分 子 植 物 育 種 ， 2 0 0 6 年 ， 第 4 卷 ， 第 6 期 ， 第 8 8 7 - 8 9 4 頁M o l e c u l a r P l a n t B r e e d i n g , 2 0 0 6 , V o l . 4 , N o . 6 , 8 8 7 - 8 9 4新 思 路 、 新 技 術(shù) 、 新 方 法N o v e l T h i n k i n g  2 國 家 花 卉 工 程 技 術(shù) 研 究 中 心 , 北 京 , 1 0 0 0 8 3* 通 訊 作 者 , l u y i n g m i n b j f u . e d u . c n摘 要 以“ 美 人 ” 梅 離 體 培 養(yǎng) 的 葉 片 為 材 料 進 行 愈 傷 組 織 誘 導(dǎo) 再 生 研 究 ， 誘 導(dǎo) 過 程 分 兩 步 ， 第 一 步 是 愈 傷 組織 的 誘 導(dǎo) ， 誘 導(dǎo) 過 程 中 生 長 素 2 , 4 - D 起 了 決 定 性 的 作 用 ， 并 且 以 液 體 培 養(yǎng) 基 為 佳 ， 而 且 暗 培 養(yǎng) 的 愈 傷 組 織 再分 化 率 明 顯 高 于 光 培 養(yǎng) 。 具 體 培 養(yǎng) 基 為 1 / 2 W P M + 5 m g / L 2 , 4 - D ； 第 二 步 是 在 愈 傷 組 織 誘 導(dǎo) 出 之 后 ， 進 一 步 誘導(dǎo) 愈 傷 組 織 再 生 出 植 物 ， 在 經(jīng) 過 7 d 液 體 培 養(yǎng) 基 的 誘 導(dǎo) 之 后 將 離 體 葉 片 轉(zhuǎn) 入 1 / 2 W P M + 1 . 0 m g / L 6 - B A +0 . 1 m g / L N A A + 8 m g / L A g N O3+ 1 0 0 m g / L 水 解 乳 蛋 白 培 養(yǎng) ， 再 分 化 率 可 以 達(dá) 到 2 4 . 2 5 % 。 愈 傷 組 織 分 化 出 苗 之后 ， 進 一 步 誘 導(dǎo) 生 根 ，“ 美 人 ” 梅 最 佳 生 根 培 養(yǎng) 基 是 1 / 2 W P M + 0 . 5 m g / L N A A 。關(guān) 鍵 詞 梅 花 , 離 體 培 養(yǎng) , 再 生 體 系T h e E s t a b l i s h m e n t o f i n v i t r o R e g e n e r a t i o n S y s t e m o f M e i r e n ( P r u n u sm u m e ) C u l t i v a r b y U s i n g t h e L e a v e s a s E x p l a n t sL v Y i n g m i n1 , 2 *C a o L i a n g1Z h a n g Q i x i a n g1 , 21 C o l l e g e o f l a n d s c a p e A r c h i t e c t u r e , B e i j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y , B e i j i n g , 1 0 0 0 8 3 ; 2 C h i n a N a t i o n a l C e n t r e f o r F l o w e r E n g i n e e r i n g T e c h n i q u e , B e i j i n g ,1 0 0 0 8 3* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r , l u y i n g m i n b j f u . e d u . c nA b s t r a c t P r u n u s m u m e i s a n i m p o r t a n t f l o w e r i n g w o o d y s p e c i e s w i d e l y u s e d i n t h e g a r d e n s o f C h i n a . M e i r e n ,o n e o f t h e m o s t c o m m o n P r u n u s m u m e c u l t i v a r s , w a s c h o s e n a s m a t e r i a l t o e s t a b l i s h t h e i n v i t r o r e g e n e r a t i o n s y s -t e m w i t h t h e l e a v e s a s e x p l a n t s . A c o m p l e t e r e g e n e r a t i o n p r o t o c o l w a s d e v e l o p e d f o r t h i s c u l t i v a r . T h e r e w e r e t w os t e p s f o r t h e r e g e n e r a t i o n o f l e a v e s . T h e f i r s t s t e p w a s t h e c a l l u s i n d u c e m e n t o f l e a v e s . T h e o p t i m u m m e d i u m w a sm o d i f i e d 1 / 2 w o o d y p l a n t m e d i u m ( 1 / 2 W P M ) l i q u i d m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h 5 m g / L 2 , 4 - d i e h l o r o p h e n o x y -a c e t i e a c i d ( 2 , 4 - D ) w h i c h p l a y s a k e y r o l e i n t h e c a l l u s i n d u c e m e n t p r o c e s s i n g . T h e c a l l u s r e - d i f f e r e n t i a t i o n r a t i ow a s h i g h e r i n d a r k c u l t u r e c o n d i t i o n t h a n t h a t i n l i g h t c u l t u r e c o n d i t i o n . T h e s e c o n d s t e p w a s t h e s e e d l i n g r e g e n e r -a t i o n f r o m t h e c a l l u s i n d u c e d a t t h e f i r s t s t e p . I n v i t r o P r u n u s m u m e l e a v e s w e r e t r a n s f e r r e d t o t h e r e g e n e r a t i o nm e d i u m 1 / 2 W P M s u p p l e m e n t e d w i t h 1 . 0 m g / L 6 - b e n z y l a d e n i n e ( 6 - B A ) , 0 . 1 m g / L n a p h t h a l e n e - a c e t i c a c i d ( N A A ) ,8 m g / L A g N O3a n d 1 0 0 m g / L l a c t o a l b u m i n h y d r o l y s a t e ( L H ) a f t e r s e v e n d a y s i n d u c i n g c u l t u r e o n t h e l i q u i d m e d i -u m . T h e r e g e n e r a t i o n r a t e c a n b e a c h i e v e t o 2 4 . 2 5 % . A f t e r t h e s h o o t w e r e r e g e n e r a t e d f r o m t h e c a l l u s , r o o t s w e r ei n d u c e d f r o m t h e r e g e n e r a t e d p l a n t s . T h e o p t i m u m r o o t i n g m e d i u m f o r M e i r e n i s i m p r o v e d 1 / 2 w o o d y p l a n tm e d i u m ( W P M ) s u p p l e m e n t e d w i t h 0 . 5 m g / L N A A .K e y w o r d s P r u n u s m u m e , T i s s u e c u l t u r e , I n v i t r o r e g e n e r a t i o n s y s t e m梅 花 的 抗 寒 育 種 工 作 中 遠(yuǎn) 緣 雜 交 是 主 要 手 段 ，并 且 已 經(jīng) 取 得 了 很 大 的 成 效 ， 但 是 常 規(guī) 的 育 種 手 段周 期 長 、 費 工 費 力 ， 而 且 目 標(biāo) 改 良 的 預(yù) 見 性 較 低 ， 隨著 現(xiàn) 代 基 因 工 程 的 迅 速 發(fā) 展 ， 許 多 優(yōu) 良 性 狀 的 基 因已 經(jīng) 被 克 隆 出 來 ， 并 在 育 種 工 作 中 取 得 了 顯 著 的 效果 。 所 以 利 用 基 因 工 程 進 行 梅 花 育 種 將 有 很 大 的 優(yōu)勢 和 前 景 ， 以 彌 補 常 規(guī) 育 種 的 不 足 。對 于 梅 花 的 基 因 工 程 育 種 ， 首 先 要 建 立 營 養(yǎng) 體( 如 葉 片 ) 的 再 生 體 系 ， 并 在 此 基 礎(chǔ) 上 建 立 遺 傳 轉(zhuǎn) 化 體系 ， 本 中 心 已 建 立 了 3 個 不 同 種 型 的 梅 花 品 種 的 離分 子 植 物 育 種M o l e c u l a r P l a n t B r e e d i n g圖 1“ 美 人 ” 梅 葉 片 離 體 再 生 體 系 建 立注 : A : 梅 花 品 種“ 美 人 ” 梅 ; B :“ 美 人 ” 梅 離 體 葉 片 接 種 ; C : 誘導(dǎo) 愈 傷 組 織 ; D :“ 美 人 ” 梅 愈 傷 組 織 誘 導(dǎo) 產(chǎn) 生 植 株 ; E :“ 美 人 ”梅 的 再 生 植 株 ; F : 美 人 梅 生 根F i g u r e 1 T h i s e s t a b l i s h m e n t o f i n v i t r o r e g e n e r a t i o n s y s t e r m o f M e i r e n w i t h l e a v e s a s e x p l a n t sN o t e : A : P r u n u s m u m e c u l t i v a r M e i r e n ; B : I n o c u l a t i o n o f M e i r e n l e a v e s ; C : C a l l u s t i s s u e i n d u c e m e n t w i t h l e a v e s a s e x -p l a n t s ; D : S h o o t s r e g e n e r a t e d f r o m c a l l u s o f M e i r e n i ; E : M e i r e n r e g e n e r a t e d p l a n t s ; F : R o o t i n g o f M e i r e n 體 快 繁 體 系 ， 但 是 目 前 國 內(nèi) 外 對 于 梅 花 的 再 生 體 系建 立 的 研 究 仍 未 見 成 功 報 道 。劉 青 林 等 ( 1 9 9 9 ) 以“ 北 京 玉 蝶 ” 、“ 小 綠 萼 ” 、“ 美人 ” 梅 的 莖 段 以 及“ 美 人 ” 梅 和“ 豐 后 ” 的 胚 為 外 植 體進 行 梅 花 的 離 體 快 繁 和 愈 傷 組 織 培 養(yǎng) 研 究 。 愈 傷 組織 的 增 殖 過 程 中 以 N A A 為 主 導(dǎo) 激 素 ， 其 中“ 北 京 玉蝶 ” 的 增 殖 率 達(dá) 到 3 . 0 。 通 過 觀 察 發(fā) 現(xiàn) 光 處 理 有 利 于愈 傷 組 織 的 生 長 和 增 殖 。 其 結(jié) 果 并 沒 有 實 現(xiàn) 通 過 愈傷 組 織 途 徑 分 化 成 苗 的 結(jié) 果 。 張 秦 英 ( 2 0 0 4 ) 以“ 花 蝴蝶 ” 、“ 美 人 梅 ” 離 體 培 養(yǎng) 的 無 菌 苗 葉 片 為 試 驗 材 料 ，進 行 抗 寒 梅 花 品 種 成 熟 葉 片 的 培 養(yǎng) 研 究 。 結(jié) 果 表 明葉 片 直 接 再 生 僅 得 到 不 定 根 ， 激 素 的 調(diào) 節(jié) 并 沒 有 使葉 片 直 接 分 化 出 不 定 芽 。 因 此 最 終 也 沒 有 解 決 愈 傷組 織 誘 導(dǎo) 再 生 苗 難 度 大 的 這 一 難 題 。但 是 國 外 在 除 梅 花 以 外 的 李 屬 植 物 上 再 生 體 系研 究 的 報 道 相 對 較 多 。 如 E s c a l e t t e s 和 D o s b a ( 1 9 9 3 )以 兩 種 杏 品 種 ( H . 1 5 2 以 及 H . 1 4 6 ) 的 離 體 葉 片 為 誘 導(dǎo)材 料 ， 對 比 了 M S 、 1 / 2 M S 以 及 Q  P a l m e r , 1 9 9 2 ) 。 本 研 究梅 花 培 養(yǎng) 基 中 1 . 0 m g / L 6 - B A + 0 . 5 m g / L N A A ， 對 比 附表 4 不 同 誘 導(dǎo) 時 間 以 及 不 同 濃 度 2 , 4 - D 對 愈 傷 組 織 再 分 化 率的 影 響T a b l e 4 E f f e c t s o f d i f f e r e n t i n d u c e m e n t t i m e a n d c o n c e n t r a t i o n so f 2 , 4 - D o n r e g e n e r a t i o n o f m e i f l o w e r l e a f c a l l u s處 理T r e a t m e n t處 理 1T r e a t m e n t 1處 理 2T r e a t m e n t 2處 理 3T r e a t m e n t 3處 理 4T r e a t m e n t 4處 理 5T r e a t m e n t 5處 理 6T r e a t m e n t 6處 理 7T r e a t m e n t 7處 理 8T r e a t m e n t 8處 理 9T r e a t m e n t 9K1K2K3k1k2k3R2 , 4 - D 濃 度 ( m g / L )2 , 4 - D c o n c e n t r a t i o n3335558883 3 . 6 96 0 . 9 24 1 . 1 21 1 . 2 32 0 . 3 11 3 . 7 19 . 0 8誘 導(dǎo) 時 間 ( d )I n d u c i n g t i m e371 0371 0371 04 0 . 8 55 1 . 8 44 3 . 0 41 3 . 6 21 7 . 2 81 4 . 3 53 . 6 6愈 傷 組 織 再分 化 率 ( % )R e - d i f f e r e n -t i a t i o n o fc a l l u s t i s s u e8 . 0 91 3 . 4 31 2 . 1 71 8 . 3 72 2 . 1 32 0 . 4 21 4 . 3 91 6 . 2 81 0 . 4 5梅 花 品 種“ 美 人 ” 葉 片 離 體 再 生 體 系 建 立T h e E s t a b l i s h m e n t o f i n v i t r o R e g e n e r a t i o n S y s t e m o f M e i r e n C u l t i v a r b y U s i n g t h e L e a v e s a s E x p l a n t s8 9 1分 子 植 物 育 種M o l e c u l a r P l a n t B r e e d i n g6 - B A ( m g / L )0 . 51 . 500T D Z ( m g / L )000 . 0 20 . 2N A A ( m g / L )0 . 20 . 20 . 20 . 2愈 傷 組 織 分 化 率 ( % )D i f f e r e n t i a t i o n r a t e o f c a l l u s t i s s u e1 2 . 3 6 d2 0 . 7 8 b1 8 . 4 5 c2 4 . 9 3 a分 化 苗 生 長 情 況G r o w i n g s i t u a t i o n o f d i f f e r e n t i a t i o n s e e d l i n g s分 化 苗 生 長 正 常 , 葉 片 展 開 , 綠 色G r o w i n g n o r m a l , w i t h l e a v e s u n f o l d e d , g r e e n分 化 苗 較 細(xì) 弱 , 葉 片 展 開 , 綠 色W e a k , w i t h l e a v e s u n f o l d e d , g r e e n分 化 苗 生 長 正 常 , 葉 片 展 開 , 綠 色N o r m a l , u n f o l d e d , g r e e n分 化 苗 較 細(xì) 弱 , 節(jié) 間 較 短 , 試 管 苗 黃 化W e a k , n o d e s h o r t , s e e d l i n g y e l l o w i s h表 5 不 同 細(xì) 胞 分 裂 素 種 類 梅 花 愈 傷 組 織 再 生 的 影 響T a b l e 5 E f f e c t o f p l a n t g r o w t h r e g u l a t o r ( c y t o k i n i n ) o n t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f M e i f l o w e r c a l l u s注 : 在 同 一 列 中 , 數(shù) 值 后 的 不 同 字 母 則 表 示 P = 0 .0 5 水 平 差 異 顯 著N o t e : D i f f e r e n t l e t t e r s i n t h e s a m e c o l u m n r e p r e s e n t s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e ( A N O V A , P = 0 . 0 5 )N A A ( m g / L )0 . 10 . 5002 , 4 - D ( m g / L )000 . 10 . 56 - B A ( m g / L )1 . 01 . 01 . 01 . 0愈 傷 組 織 再 分 化 率 ( % )R e - d i f f e r e n t i a t i o n r a t e o f c a l l u s t i s s u e1 8 . 2 7 a1 9 . 3 2 a5 . 3 4 b1 . 4 6 c分 化 苗 生 長 情 況D i f f e r e n t i a t i o n s e e d l i n g g r o w i n g s i t u a t i o n試 管 苗 分 化 時 間 較 長 , 苗 生 長 正 常D i f f e r e n t i a t i o n w i t h l o n g t i m e , g r o w t h n o r m a l苗 相 對 生 長 細(xì) 弱W e a k分 化 率 較 低 , 苗 細(xì) 弱D i f f e r e n t i a t i o n r a t e l o w , w e a k幾 乎 沒 有 愈 傷 組 織 分 化 , 分 化 苗 畸 形N e a r l y n o d i f f e r e n t i a t i o n表 6 不 同 生 長 素 種 類 梅 花 愈 傷 組 織 再 生 的 影 響T a b l e 6 E f f e c t s o f p l a n t g r o w t h r e g u l a t o r ( A u x i n ) o n t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f M e i f l o w e r c a l l u s注 : 在 同 一 列 中 , 數(shù) 值 后 的 不 同 字 母 則 表 示 P = 0 .0 5 水 平 差 異 顯 著N o t e : D i f f e r e n t l e t t e r s i n t h e s a m e c o l u m n r e p r e s e n t s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e ( A N O V A , P = 0 . 0 5 )加 5 m g / L 和 1 0 m g / L A g N O3與 不 添 加 的 效 果 。從 表 7 中 可 以 發(fā) 現(xiàn) ， 添 加 A g N O3對 于 梅 花 愈 傷組 織 的 再 分 化 率 有 顯 著 影 響 ， 但 是 濃 度 過 高 會 導(dǎo) 致苗 生 長 畸 形 ， 因 此 進 一 步 的 濃 度 分 析 有 待 進 一 步 的試 驗 分 析 。( 4 ) 最 佳 的 激 素 以 及 不 同 培 養(yǎng) 基 添 加 物 組 合 。從 以 上 試 驗 看 出 ， 細(xì) 胞 分 裂 素 6 - B A 的 效 果 好 于T D Z ， 而 生 長 素 中 N A A 對 植 物 愈 傷 組 織 分 化 的 影 響較 大 ， 因 此 設(shè) 計 一 個 四 因 素 三 水 平 的 正 交 試 驗 表 ( 見表 8 ) ， 從 而 找 到“ 美 人 ” 梅 再 生 培 養(yǎng) 的 最 佳 培 養(yǎng) 基 。表 7 A g N O3對 愈 傷 組 織 再 分 化 的 影 響T a b l e 7 E f f e c t s o f A g N O3o n t h e r e - d i f f e r e n t i a t i o n o f M e i f l o w e r c a l l u s注 : 在 同 一 列 中 , 數(shù) 值 后 的 不 同 字 母 則 表 示 P = 0 .0 5 水 平 差 異 顯 著N o t e : D i f f e r e n t l e t t e r s i n t h e s a m e c o l u m n r e p r e s e n t s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e ( A N O V A , P = 0 . 0 5 )A g N O3濃 度 ( m g / L )A g N O3c o n c e n t r a t i o n051 0分 化 苗 生 長 情 況S e e d l i n g r o w i n g s i t u a t i o n分 化 苗 生 長 正 常 , 葉 片 展 開 , 綠 色S e e d l i n g g r o w i n g n o r m a l , l e a v e s s p r e a d i n g , g r e e n分 化 苗 較 細(xì) 弱 , 節(jié) 間 較 短W e a k , n o d e s h o r t分 化 苗 較 細(xì) 弱 , 節(jié) 間 較 短W e a k , n o d e s h o r t愈 傷 組 織 分 化 率 ( % )D i f f e r e n t i a t i o n r a t e o f c a l l u s t i s s u e1 4 . 3 6 b2 1 . 7 8 a2 0 . 1 3 a8 9 2水 平L e v e l1236 - B A( m g / L )0 . 20 . 51 . 0N A A( m g / L )0 . 10 . 30 . 5A g N O3( m g / L )248水 解 乳 蛋 白 ( m g / L )L a c t o a l b u m i n h y d r o l y s a t e5 01 0 02 0 0因 素F a c t o r表 8 正 交 試 驗 表T a b l e 8 T h e t a b l e o f o r t h o g o n a l t e s t因 素F a c t o r s實 驗 1T e s t 1實 驗 2T e s t 2實 驗 3T e s t 3實 驗 4T e s t 4實 驗 5T e s t 5實 驗 6T e s t 6實 驗 7T e s t 7實 驗 8T e s t 8實 驗 9T e s t 9K1K2K3k1k2k3R6 - B A( m g / L )1112223331 5 . 5 73 8 . 9 45 4 . 0 75 . 1 91 2 . 9 81 8 . 0 21 2 . 8 3N A A( m g / L )1231231234 3 . 2 53 9 . 8 12 5 . 5 21 4 . 4 21 3 . 2 78 . 5 15 . 9 1A g N O3( m g / L )1232313123 7 . 5 43 1 . 53 9 . 5 41 2 . 5 11 0 . 51 3 . 1 82 . 6 8水 解 乳 蛋 白( m g / L )L a c t o a l b u m i nh y d r o l y s a t e1233122313 7 . 9 33 8 . 7 43 1 . 9 11 2 . 6 41 2 . 9 11 0 . 6 42 . 2 8愈 傷 組 織 在分 化 率 ( % )C a l l u s t i s s u ed i f f e r e n t i a -t i o n r a t e5 . 6 81 . 3 21 2 . 3 41 5 . 8 81 0 . 7 22 2 . 3 41 8 . 2 51 3 . 4 8表 9 梅 花 愈 傷 組 織 誘 導(dǎo) 最 佳 培 養(yǎng) 基 正 交 表T a b l e 9 O r t h o g o n a l t e s t o f o p t i m u m r e g e n e r a t i o n m e d i a o n i n -d u c e m e n t o f M e i f l o w e r c a l l u s從 細(xì) 胞 分 裂 素 6 - B A 、 生 長 素 N A A 、 A g N O3、 水解 乳 蛋 白 的 正 交 組 合 培 養(yǎng) 結(jié) 果 ( 表 9 ) 可 以 看 出 ， 4 個因 素 對 梅 花 愈 傷 組 織 再 分 化 的 影 響 大 小 分 別 是 ：6 - B A > N A A > A g N O3> 水 解 乳 蛋 白 。 其 中 細(xì) 胞 分 裂素 作 用 顯 著 ， 而 A g N O3和 水 解 乳 蛋 白 之 間 的 差 異 不是 十 分 的 明 顯 。 根 據(jù) 各 個 因 素 的 均 值 分 析 得 出 最 佳的 組 合 為 6 - B A 1 . 0 m g / L + N A A 0 . 1 m g / L + A g N O38 m g / L + 水 解 乳 蛋 白 1 0 0 ( 單 位 ： m g / L ) 。 經(jīng) 過 進 一 步 的驗 證 試 驗 ， 證 明 1 / 2 W P M + 1 . 0 m g / L 6 - B A + 0 . 1 m g / LN A A + 8 m g / L A g N O3+ 水 解 乳 蛋 白 1 0 0 m g / L 的 愈 傷 組織 再 分 化 率 達(dá) 到 2 4 . 2 5 % ， 是 最 佳 水 平 ( 圖 1 - E , 1 - F ) 。3 討 論關(guān) 于 梅 花 的 成 熟 葉 片 培 養(yǎng) ， 前 人 的 研 究 主 要 是通 過 固 體 培 養(yǎng) 基 添 加 生 長 素 ( N A A 、 2 , 4 - D ) 以 及 相 關(guān)的 細(xì) 胞 分 裂 素 誘 導(dǎo) 葉 片 再 生 ， 品 種 涉 及 真 梅 系 以 及櫻 李 梅 系 的 若 干 品 種 ， 最 終 都 沒 有 獲 得 成 功 。 本 研 究將 梅 花 成 熟 葉 片 誘 導(dǎo) 培 養(yǎng) 基 和 再 生 培 養(yǎng) 基 分 開 ， 并且 在 誘 導(dǎo) 培 養(yǎng) 中 使 用 液 體 培 養(yǎng) 基 ， 愈 傷 組 織 誘 導(dǎo) 階段 的 最 佳 培 養(yǎng) 基 為 1 / 2 W P M 液 體 培 養(yǎng) 基 + 5 m g / L2 , 4 - D ， 僅 添 加 2 , 4 - D 一 種 激 素 。 研 究 發(fā) 現(xiàn) ， 生 長 素2 , 4 - D 在 梅 花 葉 片 誘 導(dǎo) 愈 傷 組 織 過 程 中 起 著 至 關(guān) 重要 的 作 用 ， 其 誘 導(dǎo) 率 較 N A A 高 ， 并 且 誘 導(dǎo) 出 的 愈 傷組 織 生 長 良 好 ， 含 有 綠 色 的 生 長 點 ， 有 進 一 步 分 化 的可 能 。 在 誘 導(dǎo) 培 養(yǎng) 基 的 類 型 選 擇 上 ， 液 體 培 養(yǎng) 基 短 時間 的 誘 導(dǎo) 有 助 于 植 物 體 葉 片 的 吸 收 直 至 愈 傷 組 織 的分 化 ， 固 體 培 養(yǎng) 基 正 常 時 間 的 誘 導(dǎo) 效 果 不 佳 ， 誘 導(dǎo) 出的 愈 傷 組 織 很 難 再 分 化 。 其 主 要 原 因 還 是 植 物 體 內(nèi)2 , 4 - D 的 含 量 有 一 個 平 衡 ， 即 誘 導(dǎo) 初 期 需 要 一 個 強 有效 的 激 素 誘 導(dǎo) 產(chǎn) 生 愈 傷 組 織 ， 但 是 在 再 分 化 階 段 則需 要 降 低 甚 至 去 除 2 , 4 - D 才 能 使 愈 傷 組 織 再 分 化 成苗 ， 而 長 時 間 的 固 體 培 養(yǎng) 基 誘 導(dǎo) 使 植 物 葉 片 體 內(nèi)2 , 4 - D 含 量 過 高 ， 因 而 在 下 一 步 的 再 分 化 過 程 中 很 難甚 至 沒 有 苗 的 分 化 。通 過 短 暫 ( 7 d ) 的 誘 導(dǎo) ， 及 時 將 葉 片 轉(zhuǎn) 入 再 生 培 養(yǎng)基 中 ， 試 驗 中 對 比 了 再 生 培 養(yǎng) 基 中 幾 種 不 同 的 激 素 類型 對 于 愈 傷 組 織 再 分 化 的 影 響 。 其 中 細(xì) 胞 分 裂 素 比 較了 常 用 的 6 - B A 與 在 禾 本 科 植 物 中 應(yīng) 用 效 果 較 好 的T D Z 的 不 同 效 果 ， 試 驗 結(jié) 果 證 明 T D Z 的 再 分 化 效 果好 于 6 - B A ， 但 是 其 再 生 苗 生 長 效 果 不 是 十 分 理 想 ， 有的 出 現(xiàn) 畸 形 現(xiàn) 象 ， 此 外 T D Z 的 成 本 相 對 過 高 ， 綜 合 考慮 還 是 選 用 常 規(guī) 的 6 - B A 。 生 長 素 類 選 用 N A A 效 果較 好 ， 此 外 添 加 A g N O3以 及 水 解 乳 蛋 白 可 以 提 高 愈傷 組 織 的 再 分 化 率 。 A g N O3的 加 入 濃 度 要 選 擇 適 中 ，過 高 的 濃 度 會 使 苗 生 長 畸 形 ， 在 誘 導(dǎo) 再 生 苗 成 功 后 ，應(yīng) 該 立 即 去 除 這 些 添 加 劑 。 愈 傷 組 織 成 苗 階 段 最 佳 培養(yǎng) 基 為 1 / 2 W P M + 1 . 0 m g / L 6 - B A + 0 . 1 m g / L N A A +8 m g / L A g N O3+ 水 解 乳 蛋 白 1 0 0 m g / L 。 研 究 前 3 周 保梅 花 品 種“ 美 人 ” 葉 片 離 體 再 生 體 系 建 立T h e E s t a b l i s h m e n t o f i n v i t r o R e g e n e r a t i o n S y s t e m o f M e i r e n C u l t i v a r b y U s i n g t h e L e a v e s a s E x p l a n t s8 9 3分 子 植 物 育 種M o l e c u l a r P l a n t B r e e d i n g持 暗 培 養(yǎng) ， 之 后 轉(zhuǎn) 入 光 培 養(yǎng) ， 大 約 在 4 0 d 左 右 愈 傷 組織 開 始 分 化 成 苗 。 最 終 突 破 了 梅 花 再 生 困 難 這 一 技 術(shù)瓶 頸 ， 實 現(xiàn) 了 梅 花 再 生 體 系 的 建 立 ， 為 將 來 梅 花 的 遺傳 轉(zhuǎn) 化 體 系 的 建 立 及 轉(zhuǎn) 基 因 研 究 奠 定 基 礎(chǔ) 。致 謝本 研 究 由 國 家 自 然 科 學(xué) 基 金 “ 梅 花 植 株 再 生 體 系與 遺 傳 轉(zhuǎn) 化 體 系 建 立 的 研 究 ” 項 目 ( 3 0 3 7 1 1 8 7 ) 資 助 。參 考 文 獻(xiàn)A n t o n e l l i M . , a n d D r u a r t P . , 1 9 9 0 , T h e u s e o f a b r i e f 2 , 4 - D t r e a t -m e n t t o i n d u c e l e a f r e g e n e r a t i o n o n P r u n u s c a n e s c e n s B o i s . ,A c t a H o r t . , 2 8 0 : 4 5 - 5 0E s c a l e t t e s V . , a n d D o s b a F . , 1 9 9 3 , I n v i t r o a d v e n t i t i o u s s h o o t r e -g e n e r a t i o n f r o m l e a v e s o f P r u n u s s p p . , P l a n t S c i . , 9 0 ( 2 ) :2 0 1 - 2 0 9K i n t z i o s S . , M a n o s C . , a n d M a k r i O . , 1 9 9 9 , S o m a t i c e m b r y o g e n -e s i