33(5)713-718 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào) Chinese Journal of Biological Control 2017 年 10 月 收稿日期： 2017-04-07 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（ 31500428） ；湖北省農(nóng)科院競(jìng)爭(zhēng)性項(xiàng)目（ 2015jzxjh04） ；湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（ 2016620000001038） ；湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院重大研發(fā)成果培育專項(xiàng)（ 2017CGPY01） 作者簡(jiǎn)介：劉曉艷，副研究員， E-mail： xiaoyanliu6613163.com； *通信作者。 DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2017.05.019 蘇云金芽胞桿菌殺線蟲活性因子分析及殺蟲機(jī)制研究進(jìn)展 劉曉艷*，閔 勇，黃大野，方 偉，王開梅，楊自文 （湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心生物農(nóng)藥分中心 /湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心 /湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，武漢 430064） 摘要： 蘇云金芽胞桿菌 Bacillus thuringiensis（ Bt） ，是一種重要的昆蟲病原細(xì)菌，對(duì)多種農(nóng)業(yè)害蟲包括鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目和線蟲等具有高特異殺蟲活性，是迄今應(yīng)用最廣泛的微生物殺蟲劑。本文總結(jié)了殺線蟲 Bt 菌株的活性因子種類以及不同類的活性物質(zhì)殺線蟲機(jī)制的分析，能夠?yàn)樯餁⒕€劑的研究與創(chuàng)制提供理論基礎(chǔ)。 關(guān) 鍵 詞： 蘇云金芽胞桿菌；殺線蟲活性因子；殺線蟲機(jī)制 中圖分類號(hào)： S476.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1005-9261(2017)05-0713-06 Research Advances on the Nematicidal Factors and Virulence Mechanisms of Bacillus thuringiensis LIU Xiaoyan*, MIN Yong, HUANG Daye, FANG Wei, WANG Kaimei, YANG Ziwen (Biopesticide Branch, Hubei Innovation Centre of Agricultural Science and Technology/Hubei Biopesticide Engineering Research Centre/Institute of Plant Protection, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430064, China) Abstract: Bacillus thuringiensis abbreviated as Bt, is a kind of important insect pathogenic bacteria with high specific insecticidal activity against various agricultural pests, including Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, Hymenoptera and nematode. Bt is by far the most widely used microbial insecticide. In this paper, we summarized the types of active factors and the nematicidal mechanism, which could provide the theoretical basis for the research and development of the bio-nematicides. Key words: Bacillus thuringiensis; nematicidal factors; nematicidal mechanism 蘇云金芽胞桿菌 Bacillus thuringiensis（ Bt）是一種好氧、產(chǎn)孢的革蘭氏陽性細(xì)菌，這種細(xì)菌能夠產(chǎn)生特異性的殺蟲晶體蛋白（ insecticidal crystal proteins， ICPs），對(duì)鱗翅目 Lepidoptera、鞘翅目 Coleoptera、膜翅目 Hymenoptera、雙翅目 Diptera、線蟲 Nematodes 及螨類 Acaribs 等多種害蟲具有高殺蟲活性1-4，是迄今為止世界上應(yīng)用最廣泛的生物殺蟲劑。近年來，國(guó)內(nèi)外的學(xué)者在 Bt 殺線蟲的種類、殺線蟲 Bt 基因的克隆、殺線蟲活性物質(zhì)的鑒定及殺線蟲的機(jī)理等方面展開了大量研究工作，并取得了顯著的進(jìn)展。 1 Bt殺線蟲的種類 研究報(bào)道， Bt 可以對(duì)多種不同來源、不同種屬的線蟲起到毒殺作用。 1963 年， Ciordia 與 Bizzeli5發(fā)現(xiàn) Bt 蘇云金亞種對(duì)牛腸道線蟲的卵和幼蟲具有毒殺活性； 1972 年， Prasad 等6首先發(fā)現(xiàn) 外毒素不僅影響根結(jié)線蟲 Meloidogyne incognita 卵的孵化，還對(duì)其幼蟲具有高毒殺活性。此外， 外毒素還對(duì)香蕉穿孔線蟲 Radopholus similis 和酸醬線蟲 Panagrellus redivivus 具有毒殺作用7。 1985 年， Bone 等8發(fā)現(xiàn)以色列亞種及庫(kù)斯塔克亞種的晶體蛋白對(duì)動(dòng)物寄生線蟲蛇形毛圓線蟲 Trichostronglus colubriformis 的幼蟲和卵有714 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 33 卷 高活性，以色列亞種的毒素蛋白還對(duì)奧斯特線蟲 Ostertagia ostertagi、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲 Haemonchus contortus等動(dòng)物寄生線蟲的卵有毒殺活性9。 1992 年， Bradfish10用溶解的伴胞晶體蛋白進(jìn)行線蟲生物測(cè)定發(fā)現(xiàn)，對(duì)根結(jié)線蟲屬 Meloidogyne spp.、滑刃線蟲屬 Aphlenchoides spp.、短體線蟲屬 Pratylenchus spp.和矮化線蟲屬 Tylenchs spp.等植物寄生線蟲有毒殺活性。 1994 年， Sharma 等11用以色列亞種的毒素蛋白處理大豆和玉米種子，大豆胞囊線蟲 Heterodera glycines Ichinohe 病害顯著減輕。 1995 年，蘇云金芽胞桿菌伴胞晶體毒素中加入乳突類圓線蟲 Strongyloides papillosus，發(fā)現(xiàn)幼蟲隨毒素量的增加，死亡數(shù)亦相應(yīng)增加12。 1996年，有報(bào)道證明蘇云金芽胞桿菌的伴胞晶體毒素對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲有毒13。還發(fā)現(xiàn) Bt 伴胞晶體蛋白對(duì)豬蛔蟲的殺蟲作用十分明顯，對(duì)豬無急性毒副作用14。余子全等15從全國(guó)各地采集到的 1500 多株蘇云金芽胞桿菌中篩選到 9 株對(duì)北方根結(jié)線蟲 Meloidogyne hapla、苧麻短體線蟲 Pratylenchus scribneri 和甘薯莖線蟲Ditylenchus destructor 有高毒力的菌株。研究者們相繼還發(fā)現(xiàn)蘇云金芽胞桿菌對(duì)松材線蟲和廣州管圓線蟲Angiostrongylus cantonensis 具有殺線蟲活性16-19。報(bào)道稱 Cry5B 和 Cry21A 毒素蛋白對(duì)鼠類中的蛔蟲Heligmosomoides polygyrus bakeri 和倉(cāng)鼠錫蘭鉤蟲 Ancylostoma ceylanicum 具有高毒力20,21。該課題組接著發(fā)現(xiàn) Cry5B 蛋白還對(duì)人和豬的寄生蛔蟲 Ascaris suum 有活性，因此 Bt 除了應(yīng)用在農(nóng)業(yè)上外還可以用在醫(yī)藥上，有望開發(fā)成驅(qū)蟲劑22。 2 Bt殺線蟲晶體蛋白基因 目前已報(bào)道的對(duì)線蟲具有殺蟲活性的 Bt 基因分為 9 大類，共 25 種（表 1），包括 cry1 類的 cry1Aa、cry1Ia、 cry1Ea6， cry5 類的 cry5Aa1、 cry5Ab1、 cry5Ac1、 cry5Ad1、 cry5Ba1、 cry5Ba2、 cry5Ba3， cry6 類的 cry6Aa1、 cry6Aa2、 cry6Aa3， cry12 類的 cry12Aa1， cry13 類的 cry13Aa1、 cry13Aa2， cry14 類的 cry14Aa1、cry14Ab1， cry21 類的 cry21Aa1、 cry21Aa2、 cry21Ba1、 cry21Fa1、 cry21Ha1， cry35 類的 cry35Aa4 和 cry55類的 cry55Aa123-35。通過這些殺線蟲 Bt 蛋白的序列同源性比較分析， cry1 類與 cry55 類、 cry5A 類與 cry12類、 cry5B 類與 cry21 類、 cry13 類與 cry14 類親緣關(guān)系較近， cry6 類及 cry35 類與上述基因親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，單獨(dú)分為一類（圖 1）。 Cry21Ba1Cry5Ba3Cry5Ba2Cry5Ba1Cry21Aa1Cry21Aa2Cry13Aa1Cry13Aa2Cry14Aa1Cry14Ab1Cry12Aa1Cry5Aa1Cry5Ab1Cry5Ac1Cry5Ad1Cry21Fa1Cry21Ha1Cry1Ea6Cry6Aa1Cry6Aa2Cry6Aa3Cry35Aa4Cry55Aa1Cry1Aa1Cry1Ia圖 1 蘇云金芽胞桿菌中殺線蟲晶體蛋白親緣關(guān)系比較圖 Fig. 1 Phylogenetic relationship map of nematicidal crystal protein from B. thuringiensis 第 5 期 劉曉艷等：蘇云金芽胞桿菌殺線蟲活性因子分析及殺蟲機(jī)制研究進(jìn)展 715 表 1 已報(bào)道的具有殺線蟲活性的 Bt 晶體蛋白 Table 1 The reported Bt nematicidal crystal proteins 殺蟲蛋白名稱 Protein name 氨基酸序列登錄號(hào) GenBank ID 作者 Author 年份 Year 菌株 Strain Cry1Aa WP016090222.1 Liu et al 232015 YC10 Cry1Ia WP000769223.1 Liu et al 232015 YC10 Cry1Ea6 AAL50330.1 Sun et al 241999 YBT1532 Cry5Aa1 AAA67694.1 Narva et al251994 PS17 Cry5Ab1 AAA67693.1 Narva et al251991 PS17 Cry5Ac1 I34543.1 Payne et al251997 - Cry5Ad1 ABQ82087.1 Lenane et al252007 L366 Cry5Ba1 AAA68598.1 Foncerrada & Narva251997 PS86Q3 Cry5Ba2 ABW88931.1 Guo et al262008 YBT1518 Cry5Ba3 AFJ04417.1 Wang et al252012 zjfc85 Cry6Aa1 AAA22357.1 Narva et al251993 PS52A1 Cry6Aa2 AAM46849.1 Bai et al152001 YBT1518 Cry6Aa3 ABH03377.1 Jia et al252006 96418 Cry12Aa1 AAA22355.1 Narva et al251991 PS33F2 Cry13Aa1 AAA22356.1 Narva et al251992 PS63B Cry13Aa2 ANS46158.1 Hollensteiner et al252016 MYBT18246 Cry14Aa1 AA21516. Narva et al251994 PS80JJ1 Cry14Ab1 AGU13817.1 Sampson et al252012 ARP001 Cry21Aa1 I32932.1 Payne et al251996 - Cry21Aa2 66477.1 Feitelson251997 - Cry21Ba1 BAC06484.1 Sato & Asano252002 - Cry21Fa1 AHI15915. Iatsenko et al272013 DB27 Cry21Ha1 HI15917.1 Iatsenko et al272013 DB27 Cry35Aa4 AAT29025. Schnepf et al282004 PS185GG Cry55Aa1 BW88932.1 Guo et al262008 YBT1518 3 Bt中其他殺線蟲活性成分 Bt 中殺線蟲的主要活性物質(zhì)為殺蟲晶體蛋白如 Cry1Aa、 Cry5Ba2、 Cry6Aa2、 Cry14Aa1、 Cry21Aa1和 Cry55Aa1（表 1） ， 此外， 還有一些次級(jí)代謝產(chǎn)物也具有較高的殺線蟲活性， 如化合物類的蘇云金素36-38和反式烏頭酸39，金屬蛋白酶、幾丁質(zhì)酶及其他蛋白，如雙結(jié)構(gòu)域蛋白40-43等（表 2）。 表 2 已報(bào)道的 Bt 中對(duì)殺線蟲有毒殺作用的其他活性因子 Table 2 Other reported nematicidal bioactive factors from Bt 分類名稱 Name 殺線蟲成分 Nematicidal factors 殺線蟲基因 Nematicidal genes 參考文獻(xiàn) Reference 化合物 Compound 蘇云金素 Thuringiensin thu cluster 37 反式烏頭酸 Trans-aconitic acid tbrA， tbrB 39蛋白酶 Protease 金屬蛋白酶 Metalloproteinase bmp1 40膠原蛋白酶 Collagenase colB 41 幾丁質(zhì)酶 Chitinase chi9602 42其他蛋白 Other protein 雙結(jié)構(gòu)域蛋白 Two-domain protein nel 43 716 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 33 卷 4 Bt中活性因子的殺線蟲機(jī)制 Zheng 等44通過比對(duì) 120 株產(chǎn)孢芽胞桿菌菌株的基因組序列，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在這些對(duì)線蟲具有毒殺活性的菌株中至少存在 4 種殺蟲機(jī)制：晶體蛋白的穿孔機(jī)制、蘇云金素的 RNA 聚合酶抑制機(jī)制、蛋白酶的降解機(jī)制和幾丁質(zhì)酶的降解機(jī)制。 4.1 殺蟲晶體蛋白的穿孔機(jī)制 認(rèn)為晶體蛋白殺死線蟲的機(jī)理可能與昆蟲相類似，毒素蛋白在線蟲腸道堿性環(huán)境下被蛋白酶剪切加工，分解成有毒的多肽，與線蟲中腸上皮細(xì)胞的靶標(biāo)部位結(jié)合，破壞腸道組織，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，使靶標(biāo)線蟲死亡45-52。 Marroquin 等53研究發(fā)現(xiàn)， Cry5B 蛋白能使秀麗小桿線蟲整個(gè)腸組織收縮，脫離體壁并形成類似空泡的結(jié)構(gòu)。 Wei 等54也發(fā)現(xiàn)，晶體蛋白作用線蟲時(shí)，其腸道收縮脫離體壁并造成腸組織退化。通過羅丹明標(biāo)記的毒素蛋白作用秀麗小桿線蟲發(fā)現(xiàn)，所有熒光都集中在腸道組織上，表明毒素蛋白作用在線蟲的腸道組織上55。最新研究報(bào)道 Cry6Aa 蛋白具有 螺旋結(jié)構(gòu)，其對(duì)線蟲的作用也可能是通過穿孔完成56。 4.2 蘇云金素的 RNA 聚合酶抑制機(jī)制 蘇云金素是一種由 Bt 產(chǎn)生的小分子量殺線蟲活性物質(zhì)，也稱為 外毒素。通常認(rèn)為，蘇云金素是核酸代謝抑制劑，由于和 ATP 的結(jié)構(gòu)類似，會(huì)與 ATP 競(jìng)爭(zhēng) RNA 聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制依賴于 DNA的 RNA 聚合酶57。然而通過對(duì)蘇云金素分子的合成與代謝途徑的分析發(fā)現(xiàn)，其化學(xué)本質(zhì)更像是糖類衍生物，因此，蘇云金素對(duì)線蟲的殺蟲機(jī)制是否與 ATP 競(jìng)爭(zhēng) RNA 聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)有待進(jìn)一步的研究37。 4.3 蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的降解機(jī)制 Bt 菌株通常含有多種蛋白酶基因，如 bmp1 和 colB，這些基因表達(dá)的蛋白酶可以降解線蟲的中腸，導(dǎo)致線蟲的死亡40,41。 Bt 菌株產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶則是通過降解線蟲卵的幾丁質(zhì)成分來殺死線蟲42。 除了上述機(jī)制外，還有研究發(fā)現(xiàn) Cry6Aa 蛋白通過影響壞死信號(hào)通路啟動(dòng)了秀麗小桿線蟲的細(xì)胞凋亡過程46。此外一種含有雙結(jié)構(gòu)域蛋白 Nel 可以在模式植物和線蟲體內(nèi)啟動(dòng)熱應(yīng)激途徑和壞死途徑，從而引起線蟲的死亡43。 5 結(jié)語 對(duì)線蟲具有殺蟲活性 Bt 菌株的發(fā)現(xiàn)，為線蟲病害的生物防治提供了一個(gè)安全、有效的途徑。通過鑒定 Bt 中殺線蟲活性因子的本質(zhì)，了解這些活性因子殺蟲機(jī)制，有助于開發(fā)新的生物殺線劑，推進(jìn)生物農(nóng)藥在線蟲病害防治中的應(yīng)用。此外，通過進(jìn)一步研究， Bt 及其代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥上防治寄生蟲的應(yīng)用也是大有可能的。 參 考 文 獻(xiàn) 1 Schnepf E, Crickmore N, Van Rie J, et al. 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