養(yǎng) 皿 中 28 培養(yǎng)至出芽 。 培養(yǎng)基質(zhì) 經(jīng) 180 干熱滅 菌 3 h ， 晾涼 后 裝 入直 徑 為 8 cm 育苗盆 中 （ 100 g/ 盆 ）。 將出芽的番茄種子平 鋪 于基質(zhì) 表面 ， 在 種子 周圍澆灌 1 mL 標(biāo)記菌株 B6 R 培養(yǎng)菌液 （ 1 10 8 cfu/mL ）， 覆蓋 0. 5 cm 厚 的基質(zhì) 。 將 育苗盆放 入 光照 培養(yǎng) 箱 培養(yǎng) ， 培養(yǎng)條件為 28 下 光照 12 h ， 22 下 黑暗 12 h 。 施加無 菌水為 陰 性對 照 。 待番茄出芽 4 d 后 采 樣 ， 每 3 d 取樣 1次 ， 連續(xù) 取 6次 。 分 別 取根際土 、 根 表 土測定標(biāo)記菌株 B6 R 菌 數(shù) 。 取根際土 ： 從 育苗盆 培養(yǎng)基質(zhì)中取出 幼苗 ， 抖 動 根部 ， 收集 土 壤 ， 稱 重后置于含有 10 mL 無 菌水 三角瓶 中 ， 100 r/min ， 振蕩 30 min ， 此 溶 液為根際土 溶 液 。 取根 表 土 ： 將 已采集過 根際土的植株 ， 剪 其 表面帶 土的根 系 ， 準(zhǔn) 確 稱 重 ， 后 放 入含有 10 mL 無 菌水的 三角瓶 中 ， 100 r/min ， 振蕩 30 min ， 取出根 系 ， 吸干 ， 再 次 稱 重 ， 兩 次質(zhì)量 差值 為根 表 土重量 ， 溶 液 為根 表 土 溶 液 。 將 三角瓶 中的 溶 液 搖勻 后 ， 取 1 mL 溶 液 ， 逐級稀釋 5次 。 取 各級稀釋溶 液 10 L 點到 含有 300 g/mL 利福平的 LB 培養(yǎng)基上 ， 重 復(fù) 6次 ， 28 培養(yǎng) 24 h ， 統(tǒng) 計菌落數(shù) ， 計算定殖 密 度 （ D ）。 D = （ N j 稀釋倍 數(shù) ） /Z 式 中 ： D 為 1 g 土中含有標(biāo)記菌株 B6 R 菌數(shù) （ cfu/g ）； N j 為同一 稀釋 濃度 6次重 復(fù) 的平均菌落 數(shù) ； Z 為根際 （ 根 表 ） 土質(zhì)量 （ g ）。 1 .4 標(biāo)記菌株 在水培番茄根部的的定殖檢測 采 用 Hoagland 營養(yǎng)液培養(yǎng)番茄 幼苗 。 將 露白 番 茄種子 播 種于 72孔 1. 5 mL 凍 存 盒表面 ， 盒內(nèi)裝已 滅 菌 Hoagland 營養(yǎng)液 ， 蓋蓋 保 濕 ， 置于培養(yǎng) 箱 培養(yǎng) 7 d ， 待 幼苗 長出 真葉 后 ， 開蓋 培養(yǎng) 7 d 。 取 B6 R 單菌落 接種于 10 mL 含 300 g/mL 利福平的 LB 培養(yǎng)基 中 ， 28 ， 150 r/min ， 培養(yǎng) 12 h ， 取 1 mL 培養(yǎng)液接種 于 100 mL 含 300 g/mL 利福平 LB 培養(yǎng)基擴(kuò)大培 養(yǎng) ， 28 ， 150 r/min ， 培養(yǎng) 24 h 后 ， 收集 菌體 ， 無 菌水 漂洗 菌體 3次 ， 調(diào) 節(jié) 菌體濃度為 1 10 8 cfu/mL ， 待用 。 將番茄 幼苗 根部 浸泡 于枯萎病病菌菌液中 ， 室 溫靜 置 15 min ， 濾紙吸干表面 液體 ， 重 新 將 幼苗 置 20 018 年第 期 I I 0 18 ,. 8 . B6 B6 R B6 R 無菌水 圖 1 解淀粉芽孢桿菌 （ B. amyloliquefaciens ） 與 皿內(nèi)拮抗致病菌效果 類別 4 d 7 d 10 d 13 d 16 d 19 d 根表 9.56 5.85 2.56 1.26 0.67 0.74 根際 3.52 5.63 4.42 1.25 1.37 2.53 表 1 解淀粉芽孢桿菌 （ B. amyloliquefaciens ） 標(biāo)記菌株 在番茄根表土及根際土的定殖密度 10 6 cfu/g a b a. 未接種標(biāo)記菌株 b. 接種標(biāo)記菌株 圖 解淀粉芽孢桿菌 （ B. amyloliquefaciens ） 標(biāo)記菌株 在番茄根部的定殖 于 Hoagland 營養(yǎng)液中液體培養(yǎng) 。 接種 5 d 后 ， 剪取 根系 ， 無菌水漂洗 3次 ， 濾紙吸干 ， 將其按壓于含 300 g / mL 利福平 LB 培養(yǎng)基進(jìn)行組織印記 ， 隨機(jī) 選取 3個菌落進(jìn)行拮抗驗證試驗 ， 顯微鏡下觀察標(biāo) 記菌株 B6 R 在番茄根部定殖情況 。 1 .5 盆栽試驗 解淀粉芽孢桿菌 B6經(jīng)活化及擴(kuò)大培養(yǎng)后 ， 調(diào) 節(jié)菌體濃度至 1 10 8 cfu/mL ， 待用 。 選取番茄種子消 毒并催芽后 ， 每盆播種 2 粒種子于裝有滅菌基質(zhì)的 育苗盆 （ d =8 cm ） 中 ， 滅菌土與致病菌按照 30 :1（ W/ V ） 比例混合 。 向播種后在種子周圍施加 1 mL B6 培 養(yǎng)液 （ 1 10 8 cfu/mL ）， 以施加無菌水作為陰性對照 。 溫室中培養(yǎng) 40 d 后觀察番茄幼苗發(fā)病情況 。 番茄枯 萎病病情分級標(biāo)準(zhǔn) 9 ： 0 級 ， 無癥狀 ； 1級 ， 1片或 2 片 葉子明顯變黃 ； 2 級 ， 3片或 4片真葉變黃 ， 葉片萎蔫 下垂 ； 3級 ， 5片或 6片真葉變黃或真葉萎蔫下垂 ； 4 級 ， 全株嚴(yán)重萎蔫 ， 以致枯死 。 計算病情指數(shù)和相對 防治效果 。 試驗重復(fù) 3次 。 病情指數(shù) = （ 病級株數(shù) 代表級數(shù) ） /（ 植株總 數(shù) 最高代表級數(shù) 4） 100 相對防治效果 （ ） = （ 對照病情指數(shù) -B6處理 病情指數(shù) ） /對照病情指數(shù) 100 結(jié)果與分析 .1 標(biāo)記菌株 的篩選及遺傳穩(wěn)定性 逐步提高利福平濃度 ， 獲得能夠在 300 g/mL LB 培養(yǎng)基生長的標(biāo)記菌株 B6 R ， 在 A 平板上與原 始菌 B6具有相同的拮抗致病菌的效果 （ 圖 1）。 經(jīng)不 含利福平的 LB 液體培養(yǎng)基連續(xù)轉(zhuǎn)接 8 次的標(biāo)記菌 株 B6 R ， 涂布于 LB 培養(yǎng)基上 ， 隨機(jī)挑取 100 個菌落 ， 均可以在含有 300 g/mL LB 培養(yǎng)基中正常生長 ， 可 見標(biāo)記菌株 B6 R 的利福平標(biāo)記穩(wěn)定性強(qiáng) 。 . 標(biāo)記菌株 在番茄根部的的定殖能力 經(jīng) B6 R 菌液澆灌番茄種子 ， 出芽后檢測其在番 茄幼苗根表土及根際土中的含量 。 出芽 4 d 后 ， 番茄 幼苗根表土 B6 R 含量最高 ， 達(dá) 9.56 10 6 cfu/g ， 隨后菌 體數(shù)量逐漸下降 ， 出芽后 16 d ， 菌體數(shù)量穩(wěn)定存在 ， 維持在 10 5 cfu/g 。 根際土中 B6 R 含量呈先增加后減 少趨勢 ， 最終穩(wěn)定在 10 6 cfu/g 。 . 標(biāo)記菌株 在水培番茄根部的的定殖檢測 水培番茄幼苗 ， 標(biāo)記菌株 B6 R 浸根后 ， 繼 續(xù)培 養(yǎng) 。 如 圖 2a 所示 ， 未接種標(biāo)記菌株 B6 R 的番茄幼苗 根表 光滑 ， 輪廓清晰 。 接種標(biāo)記菌株 B6 R 的番茄幼苗 根表有明顯的 細(xì) 菌 斑塊附著 ， 如 圖 2b 所示 。 經(jīng)根部 組織印記 實 驗 ， 根部 附著 菌可在 300 g/mL 利 福平 LB 培養(yǎng)基生長 ， 且 與 B6具有相同拮抗致病菌作用 ， 如 圖 3所示 ， 根部 附著 菌為標(biāo)記菌株 B6 R 。 .4 對盆栽番茄枯萎病的防治效果 澆灌無菌水對照幼苗 （ K ） 的病情指數(shù)為 21 018 年第 期 I I 0 1 8,. 8 . 圖 解淀粉芽孢桿菌 （ B. amyloliquefaciens ） 與 水培番茄根部附著菌拮抗致病菌效果 （ 44.51 2.1）， 澆灌 B6菌液幼苗的病情指數(shù)為 （ 15.85 1.3）， 防治效果為 64.35 。 可見 ， 解淀粉芽孢 桿菌 B6能夠較好的防治番茄枯萎病 （ 圖 3）。 討論 植物根系能夠分泌多種氨基酸 、 糖以及有機(jī)酸 等營養(yǎng)物質(zhì) ， 為微生物生長提供了優(yōu)良的環(huán)境 10 。 生 防菌利用營養(yǎng)物質(zhì)在植物根部大量定殖是發(fā)揮其生 防作用的先決條件 ， 對土傳病害的有效防治至關(guān)重 要 。 目前 ， 研究微生物在植物根際的定殖行為以及能 力 ， 可以通過抗生素選擇標(biāo)記 、 GF 熒光標(biāo)記 11 以及 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽 12 等方法 。 本研究采用抗生素利福平標(biāo) 記 ， 研究前期實驗中獲得的解淀粉芽孢桿菌 B6在 番茄根部的定殖行為 。 利福平抗生素標(biāo)記菌 B6 R 經(jīng) 多代繁殖后 ， 抗生素標(biāo)記仍穩(wěn)定存在 。 通過 300 g/ mL 利福平篩選 ， 極易對土樣中 B6 R 計數(shù) ， 施加 B6 R 26 d 后 ， 番茄根表及根際土中 B6 R 定殖密度分別為 7.40 10 5 及 2.53 10 6 cfu/g ， B6 R 成功定殖 。 水培試驗 中 ， 同樣能夠看到番茄根部附著菌斑 。 若采用 GF 標(biāo)記目的菌株 ， 熒光顯微鏡下更易觀察 ， 這是較抗生 素標(biāo)記法的方便之處 。 有學(xué)者在研究一些植物益生桿菌在根部定殖行 為時發(fā)現(xiàn) ， 施加菌 3個月后 ，菌體密度會迅速降低 13 。 本試驗結(jié)果顯示 ， 標(biāo)記菌株 B6 R 在番茄根部和根際 土中其含量隨時間呈先增加后減少趨勢 ， 最終穩(wěn)定 在 10 6 cfu / g 。 解淀粉芽孢桿菌 B6能夠抑制尖孢鐮刀菌生 長 ， 盆栽試驗中對番茄枯萎病防效達(dá) 64.35 ， 具有 較好的防治作用 。 有研究表明 ， 商品化的解淀粉芽孢 桿菌 FZB42T 的基因組中有 10個基因簇參與合成 抗菌類物質(zhì) ， 例如環(huán)脂肽 、 聚酮化合物以及高度修飾 的細(xì)菌素等 5 ， 合成的多種抗菌物質(zhì)是解淀粉芽孢 桿菌具有廣譜抑菌效果的 原 因之一 。 化學(xué) 農(nóng)藥濫 用 威脅人 類生 活 ， 對病 、 蟲 害的 綠色 防 控越來越受 到重 視 。 目前 ， 全球已開 發(fā) 出 多種以根 際植物益生菌為 主 要成分的生防菌 劑 。 B 研究表 明 ， 全球市場 2013年 采 購 生防菌 劑耗資 54.8 千萬 美元 ， 2019 年預(yù) 計 將 增長至 83.7千萬美元 ， 生防菌 劑 對可 持續(xù)農(nóng)業(yè) 的發(fā) 展起 重要的 促進(jìn) 作用 14 。 解淀 粉芽孢桿菌 不僅 能夠抑制多種病 原 微生物 ， 還 可以 通過發(fā) 酵 大量生 產(chǎn) ， 易 于 商品化 ， 是 開 發(fā)生防菌 劑 的 寶貴資源 。 參考文獻(xiàn) 1 楊洪鳳 ， 余向陽 ， 薛雅蓉 等 . 內(nèi) 生解淀粉芽孢桿菌 09 在 小麥 根部定殖的 電 鏡觀察及防病效果 . 中 國 生物防治學(xué) 報 ， 2014 ， 30（ 6）： 839-844. 2 hen X H ， Koumoutsi A ， cholz R et al . 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