第 37 卷 第 2 期 西 南 林 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) Vol37 No22017 年 3 月 JOUNAL OF SOUTHWEST FOESTY UNIVESITY Mar2017doi: 10 11929/j issn 20951914 2017 02 010菊花黃化突變體初步研究盧珍紅1莫錫君1蔣亞蓮1余蓉培1周旭紅1田 敏1楊 曉2桂 敏1( 1 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所 ， 云南 昆明 650100; 2 云南豐島花卉有限公司 ， 云南 昆明 650100)摘要 : 以菊花 霞光飛躍 葉色突變體和正常植株為試驗(yàn)材料 ， 對(duì)其葉綠素含量進(jìn)行測(cè)定 ， 并進(jìn)行無參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析 。結(jié)果表明 : 突變體與正常植株相比 ， 葉綠素含量有較大幅度的下降 ， 僅為正常植株的 18%左右 ， 葉綠素 a/b 比值 ( Chl a/b) 顯著升高 。利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分別從突變體與正常植株葉片中獲得 4. 75 Gb 和 4. 96 Gb 有效數(shù)據(jù) ( Clean Data) ， de novo 組裝后得到 105 456條通用基因 ( Unigenes) ， 其中長(zhǎng)度大于 1 kb 的有 15 493 條 ， N50 為 1 556 bp。對(duì) Unigenes 表達(dá)分析 ， 共獲得 3 762 條差異表達(dá)基因 ( DEGs) 。對(duì)得到的 DEGs 進(jìn)行生物學(xué)功能性注釋 ， 獲得總注釋信息為 2 741。通過對(duì)注釋信息進(jìn)行 GO 和 KEGG 富集分析 ， 結(jié)合定量 PC 驗(yàn)證表明 ， 菊花霞光飛躍 葉色突變體形成的原因可能是 dmGLK2 低水平表達(dá)和 dmGLK1 不表達(dá)導(dǎo)致葉綠體合成和分裂受阻 ， 葉片細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)量大大降低 ， 進(jìn)而葉綠素含量下降 。關(guān)鍵詞 : 菊花 ; 突變體 ; 無參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 ; 差異基因中圖分類號(hào) : S722. 3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 : A 文章編號(hào) : 20951914( 2017) 02006009The Preliminary Study of Chlorina Mutant inDendranthema morifoliumLu Zhenhong1， Mo Xijun1， Jiang Yalian1， Yu ongpei1， Zhou Xuhong1， Tian Min1， Yang Xiao2， Gui Min1( 1 Flower esearch Institute， Yunnan Agriculture Academy Science， Kunming Yunnan 650100， China;2 Yunnan Fengdao Flower Co Ltd， Kunming Yunnan 650100， China)Abstract: The photosynthetic pigment content and de novo NA-Seq were investigated in leaf-color mutantand normal plant of Dendranthema morifoliumXiaguang Feiyue The results showed that the photosynthetic pig-ment content had decreased greatly of mutant plants， only about 18 percent of normal plants， but the Chl a/b ob-servably increased in mutant plant We generated 4. 75 Gb and 4. 96 Gb clean datum from the mutant and normalplant leaves using transcriptome sequencing， respectively De novo assembly yielded 105 456 unigenes with 15 493of length greater than 1 kb， 1556 bp of N50 For unigenes expression analysis， we got 3762 differentially expressedgenes ( DEGs) ， and obtained 2 741 annotations by functional annotation of the DEGs Using GO and KEGG enrich-ment analyses， and qPC verification， results indicated that forming reason of the chlorina mutant of D. morifoliumXiaguang Feiyuemay be expressed at low level of dmGLK2 and dmGLK1 not expressed cause chloroplast devel-opment and division blocked， chloroplast number is greatly reduced in leaf cells， thus the content of chlorophyll isoverall declined And the study will supply meaning information to the future studies on leaf-color mutants and di-rectional breeding of D. morifoliumKey words: Dendranthema morifolium， mutant， de novo NA-Seq， DEGs收稿日期 : 20160803; 修回日期 : 20160831基金項(xiàng)目 : 云南省重大科技專項(xiàng)課題二 ( 2016ZA006) 資助 。第 1 作者 : 盧珍紅 ( 1982) ， 女 ， 助理研究員 。研究方向 : 觀賞植物遺傳育種 。Email: lzh9836 163com。通信作者 : 桂敏 ( 1961) ， 女 ， 研究員 。研究方向 : 觀賞植物良種繁育和品種推廣 。Email: gming-114 163com。葉色變異是高等植物中常見的可以自然發(fā)生的性狀變異 ， 普遍存在于各種植物中 ， 運(yùn)用理化誘變和組織培養(yǎng)等方式更易誘發(fā)葉色變異 ， 獲得葉色突變體 1。研究葉色突變體具有重要的應(yīng)用價(jià)值 ， 尤其是在觀賞植物中 ， 培育具有較高觀葉價(jià)值的新品種是觀賞植物育種的重要目標(biāo) 2。觀賞植物常在組織培養(yǎng)過程中產(chǎn)生葉色變異 ， 目前已在文心蘭 ( Oncidium hybridum) 2、紅掌 ( Anthu-rium andraeanum) 3和大花蕙蘭 ( Cymbidium hybri-dum) 4等觀賞植物中發(fā)現(xiàn)很多不同類型的葉色突變體 ， 對(duì)表型 、色素生理 、細(xì)胞結(jié)構(gòu)及分子等方面進(jìn)行了變異機(jī)理分析 ， 不同材料的研究結(jié)果不盡相同 。在水稻 ( Oryza sativa) 5等模式植物上 ，構(gòu)建了許多葉色突變體 ， 這些突變體的葉色變異大多數(shù)通過葉綠素合成與代謝途徑 、葉綠體發(fā)育與形成 、以及核質(zhì)間互作相關(guān)的基因突變或者調(diào)控方式的改變 ， 引起相關(guān)生理過程的變化 ， 最終導(dǎo)致葉色突變 。目前 ， 高等植物中涉及葉色變異的位點(diǎn)有 700 個(gè) 6， 均參與了葉色形成過程中的發(fā)育 、代謝或信號(hào)傳導(dǎo)等途徑 。菊花 ( Dendranthema morifolium) 為多年生宿根植物 ， 是四大切花之一 ， 其產(chǎn)量和銷量均位于世界花卉前列 。1989 年 Lemieux 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功獲得第 1 株轉(zhuǎn)基因菊花 7， 開創(chuàng)了菊花分子育種的新途徑 。目前 ， 菊花已在化學(xué)成分和中藥理學(xué) 89、組織培養(yǎng) 1011、植物病害 1213和轉(zhuǎn)基因育種 1415等方面取得了大量研究進(jìn)展 ， 但對(duì)菊花葉色突變體方面的研究很少報(bào)道 。挖掘菊花葉片觀賞價(jià)值 ， 開發(fā)即能觀葉又能觀花的菊花新品種 ， 不論是對(duì)菊花觀葉特性研究還是對(duì)其市場(chǎng)都具有重大意義 。本研究以菊花 霞光飛躍 ( D. morifoliumXiaguang Feiyue) 正常株和黃化葉突變體 dmy01 為試驗(yàn)材料 ， 分析比較葉片光合色素含量變化 ， 并利用無參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù) ( de novoNA-seq) 對(duì)材料進(jìn)行測(cè)序和基因表達(dá)差異性分析 ， 旨在找到菊花黃化變異的原因 ， 為合理利用這一新品種提供參考依據(jù) 。1 材料與方法1. 1 材料來源菊花 霞光飛躍 采自中國(guó)云南省昆明市云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉種植基地 ， 供試材料之一為菊花霞光飛躍 離體再生培養(yǎng)過程中獲得的體細(xì)胞無性系黃綠葉突變體 ， 命名為 dmy01; 離體培養(yǎng)正常生長(zhǎng)的為其野生型 。自 2010 年開始從組培誘導(dǎo)獲得的再生植株中篩選 、純化出 ， 其黃綠葉性狀在離體增殖培養(yǎng)過程中保持穩(wěn)定 。突變體 dmy01 的葉片呈現(xiàn)黃色 ( 圖 1) 。選取 34 個(gè)月的突變株和正常植株的組培苗用于試驗(yàn) 。組培試驗(yàn)在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所花卉培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 組培室溫度 ( 23 2) ， 光照 10 h/d， 光照強(qiáng)度 2 0002 500 lx。圖 1 菊花 霞光飛躍 正常植株與 dmy01 表型圖片F(xiàn)ig. 1 Phenotypic photographs of mutant dmy01 and normalplant of D. morifoliumXiaguang Feiyue1.2 試驗(yàn)方法1.2.1 葉綠素含量測(cè)定取突變體 dmy01 和正常植株新鮮葉片 ， 剪取葉片中段 ， 去葉脈 ， 稱取 0. 2 g， 以 80%丙酮室溫下遮光研 磨 提 取 ， 使 用 Unican UV 300 分 光 光 度 計(jì)( Thermo， 美 國(guó) ) 測(cè) 定溶液吸光度 A663、A646。參照 Lichtenthaler 16提出的公式計(jì)算葉綠 a ( Chloro-phyll a， Chl a) 、葉綠素 b ( Chlorophyll a， Chl b) 、總?cè)~綠素 ( Chlorophyll， Chl) 。葉綠素含量測(cè)定重復(fù)3 次 。1.2.2 無參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析1) 總 NA 提取和 cDNA 文庫建立 。取突變體dmy01 和正常植株的組培苗的葉片 ， 總 NA 提取使用 Neasy Plant Mini Kit ( Qiagen， Hilden， Germany)( 試劑盒 ) 。用 Illumina TruSeq NA Sample Prep Kit以及 Ultra NA Library Kit for Illumina 進(jìn)行文庫的構(gòu)建 。文庫構(gòu)建完成后 ， 使用 Agilent 2100 對(duì)文庫的濃度和插入片段大小 ( Insert Size) 進(jìn)行檢測(cè) ， 檢測(cè)合格后使用 Illumina HiSeq 2500 高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì) cDNA 文庫進(jìn)行 NA-Seq 測(cè)序 。2) De novo 組裝和生物學(xué)功能注釋 。去除 A-dapter 和全部為 N 的序列 ， 得到較高質(zhì)量的讀段16第 2 期 盧珍紅等 : 菊花黃化突變體初步研究( Clean reads) 。使用 Trinity 17進(jìn)行序列 De novo 組裝 ， 獲取 Unigenes， 并對(duì)轉(zhuǎn)錄組文庫進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估 。使用 BLAST 18軟件 ( Version 2. 2. 26) 將 Unigenes序 列 與 nr 19、Swiss-Prot 20、GO 21、COG 22、KEGG 23數(shù)據(jù)庫比對(duì) ， 獲得 Unigenes 的注釋信息 。3) 基因表達(dá)量和差異表達(dá)分析 。采用 Bowtie 24將各樣品測(cè)序得到的 reads 與 Unigenes 庫進(jìn)行比對(duì) ， 根據(jù)比對(duì)結(jié)果 ， 結(jié)合 SEM 25進(jìn)行表達(dá)量水平估計(jì) 。利用 FPKM 26值表示對(duì)應(yīng) Unigenes 的表達(dá)豐度 。采用 DESeq 27進(jìn)行樣品組間的差異表達(dá)分析 ， 獲得兩個(gè)條件之間的差異表達(dá)基因集 ， 篩選標(biāo)準(zhǔn)為 FD 0. 01 且差異倍數(shù) ( Fold Change) 2。根據(jù)差異表達(dá)基因功能注釋和富集分析 ， 篩選出與葉色變異相關(guān)的候選基因 。FPKM 計(jì)算公式 :FPKM=比對(duì)到 cDNA 上的片段數(shù) / 被映射序列總數(shù) ( 單位 : 106) 轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度 ( 單位 : kb) 。4) 定量 PC ( qT-PC) 驗(yàn)證 。為了進(jìn)一步驗(yàn)證候選基因的表達(dá) ， 選擇了 10 個(gè)候選基因進(jìn)行定 量 PC 分 析 。分別提取與測(cè)序樣品一致 的dmy01 和正常植株的葉片的總 NA， 用 DNase I( amplification grade， Invitrogen， USA) 處理后 用oligo ( dT) 引物和反轉(zhuǎn)錄試劑盒 ( SuperScript IIIeverse Transcriptase， USA) 合成 cDNA。在 BioadCFX96 PC 儀器上完成定量 PC 實(shí)驗(yàn) ， 引物如表 1所示 ， 每個(gè)基因重復(fù) 3 次 ， 以 actin2 作為內(nèi)參基因 ， 基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平計(jì)算公式為 2ct 28。表 1 qT-PC 引物Table 1 Primer sequences for qPC酶 基因 ID引物序列左端 右端GLK1 c74406graph_c0 CAGCTTCAACTGCCTCCAGT CCGAACGATCTCAACACGTCGLK2 c67958graph_c0 ACTTTCCTCTACCTGGCCAC GCTAGGTCTCGCTTTGATGGELIP1 c76530graph_c0 ACTCGCCAGGCAAAAGGAAT TCCTCAATCCTCGCTGCCAAStaygreen protein c68219graph_c0 TGCTCCTCATCCACCATTGT TGGCAAGTAGATGAGGTGGAPsbO c23577graph_c0 GGAGTCACCATTGATATTTGACA TGACTGTGGCTTTCGTTTGAPsbP c72231graph_c0 TGGCTTATTTGCAGCTTCCC ATCTCGGCCACAAACCATCAPsbY c67901graph_c0 GTGATGTGTCGCCAGCCTAT TGCCATCGGGGTTATCACACPsb28 c66902graph_c0 CCTTGAAACCCATCCGATCA ATGATCGCGTAACGTCTAGGHemE c74449graph_c0 TCCCTCAGTTCTCACGGCAA CTGATCAAATCACGGGCAGTHemC c72883graph_c1 TACTCGTCCAGCTTCCTCCA CCTCAATTGCCAGCCCCATT2 結(jié)果與分析2. 1 光合色素含量變化如表 2 所示 ， dmy01 的葉綠素遠(yuǎn)低于正常植株的對(duì)應(yīng)含量 ， dmy01 的 Chl a、Chl b、Chl 的含量分別為正常植株的 19.25%、17.62%、18.80%。dmy01 的 Chla/Chl b 比值顯著高于正常植株的比值 ( P 0.05) 。2. 2 無參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析2. 2. 1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與 de novo 組裝將提取的總 NA 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 ， 突變體dmy01 與正常植株測(cè)序 Clean Data 分別為 4. 75 Gb 和4. 96 Gb， Q30 堿基百分比分別為 89. 62%和 89. 91%，GC 含量百分比分別為 48. 07%和 48. 04%， 錯(cuò)誤率在 0. 01%以內(nèi) ( 表 3) 。說明這些序列具有相當(dāng)高的質(zhì)量 ， 可以用于下一步的 de novo 組裝 。使用Trinity 組裝 ， 共得到 212675 條轉(zhuǎn)錄本和 105456 條Unigenes， 其中長(zhǎng)度在 1 kb 以上 Unigenes 有 15 493條 ， 轉(zhuǎn)錄本與 Unigenes 的 N50 分別為 1 924 bp 和1 556 bp ( 表 4) 。表 2 突變體 dmy01 與正常植株的光合色素含量Table 2 Chlorophyll contents of mutant dmy01 and normal plant樣品 葉綠素 a /( mgg1) 葉綠素 b/( mgg1) 總?cè)~綠素 /( mgg1) 葉綠素 a/b正常植株 1. 231 0. 055a0. 471 0. 052a1. 702 0. 107a2. 614 0. 032b突變體 0. 237 0. 017b0. 083 0. 007b0. 320 0. 093b2. 855 0. 081a注 : 不同小寫字母表示差異顯著 。26 西 南 林 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 第 37 卷表 3 序列質(zhì)量Table 3 Quality of sequences樣品 可讀取序列總數(shù) 序列總數(shù) GC/% Error/% Q20/% Q30/%正常植株 19 704 895 4 963 680 751 48. 04 0. 01 94. 32 89. 91突變體 18 851 105 4 749 039 622 48. 07 0. 01 94. 16 89. 62表 4 轉(zhuǎn)錄本與 Unigenes 長(zhǎng)度分布Table 4 Length distribution of assembled transcripts and unigenes核苷酸長(zhǎng)度/bp轉(zhuǎn)錄本數(shù)目 百分比 /%Unigenes數(shù)目 百分比 /%200300 67 342 31. 66 49 127 46. 59300500 48 232 22. 68 22 741 21. 565001 000 34 857 16. 39 14 737 13. 971 0002 000 37 429 17. 60 10 428 9. 892 000+ 24 815 11. 67 8 423 7. 99總條數(shù) 212 675 105 456總序列長(zhǎng)度 263 614 916 75 345 153N50 長(zhǎng)度 1 924 1 556平均長(zhǎng)度 1 239. 52 714. 472. 2. 2 差異表達(dá)基因分析及功能注釋運(yùn)用 FPKM 法對(duì) Unigenes 表達(dá)量進(jìn)行篩選( 差異倍數(shù) 2， FD0. 01) ， 共獲得 3 762 條差異表達(dá)基因 ( DEGs) ， 占 Unigenes 總量的 3. 57%;其中上調(diào)基因 2 084 個(gè) ， 占 DEGs 總量的 55. 38%;下調(diào)基因 1 678 個(gè) ， 占 DEGs 總量的 44. 62%。使用BLAST 軟件將 105 456 條 Unigenes 和 3 762 條 DEGs與 nr、Swiss-Prot、GO、COG、KEGG ( E-value 105)公共數(shù)據(jù)庫比對(duì) ， 獲得 Unigenes 的總注釋信息34 137， 占總 Unigenes 的 31. 86%， DEGs 總注釋信息為 2 741， 占總 DEGs 的 72. 86%， 各數(shù)據(jù)庫注釋到的 Unigenes 和 DEGs 百分比分各不相同 ( 表 5) 。Unigenes 和 DEGs 的 GO 功能分布圖顯示 ( 圖2) ， 共有基因的分子功能 、所處的細(xì)胞位置和參與的生物過程三大類 ， 又可將其分成 52 個(gè)亞類 。參與的分子功能是功能注釋 Unigenes 和 DEGs 的最大主類 ， 分別有 13 168 和 602; 其次是生物過程( 11892 Unigenes， 589 DEGs) 和所處的細(xì)胞位置( 9115 Unigenes， 495 DEGs) 。而就 52 個(gè)亞類來說 ，Unigenes 和 DEGs 分布也有明顯的差異 ， 可能與差異有關(guān)的亞類有 : 胞外區(qū) 、膜內(nèi)腔 、抗氧化能力 、受體活性 、蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的活性 、生殖 、生物相等 。表 5 Unigenes 和 DEGs 功能注釋結(jié)果匯總Table 5 Summary of functional annotationof unigenes and DEGs功能注釋數(shù)據(jù)庫Unigenes 注釋結(jié)果數(shù)目 百分比 /%DEGs 注釋結(jié)果數(shù)目 百分比 /%COG 8 347 8. 03 823 21. 88GO 14 736 15. 80 1 367 36. 34KEGG 5 438 5. 25 483 12. 84KOG 18 435 18. 28 1 042 27. 70Pfam 16 382 16. 19 1 648 43. 81Swissprot 18 473 18. 52 1 834 48. 75Nr 33 772 31. 22 2 449 65. 10注釋總數(shù) 34 137 31. 86 2 741 72. 86總條數(shù) 105 456 100. 00 3 762 100. 00將總 DEGs 與 GO 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì) ， 比對(duì)結(jié)果進(jìn)行富集 ， 得到 DEGs 富集結(jié)果 ， 主要分為三大類22 亞類 。參與的生物過程是功能注釋 DEGs 的最大主類 ， 其次是所處的細(xì)胞位置和分子功能 。從差異表達(dá)基因的富集結(jié)果來看 ， 發(fā)現(xiàn)差異基因主要集中在膜 ( 86DEGs) 、氧化還原過程 ( 64 DEGs) 、ATP 結(jié)合 ( 61 DEGs) 、葉綠體 ( 48 DEGs) 和亞鐵紅血素結(jié)合 ( 25 DEGs) ( 表 6) ; 從基因調(diào)節(jié)水平36第 2 期 盧珍紅等 : 菊花黃化突變體初步研究來分析 ， DEGs 顯著下調(diào)的有葉綠體 ( 79. 17%下調(diào) ) 、DNA 轉(zhuǎn)錄及調(diào)控 ( 68. 97%下調(diào) ) 、亞鐵紅血素結(jié)合 ( 68. 00%下調(diào) ) 、葉綠體基質(zhì) ( 81. 82%下調(diào) ) 、葉綠體膜 ( 80. 00%下調(diào) ) 、光系統(tǒng) II 組裝( 77. 78%下調(diào) ) 等 ， 其中與葉色變異有關(guān)的葉綠體 、亞鐵紅血素結(jié)合 、光系統(tǒng) II 組裝等相關(guān)的DEGs 都表現(xiàn)明顯的下調(diào) ， 而氧化還原等應(yīng)激響應(yīng)相關(guān)的 DEGs 都表現(xiàn)明顯的上調(diào) 。圖 2 Unigenes 和 DEGs GO 分布Fig. 2 GO classification of unigenes and DEGs表 6 DEGs GO 富集分析Table 6 GO enrichment analysis of DEGsGO ID GO TermGO 注釋 DEGs 數(shù)目上調(diào) 下調(diào) 總計(jì)GO ID GO TermGO 注釋 DEGs 數(shù)目上調(diào) 下調(diào) 總計(jì)GO: 0016020 membrane 44 42 86 GO: 0009941 chloroplast envelope 4 16 20GO: 0055114 oxidation-reduction 46 18 64 GO: 0009535 chloroplast thylakoid 1 8 9process membraneGO: 0005524 ATP binding 29 32 61 GO: 0010207 photosystem II assembly 2 7 9GO: 0009507 chloroplast 10 38 48 GO: 0009658 chloroplast organization 2 3 5GO: 0020037 heme binding 8 17 25 GO: 0004014 photosynthesis 0 4 4GO: 0005506 iron ion binding 12 8 22 GO: 0009657 plastid organization 1 2 3GO: 0009536 plastid 21 18 39 GO: 0048827 phyllome development 0 3 3GO: 0009570 chloroplast stroma 4 18 22 GO: 0009640 photomorphogenesis 0 2 2將總 DEGs 與 KEGG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì) ， 得到注釋的 DEGs 有 184 個(gè) ， 共 79 條 KEGG 通路 ， 注釋結(jié)果分為 5 大類 : 細(xì)胞過程 、環(huán)境信息處理 、遺傳信息處理 、新陳代謝和生物系統(tǒng) ， 絕大多數(shù) DEGs注釋到新陳代謝大類中 ( 圖 3) 。其中 ， 淀粉和蔗糖代謝由 18DEGs 組成 ， 是 50 個(gè)亞類群中最大的 ，然后依次是氧化磷酸化 ( 13 DEGs) 、核糖體 ( 12DEGs) 、固碳作用和光合生物 ( 9DEGs) 等 。然后通過 KEGG 富集分析 ， 得到最顯著富集的 KEGG通路為淀粉和蔗糖代謝 ， 然后依次氧化磷酸化 、核糖體形成 、氨基酸代謝 、光合作用 、植物激素信號(hào)傳導(dǎo)以及黃酮類代謝 。46 西 南 林 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 第 37 卷圖 3 DEGs KEGG 分類圖Fig. 3 KEGG functional classification of DEGs2. 2. 3 葉色相關(guān)差異表達(dá)基因?yàn)榱诉M(jìn)一步了解黃綠葉現(xiàn)象的分子調(diào)控機(jī)制 ，通過對(duì) DEGs 葉色相關(guān) KEGG 和 GO 注釋分析 ， 并結(jié)合 regulated 分析 ， 分別在與葉色變異相關(guān)的光合作用 、葉綠體 、光捕獲復(fù)合體和葉綠素合成篩選差異表達(dá)基因 ， 候選差異基因共 10 個(gè) ( 表 7) ，候選基因表達(dá)基本都呈下調(diào) 。表 7 突變體 dmy01 葉色相關(guān)差異表達(dá)候選基因Table 7 Candidate DEGs related to the leaf color of mutant dmy01功能 酶 基因 log2 ( dmy01/NP) 注釋chloroplast development GLK1 c74406 graph_c0 1. 28 probable transcription factor GLK1and division GLK2 c67958 graph_c0 1. 50 probable transcription factor GLK2ELIP1 c76530 graph_c0 2. 31 early light-induced protein 1light-harvesting complex staygreen protein c68219. graph_c0 2. 85 chloroplastic-like isoform X1photosynthesis PsbO c23577 graph_c0 3. 35 P680 chlorophyll aPsbP c72231 graph_c0 1. 32 PS II PsbP proteinPsbY c67901 graph_c0 1. 18 PS II PsbY protein-likePsb28 c66902 graph_c0 1. 19 PS II Psb28 protein-likechlorophyll biosynthesis HemE c74449 graph_c0 1. 41 HemE protein-likeHemC c72883 graph_c1 1. 08 HemC protein-like56第 2 期 盧珍紅等 : 菊花黃化突變體初步研究2. 2. 4 差異表達(dá)基因的 qPC 驗(yàn)證為了驗(yàn)證 de novo 轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果的準(zhǔn)確性 ， 隨機(jī)選擇與突變體 dmy01 葉色相關(guān)的可能有重要作用的 10 個(gè)差異表達(dá)基因的定量 PC 驗(yàn)證 ( 圖 4) 。結(jié)果表明 ， dmy01 的 dmGLK1、dmGLK2、dmStaygreen、dmPsbO、dmPsbY、dmPsb28、dmHemE、dmHemC 表達(dá)水平都相對(duì)于正常植株的低 ， 而 dmELIP1 和dmPsbP 表達(dá)水平卻比正常植株高 。其中 dmGLK1在突變體 dmy01 中沒有檢測(cè)而在正常植株中卻有較高表達(dá) ， 說明 dmGLK1 在 dmy01 中可能缺失 。定量 PC 驗(yàn)證的 10 個(gè)基因表達(dá)與 de novo 轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致 。圖 4 葉色相關(guān) DEGs 定量 PC 表達(dá)分析Fig. 4 qT-PC expression analysis of leaf color related to DEGs3 結(jié)論與討論本研究以菊花 霞光飛躍 黃綠葉突變體dmy01 為科研材料 ， 對(duì)菊花 霞光飛躍 葉片發(fā)育進(jìn)行 de novo 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 ， 并結(jié)合生物學(xué)功能性注釋 ， 獲得大量與葉片發(fā)育相關(guān)的基因組信息 ; 通過表型 、色素水平 、分子水平的分析 ， 對(duì)菊花霞光飛躍 葉色變異機(jī)理進(jìn)行了初步研究 。結(jié)果表明 : 菊花 霞光飛躍 葉色突變體形成的原因可能是 dmGLK2 低水平表達(dá)和 dmGLK1 不表達(dá)導(dǎo)致葉綠體合成和分裂受阻 ， 葉片細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)量大大降低 ， 進(jìn)而葉綠素 ( Chl) 含量下降 。本研究結(jié)果豐富了菊花在質(zhì)體發(fā)育與光合作用相關(guān)的基因組信息 。3. 1 葉綠素含量與葉色變異的關(guān)系菊花 霞光飛躍 突變體 dmy01 的葉色變異比較復(fù)雜 ， 新生葉片呈現(xiàn)比例不同的黃綠條紋和不可復(fù)綠 ， 但莖部顏色呈穩(wěn)定的淡黃色 ， 這就意味著葉色變異的調(diào)控方式可能比較獨(dú)特 。Chl a、Chlb 是高等植物葉片中主要的光合色素 ， 這些色素的含量和比例決定了葉片的顏色 。葉色突變體中 Chl含量一般明顯低于野生型 ， 本研究中 dmy01 的 Chl含量顯著降低 。葉色突變體葉綠素含量的變化不僅體現(xiàn)在 Chl、Chl a 和 Chl b 含量的減少 ， 其 Chla/b 也常改變 ， 其中以 Chl b 含量降低的情況最多見 29。絕大多數(shù)黃化和黃綠突變體的 Chl b 含量下降大于 Chl a 含量的下降 ， 相應(yīng)的 Chl a/b 比值增大 30。本研究中突變體 dmy01 的 Chl a/b 比值顯著增大 ， 即 Chl b 降低程度大于 Chl a。Falbel等 31認(rèn)為 ， 造成葉綠素 b 減少和葉色突變體表型發(fā)生變化的原因可能是編碼 Mg鰲合酶的基因突變而使得其活性降低 ， 而導(dǎo)致底物原葉琳 IX 累積 ，產(chǎn)物 Mg原葉琳 IX 及后續(xù)產(chǎn)物葉綠素酸脂 a 相應(yīng)減少 ， 最終導(dǎo)致合成 Chl a 減少 、則 Chl b 更少 。而本研究中的突變體 dmy01 的黃綠葉性狀的生理變化機(jī)理的確定則有待進(jìn)一步地進(jìn)行突變基因的確定及其功能驗(yàn)證的探究 。3. 2 無參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與 Unigenes 功能注釋目前 ， de novo 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于很多植物中 ， 在菊花相關(guān)分子研究中也有很多報(bào)道 3233。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分別從 dmy01與正常植株葉片中獲得 4. 75 Gb 和 4. 96 Gb CleanData， Q30 堿基百分比都大于 85%; 使用 Trinity 軟件進(jìn)行 de novo 組裝 ， 共得到 212 675 條轉(zhuǎn)錄本和105 456 條 Unigenes， 其中長(zhǎng)度在 1 kb 以上 Unigenes有 15493 條 ， 轉(zhuǎn)錄本與 Unigenes 的 N50 分別為 1924bp 和 1 556 bp， Unigenes 的平均長(zhǎng)度 ( mean length)為 714. 47 bp， 高于前人研究 ， 例如 Dendrobium of-ficinale ( 637 bp) 34、Osmanthus serrulatus ( 69766 西 南 林 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 第 37 卷bp) 35和 Litsea cubeba ( 574 bp) 36。這表明從菊花霞光飛躍 中所獲得的 EST ( expressed sequencetag) data 數(shù)據(jù)具有很高的質(zhì)量 ， 這為今后菊花的差異基因分析和基因克隆等基因水品研究提供了良好的參照 。3. 3 葉色突變與葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的關(guān)系葉色突變都與葉綠體發(fā)育有關(guān) ， 葉綠體本身雖含 DNA， 但葉綠體中絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和酶仍由核基因編碼 37。因此 ， 葉色變異由核基因 、細(xì)胞質(zhì)基因以及兩者的互作控制 。 葉綠體組裝或葉綠素代謝受阻可導(dǎo)致葉色變異 ， 在玉米 ( Zeamays) 38、擬南芥 ( Arabidopsis thaliana) 39、花燭( Anthurium andraeanum) 40等研究發(fā)現(xiàn) ， GLK 基因家族是葉綠體發(fā)育的調(diào)節(jié)因素 ， 黃化突變體葉片的 GLK 基因表達(dá)低于正常植株的 。我們通過 denovo 轉(zhuǎn) 錄 組 分 析 ， 發(fā)現(xiàn)調(diào)控葉綠體形成和分裂的兩個(gè)關(guān)鍵基因家族 GLK1 ( dmGLK1) 和 GLK2( dmGLK2) 在突變體 dmy01 中表達(dá)均低于正常植株的 ， 且我們獲得的 dmGLK1 在正常植株中有較高水平表達(dá)而在突變體 dmy01 中基本不表達(dá) ( 缺失 ) ，dmGLK2 也表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá) ， 進(jìn)一步的定量 PC 也驗(yàn)證了這一點(diǎn) 。因此 ， 我們推測(cè)突變體 dmy01 葉色變異可能調(diào)控葉綠體形成和分裂的兩個(gè)關(guān)鍵基因 doGLK2 低水平表達(dá)和 dmGLK1 不表達(dá)有關(guān) ， 尤其是 dmGLK1 的可能缺失 ， 但具體是 dmGLK1 和dmGLK2 變異 ， 還是 dmGLK1 單一的缺失 ， 還有待進(jìn)一步的研究 。3. 4 突變體形成機(jī)理推測(cè)結(jié)合以上分析 ， 我們對(duì)菊花 霞光飛躍 突變體 dmy01 形成途徑進(jìn)行了推測(cè) : 突變體 dmy01 可能是因?yàn)?dmGLK2 低水平表達(dá)和 dmGLK1 不表達(dá)導(dǎo)致葉綠體合成和分裂受阻 ， 葉片細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)量大大降低 ， 導(dǎo)致 Chl 整體下降 ， 這與前面光合色素測(cè)定結(jié)果相吻合 。dmGLK1 和 dmGLK2 的表達(dá)變化 ， 也間接的導(dǎo)致了兩個(gè)結(jié)果 : 其一 ， DNA 轉(zhuǎn)錄及調(diào)控和相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)到能力下降 ; 其二 ， 葉綠體不正常發(fā)育引起氧化還原 、對(duì)逆境的反映等應(yīng)激反映相關(guān)基因表達(dá)上調(diào) 。 參 考 文 獻(xiàn) 1 eddi T V V S， eddi V Frequency and spectrum ofchlorophyll mutants induced in rice by chemicalmutagens J Theoretical and Applied Genetics， 1984，67( 1/2) : 231233 2 王彩霞 ， 田韋韋 ， 田敏 ， 等 文心蘭黃化突變體的初步研究 J 核農(nóng)學(xué)報(bào) ， 2013， 27( 12) : 18451852 3 Yang Y X， Chen X X， Xu B， et al Phenotype and tran-scriptome analysis reveals chloroplast development andpigment biosynthesis together influenced the leaf colorformation in mutants of Anthurium andraeanumsonate J Frontiers in Plant Science， 2015， 6: 139 4