中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 2025 30 8 38 49 Journal of China Agricultural University http 拮抗灰葡萄孢木霉菌的鑒定及其防病作用 石精濤 1 曹建敏 1 韓小斌 2 丁應(yīng)福 3 劉建陽 3 李 喆 1 趙棟霖 1 張成省 1 林 偉 3 徐康文 1 1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 煙草研究所 山東 青島 266101 2 福建省煙草公司南平市公司 福建 南平 353000 3 貴州省煙草公司遵義市公司 貴州 遵義 563100 摘 要 為鑒定健康葡萄果實(shí)中篩選出對(duì)灰葡萄孢具有拮抗作用的木霉菌 探究其發(fā)揮抑制效果的關(guān)鍵化合物以 及對(duì)葡萄灰霉病的防治效果 利用平板對(duì)峙及對(duì)扣法篩選出目標(biāo)木霉菌后 通過形態(tài)學(xué)觀察和多基因系統(tǒng)發(fā)育分 析對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行菌種鑒定 后采用掃描 SEM 和透射電鏡 TEM 觀察木霉菌產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物 VOCs 對(duì)灰 葡萄孢菌絲形態(tài)的影響 并利用氣相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用法 GC MS 對(duì)木霉菌VOCs進(jìn)行組分分析 最后通過熏蒸法 對(duì)鑒定出的VOCs進(jìn)行抑菌活性評(píng)估 半抑制濃度測(cè)定以及對(duì)葡萄灰霉病的防效試驗(yàn) 結(jié)果表明 1 本研究篩選 得到的目標(biāo)木霉菌GUI12菌株被鑒定為檸檬綠木霉 Trichoderma citrinoviride 2 與平板對(duì)峙相比 對(duì)扣培養(yǎng)時(shí) GUI12對(duì)灰葡萄孢的抑制效果較好 抑制率可達(dá)89 63 3 SEM與TEM觀察結(jié)果顯示GUI12產(chǎn)生的VOCs會(huì)導(dǎo) 致灰葡萄孢菌絲變粗 褶皺 塌陷 并使包括細(xì)胞核 線粒體及液泡等在內(nèi)的細(xì)胞器輪廓模糊 甚至溶解和消失 4 離體葡萄抗病測(cè)定結(jié)果顯示 VOCs能夠有效抑制葡萄果實(shí)病斑的擴(kuò)展 對(duì)葡萄灰霉病斑擴(kuò)展的抑制率為 53 56 5 GC MS分析結(jié)果顯示GUI12產(chǎn)生乙酸異丁酯 2 3 丁二酮 苯乙醇等19種VOCs 它們?cè)?00 L L 的濃度下均能不同程度地抑制灰葡萄孢的菌絲生長 其中2 3 丁二酮 苯乙醇的抑制率均為100 6 2 3 丁二酮 在EC 50 14 97 L L 濃度下對(duì)葡萄灰霉病的防效為100 苯乙醇也能夠在2 EC 50 95 38 L L 濃度下對(duì)葡萄 灰霉病的防效達(dá)到100 綜上 本研究篩選得到的木霉菌GUI12產(chǎn)生的VOCs能夠抑制灰葡萄孢菌絲生長 造成 細(xì)胞器損傷 有效抑制葡萄灰霉病斑的擴(kuò)散 其中 2 3 丁二酮 苯乙醇對(duì)葡萄灰霉病的防治效果較好 具有進(jìn)一 步研究與開發(fā)的潛力 關(guān)鍵詞 檸檬綠木霉 灰葡萄孢 揮發(fā)性有機(jī)化合物 氣相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用法 生物防治 中圖分類號(hào) S476 文章編號(hào) 1007 4333 2025 08 0038 12 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A Identification of Trichoderma antagonizing Botrytis cinerea and its disease prevention effect SHI Jingtao 1 CAO Jianmin 1 HAN Xiaobin 2 DING Yingfu 3 LIU Jianyang 3 LI Zhe 1 ZHAO Donglin 1 ZHANG Chengsheng 1 LIN Wei 3 XU Kangwen 1 1 Chinese Academy of Agricultural Sciences Tobacco Research Institute Qingdao 266101 China 2 Fujian Tobacco Company Nanping Company Nanping 35300 China 3 Guizhou Tobacco Company Zunyi Company Zunyi 563100 China 收稿日期 2024 11 28 基金項(xiàng)目 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 32302448 山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目 ZR2024QC002 中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng) 1610232023025 煙草常用生 物農(nóng)藥新型增效劑的研究及應(yīng)用 NYK2025 02 03 中國煙草總公司重大科技項(xiàng)目 110202101057 LS 17 第一作者 石精濤 ORCID 0009 0003 6238 9728 碩士研究生 E mail sjthnsmx 163 com 通訊作者 林偉 ORCID 0009 0009 394 6526 主要從事?lián)]發(fā)物鑒定與功能研究 E mail lw160718 163 com 徐康文 ORCID 0000 0003 0557 0590 主要從事生物防治研究 E mail xukangwen caas cn 石精濤 曹建敏 韓小斌 丁應(yīng)福 劉建陽 李喆 趙棟霖 張成省 林偉 徐康文 拮抗灰葡萄孢木霉菌的鑒定及其防病作用 J 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 2025 30 08 38 49 SHI Jingtao CAO Jianmin HAN Xiaobin DING Yingfu LIU Jianyang LI Zhe ZHAO Donglin ZHANG Chengsheng LIN Wei XU Kangwen Identification of Trichoderma antagonizing Botrytis cinerea and its disease prevention effect J Journal of China Agricultural University 2025 30 08 38 49 DOI 10 11841 j issn 1007 4333 2025 08 04 第 8 期 石精濤等 拮抗灰葡萄孢木霉菌的鑒定及其防病作用 Abstract The aims of this study were to identify the Trichoderma strains with antagonistic action against Botrytis cinerea from healthy grape berries and explore the key compounds that exert inhibitory effects and the control effect on grape gray mold By plate confrontation and buckle method the target strain was identified by morphological observation and multi gene phylogenetic analysis The impact of volatile organic compounds VOCs emitted by Trichoderma spp on the morphological alterations of B cinerea mycelium was examined using scanning electron microscopy SEM and transmission electron microscopy TEM The components of Trichoderma VOCs were analyzed by gas chromatography mass spectrometry GC MS Finally the antibacterial activity evaluation semi inhibitory concentration determination and control effect test on grape gray mold of the identified VOCs were carried out using the fumigation method The results showed that 1 The target Trichoderma strain GUI12 screened in this study was identified as Trichoderma citrinoviride 2 Compared with the plate confrontation the inhibition effect of GUI12 on B cinerea was better in the buckle culture and the inhibition rate could reach 89 63 3 SEM and TEM observation results showed that the VOCs produced by GUI12 could cause the mycelium of B cinerea to become thicker wrinkled and collapsed and blur the outline of organelles including nucleus mitochondria and vacuoles even dissolve and disappear 4 The result of the in vitro grape disease resistance test showed that VOCs could effectively inhibit the expansion of grapefruit lesions and the inhibition rate of grape gray mold lesion expansion was 53 56 5 GC MS analysis showed that GUI12 produced 19 types VOCs such as isobutyl acetate 2 3 butanedione phenylethyl alcohol etc They could inhibit the mycelial growth of B cinerea in different degrees at the concentration of 100 L L and the inhibition rates of 2 3 butanedione and Phenylethyl alcohol were 100 6 The control effect of 2 3 butanedione on grape gray mold was 100 at EC 50 14 97 L L Phenethyl alcohol also achieved a 100 control effect on grape gray mold at 2 EC 50 95 38 L L In summary the VOCs produced by GUI12 can inhibit the growth of B cinerea hyphae cause organelle damage and effectively inhibit the spread of grape gray mold lesions Among them 2 3 butanedione and phenylethyl alcohol have better control effects on grape gray mold and have the potential for further research and development Keywords Trichoderma citrinoviride Botrytis cinerea VOCs GC MS biocontrol resources 灰霉病是由葡萄孢屬 Botrytis spp 真菌引起 的一種重要的世界性病害 目前已知葡萄孢屬真 菌包含30多個(gè)種屬 1 其中灰葡萄孢的寄主范圍十 分廣泛 能侵染包括番茄 黃瓜 茄子 葡萄和煙草 等在內(nèi)的200多種經(jīng)濟(jì)作物 除此之外 灰葡萄孢 在作物的儲(chǔ)藏 運(yùn)輸期間也會(huì)造成巨大的產(chǎn)量和經(jīng) 濟(jì)損失 2 4 目前 由于缺乏有效的商業(yè)化抗病品 種 灰霉病的防治仍主要依賴噴施化學(xué)殺菌劑 化 學(xué)殺菌劑在使用過程中普遍存在過量噴施 容易造 成藥物殘留及環(huán)境污染等問題 5 7 利用有益微生物進(jìn)行作物病害防治是綠色防 控的重要發(fā)展方向之一 8 研究表明 木霉菌 Trichoderma spp 酵母菌 Saccharomyces spp 芽孢桿菌 Bacillus spp 鏈霉菌 Streptomyces spp 等在抑制病原真菌和細(xì)菌上具有良好的效 果 9 10 生防菌株的作用機(jī)制主要包括抗生作用 定殖位點(diǎn) 營養(yǎng)或礦物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng) 寄生和噬菌體 其 中通過分泌抗真菌代謝物質(zhì) Antifungal Metabo lites AFMs 來發(fā)揮對(duì)病原真菌的抗生作用是最常 見的策略 目前研究較多的抗真菌代謝物質(zhì)主要有 抗生素 酶和揮發(fā)物 11 揮發(fā)性有機(jī)化合物是一種 低分子量含碳化合物 易擴(kuò)散到土壤孔隙 液體及 大氣中 是一種理想的化學(xué)介質(zhì) 目前已被應(yīng)用于 植物病害防治 木霉菌作為研究最多 并且在商業(yè) 實(shí)踐中應(yīng)用最廣泛的一種生防真菌 具有廣譜性 高 適應(yīng)性強(qiáng)和多機(jī)制等特點(diǎn) 且能夠分泌大量具 有抗菌作用的次生代謝產(chǎn)物 12 在這些抗菌物質(zhì) 中 揮發(fā)性有機(jī)化合物因其高效的抗菌活性和低環(huán) 境殘留性成為研究熱點(diǎn) 圍繞木霉菌屬產(chǎn)生揮發(fā) 物的抗菌活性已開展了廣泛的研究 20世紀(jì)70年 代 Colins等 13 已開始研究木霉菌氣體揮發(fā)物的成 分 近來又陸續(xù)有文獻(xiàn)報(bào)道了木霉菌產(chǎn)生的揮發(fā)性 有機(jī)化合物在防治植物真菌病害中的應(yīng)用 張銘 等 14 報(bào)道了森吉木霉 Trichoderma songyi M75產(chǎn) 生的VOCs可以有效抑制松球殼孢菌 Sphaeropsis sapinea 的生長 經(jīng)過氣相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用法 GC 39 中 國 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 2025 年 第 30 卷 MS 分析 以及各揮發(fā)物純品的體外菌絲生長抑制 試驗(yàn)結(jié)果顯示 揮發(fā)性物質(zhì)中的芳樟醇的抑菌效果 最好 其可以抑制金黃殼囊菌 Cytospora chryso sperma 栗疫菌 Cryphonectria parastica 和鏈格孢 Alternria sp 等多種病原真菌 前期研究在健康葡萄果實(shí) 青島膠州采摘 中 分離得到一株對(duì)灰葡萄孢有較強(qiáng)拮抗作用的木霉 菌 命名為GUI12 其發(fā)揮抑菌作用的關(guān)鍵代謝產(chǎn) 物和對(duì)灰霉病的防治效果尚未明確 因此 本研究 擬以GUI12菌株為研究對(duì)象 采用形態(tài)學(xué)及分子生 物學(xué)對(duì)菌株進(jìn)行鑒定 并研究其在不同時(shí)間產(chǎn)生的 VOCs對(duì)灰葡萄孢的抑制情況 以及VOCs對(duì)灰葡 萄孢形態(tài)和結(jié)構(gòu)的影響及其對(duì)灰霉病害的防治效 果 分析GUI12產(chǎn)生的VOCs的組成成分以及對(duì)灰 葡萄孢的有效抑菌物質(zhì) 并針對(duì)有效抑菌物質(zhì)開展 藥效試驗(yàn) 驗(yàn)證其實(shí)際應(yīng)用效果 以期為該菌株應(yīng) 用于灰霉病的防治提供依據(jù) 1 材料與方法 1 1 試驗(yàn)材料及主要儀器 試驗(yàn)于2023年11月 2024年9月完成于中國 農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所 供試病原真菌灰葡萄孢 菌株0201 生防真菌菌株GUI12均保藏于中國農(nóng)業(yè) 科學(xué)院煙草研究所 所用PDA及PDB培養(yǎng)基 購 自北京索萊寶科技有限公司 中國 培養(yǎng)箱為上 海一恒LRH 250生化培養(yǎng)箱 振蕩培養(yǎng)箱型號(hào)為上 海知楚ZQZY CF9 9振蕩培養(yǎng)箱 中國 氣相色譜 質(zhì)譜儀型號(hào)為安捷倫7890B 5975C氣相色譜質(zhì)譜 儀 美國 1 2 試驗(yàn)方法 1 2 1 GUI12菌株和灰葡萄孢菌0201對(duì)扣培養(yǎng) 參照Kong等 12 的平板對(duì)扣方法并略加修改 選取活化狀態(tài)良好的GUI12菌株以及0201菌株 利 用無菌打孔器 5 mm 在其菌絲邊緣處打孔 分 別接種于預(yù)先制備好的2個(gè)PDA培養(yǎng)基 90 mm 15 mm的培養(yǎng)皿中加入15 mL的PDA 中央 隨后 將這2個(gè)培養(yǎng)基去蓋對(duì)扣 用 Parafilm 封口膜進(jìn)行 密封 接種GUI12菌株的培養(yǎng)基置下 接種0201菌 株的培養(yǎng)基置上 以未接種GUI12菌餅的 PDA 培 養(yǎng)基對(duì)扣0201培養(yǎng)基作為對(duì)照 每個(gè)處理重復(fù)3 次 置于 25 恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng) 并在接種后 24 48 72 96 h時(shí)使用游標(biāo)卡尺精確測(cè)量0201菌株 菌落的直徑 mm 抑菌率計(jì)算公式如下 抑菌率 1 處理組菌落直徑 5 對(duì)照組菌落直徑 5 100 1 2 2 GUI12菌株的鑒定 GUI12菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 用打孔器 5 mm 取菌餅倒置于PDA培養(yǎng)基將GUI菌株活化 后 28 培養(yǎng)3 d 待長出菌落后 用接種針挑取菌 絲置于載玻片上 在顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)特征 并對(duì)其進(jìn)行初步鑒定 GUI12菌株的分子生物學(xué)鑒定 菌株GUI12 ITS1 ITS4基因擴(kuò)增及測(cè)序采用CTAB法進(jìn)行基因組總DNA 提取 PCR擴(kuò)增體系為50 L 模板DNA 36 ng L 2 L 引物ITS1 5 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3 和ITS4 5 TCCTCCGCTTATTGATATGC 3 10 mol L 各2 L 10 Phanta Flash Mix Dye Plus 2 L 雙蒸水19 L PCR擴(kuò)增程序 95 5 min 95 15 s 56 15 s 72 2 min 34個(gè)循環(huán) 72 10 min 將PCR產(chǎn)物送交北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè) 序 測(cè)序結(jié)果查詢GenBank數(shù)據(jù)庫 采用BLAST在 線工具與數(shù)據(jù)庫的序列進(jìn)行同源性比較 利用MEGA X軟件 使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 1 2 3 掃描電鏡 SEM 及透射電鏡 TEM 觀察 GUI12菌株和灰葡萄孢菌0201菌絲形態(tài) 影響 參照1 2 1的方法 將GUI12菌株與0201菌株 對(duì)扣培養(yǎng)3 d 以未接種GUI12菌餅的 PDA 培養(yǎng)基 對(duì)扣0201培養(yǎng)基作為對(duì)照 收集的菌絲體用 2 5 Gluta 固定液固定 4 C 送往青島大學(xué)醫(yī)學(xué) 部進(jìn)行SEM和TEM觀察 1 2 4 GUI12菌株揮發(fā)性物質(zhì)在離體葡萄上的抑 制作用 灰葡萄孢分生孢子液制備 以0201菌株為材 料 在PDA平板上25 培養(yǎng)10 d 無菌水沖洗 使 用8層紗布過濾菌絲 吸取上清 用血球計(jì)數(shù)板在顯 微鏡下確定灰葡萄孢孢子液濃度 無菌水稀釋成 1 10 5 個(gè) mL孢子懸浮液 在組培瓶 600 mL 中加入100 mL PDA后滅菌 在處理組中放入GUI12菌餅 對(duì)照為空白PDA 將新 鮮葡萄果實(shí) 浸泡在 2 次氯酸鈉溶液中2 min 用無 菌水沖洗 3次后晾干 采用無菌針頭于果實(shí)上刺1個(gè) 傷口 3 mm 3 mm 然后將5 L灰葡萄孢孢子懸浮 液加入傷口 每個(gè)組培瓶放置5個(gè)接種后的果實(shí) 快 40 第 8 期 石精濤等 拮抗灰葡萄孢木霉菌的鑒定及其防病作用 速蓋上組培瓶蓋 用Parafilm封口膜進(jìn)行密封 在25 下培養(yǎng)3 d后 觀察并測(cè)量病斑直徑 mm 根據(jù)病斑 直徑計(jì)算抑制率 每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù) 病斑生長 抑制率具體計(jì)算公式如下 病斑生長抑制率 對(duì)照病斑直徑 處理病斑直徑 對(duì)照病斑直徑 3 100 1 2 5 GUI12菌株揮發(fā)性物質(zhì)的收集和其組分 分析 揮發(fā)性物質(zhì)的制備 將這2個(gè)活化狀態(tài)良好的 GUI12菌餅 5 mm 放置于150 mL的PDA培 養(yǎng)瓶中 用 Parafilm 封口膜進(jìn)行密封 在28 C條件 下培養(yǎng)3 d 以未接種菌塊的PDA為對(duì)照 每個(gè)處理 設(shè)置3個(gè)重復(fù) 揮發(fā)性物質(zhì)的吸附 將培養(yǎng)3 d后的培養(yǎng)瓶置 于40 水浴30 min 之后將SPME針插入培養(yǎng)瓶瓶 1 3 處 然后推出萃取頭 頂空吸附 45 min 后樣品 采集結(jié)束 揮發(fā)性物質(zhì)的分析方法 色譜分析采用氦氣作 為載氣 流速設(shè)定為1 mL min SPME針在220 C 下解吸5 min 色譜柱為RTX 5MS柱 3 m長 內(nèi) 徑0 25 mm 膜厚0 25 mm 初始溫度設(shè)定為 35 持續(xù)3 min后以10 min的速率升至180 再以4 min的速率升至240 并保持5 min 質(zhì) 譜儀在電子電離模式下運(yùn)行 能量設(shè)定為70 eV 溫 度220 掃描范圍50 500 m z 利用安捷倫 MassHunter B 05 02 軟件進(jìn)行色譜圖的獲取與分 析 揮發(fā)性物質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果通過與安捷倫NIST 數(shù) 據(jù)庫進(jìn)行比對(duì) 結(jié)合Kovats保留指數(shù)的計(jì)算與匹 配 對(duì)解析出的VOC峰進(jìn)行鑒定 當(dāng)化合物的質(zhì) 譜圖與數(shù)據(jù)庫中的匹配度超過800 且保留指數(shù) retention index RI 的差值 5時(shí) 該化合物即被確 認(rèn)為已鑒定 1 2 6 GC MS分析鑒定的揮發(fā)性化合物的抗菌 活性評(píng)估 購買通過GC MS分析鑒定的揮發(fā)性有機(jī)化合物 并采取熏蒸法評(píng)估其對(duì)0201菌株的抗菌活性 參照 1 2 1的方法接種0201菌株 之后在培養(yǎng)皿蓋內(nèi)部中 央貼上10 mm 10 mm滅菌濾紙 并在濾紙上滴加6 5 L的揮發(fā)性化合物 終濃度100 L L 快速蓋上培 養(yǎng)皿蓋 用Parafilm 封口膜進(jìn)行密封 以不加揮發(fā)性化 合物的濾紙片作為對(duì)照 每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù) 置 于 25 恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3 d 使用游標(biāo)卡尺精 確測(cè)量0201菌株菌落的直徑 mm 通過計(jì)算 得到 抑菌率 1 2 7 揮發(fā)物2 3 butanedione 2 3 丁二酮 Phenylethyl Alcohol 苯乙醇 對(duì)灰葡萄孢0201 的有效抑制中濃度 EC 50 參照1 2 6的方法 接種0201菌株并在培養(yǎng)皿蓋 上的濾紙上滴加0 325 0 650 0 975 1 300 1 625 L 的2 3 丁二酮將培養(yǎng)皿中空氣中2 3 丁二酮的濃度 控制在 5 10 15 20 25 L L 在培養(yǎng)皿蓋上的濾紙 上滴加0 650 1 625 3 250 4 875 6 500 L的苯乙 醇 將培養(yǎng)皿空氣中的苯乙醇的終濃度控制在 10 25 50 75 100 L L 快速蓋上培養(yǎng)皿蓋 用Parafilm 封口 膜進(jìn)行密封 以不加揮發(fā)性化合物的濾紙片作為對(duì)照 每個(gè)處理重復(fù)3次 置于 25 恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培 養(yǎng)3 d 使用游標(biāo)卡尺精確測(cè)量0201菌株菌落的直徑 mm 并分別計(jì)算不同濃度苯乙醇 2 3 丁二酮對(duì)0201 菌株的抑制率及EC 50 1 2 8 氣體揮發(fā)物2 3 丁二酮和苯乙醇在離體葡萄 上的抑制作用 參照1 2 4的方法完成灰葡萄孢分生孢子液制備 及在葡萄果實(shí)上接種灰葡萄孢分生孢子液 在組培 瓶 600 mL 底部空白位置放置滅菌濾紙 并分別滴加 不同量的2 3 丁二酮 苯乙醇使組培瓶中的2 3 丁二 酮 苯乙醇濃度達(dá)到各自對(duì)于0201菌株的EC 50 及2 EC 50 每個(gè)組培瓶放置5個(gè)接種后的果實(shí) 快速蓋上 組培瓶蓋 用Parafilm封口膜進(jìn)行密封 在25 下培 養(yǎng)3 d后 觀察并測(cè)量病斑直徑 mm 根據(jù)病斑直徑 計(jì)算抑制率 每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù) 1 3 統(tǒng)計(jì)分析 使用Microsoft Office Excel 2019和SPSS 18 0進(jìn) 行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 使用GraphPad Prism 2020作圖 2 結(jié)果與分析 2 1 GUI12產(chǎn)生的VOCs對(duì)灰葡萄孢生長的影響 本研究獲得的GUI12菌株與灰葡萄孢對(duì)扣試驗(yàn) 以及對(duì)其菌絲抑制效果及抑制率分別見圖1及圖2 由圖1可見 隨著對(duì)扣培養(yǎng)時(shí)間的增長 與GUI12菌株 對(duì)扣的灰葡萄孢與正常培養(yǎng)的灰葡萄孢菌落直徑差 距逐漸增大 由圖2可見 對(duì)扣培養(yǎng)24 h 48 h 72 h 96 h時(shí) 與正常培養(yǎng)的灰葡萄孢相比 GUI12菌株對(duì)扣 對(duì)灰葡萄孢菌落擴(kuò)展的抑制率分別為66 67 68 75 79 94 和89 63 結(jié)果表明GUI12菌株 產(chǎn)生的VOCs能夠有效抑制灰葡萄孢菌絲的生長 41 中 國 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 2025 年 第 30 卷 2 2 GUI12菌株的鑒定 通過形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定GUI12菌株 結(jié) 果見圖3 由圖3 a 可見 GUI12菌株培養(yǎng)3 d時(shí) 呈現(xiàn)出清晰的透明菌落和典型的氣生菌絲 菌餅周 圍菌絲變綠 菌落直徑為75 80 mm 由圖3 b 可見GUI12菌株分生孢子梗從菌絲 伸出 部分形成分生孢子 分生孢子呈亞球形至球 形 由圖3 c 可見將得到的GUI12菌株ITS測(cè)序 結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行BLAST比對(duì) 初 步鑒定為木霉菌 提取同源性較高的不同菌種的 序列與GUI12菌株序列 通過MEGA X采用鄰接 法聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 結(jié)果表明 GUI12與 Trichoderma citrinoviride 檸檬綠木霉 在同一分 支 結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 GUI12鑒定為 T citrinoviride 2 3 GUI12菌株產(chǎn)生的VOCs對(duì)灰葡萄孢的細(xì)胞 形態(tài)及結(jié)構(gòu)的影響 細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)對(duì)于病原菌侵染植物至關(guān)重 不同小字母表示差異達(dá)顯著水平 P 0 05 下同 Note Different lowercase letters indicate significant differences P 0 05 The same applies below 圖 2 與GUI12菌株對(duì)扣培養(yǎng)對(duì)灰葡萄孢的抑制率隨時(shí)間的變化 Fig 2 The changes in the inhibition rate of B cinerea by confrontation culture with the GUI12 strain over time GUI12為木霉菌 0201為灰葡萄孢菌 0201暴露的VOCs為對(duì)扣培養(yǎng)時(shí)GUI12菌株產(chǎn)生的VOCs 下同 GUI12 represents the strain of Trichoderma spp 0201 represents the strain of B cinerea the VOCs exposed to 0201 are the VOCs produced by the GUI12 strain during confrontation culture The same applies below 圖 1 GUI12菌株分泌的VOCs在不同時(shí)間對(duì)灰葡萄孢的抑制情況 Fig 1 The inhibitory effects of VOCs produced by GUI12 strain on Botrytis cinerea at different time poin 42 第 8 期 石精濤等 拮抗灰葡萄孢木霉菌的鑒定及其防病作用 要 形態(tài)的改變會(huì)導(dǎo)致菌體無法正常增殖 識(shí)別 以及結(jié)合 而結(jié)構(gòu)的改變則會(huì)導(dǎo)致菌絲功能 喪失 將與GUI12菌株對(duì)扣培養(yǎng)及正常培養(yǎng)3 d的 灰葡萄孢分別在掃描電鏡 SEM 和透射電鏡 TEM 下觀察菌體表面形態(tài)以及結(jié)構(gòu)變化 結(jié)果 見圖4 由圖4 a 可見 正常培養(yǎng)的灰葡萄孢菌絲 形態(tài)正常 呈現(xiàn)出光滑且飽滿圓潤的狀態(tài) 細(xì)胞結(jié) 構(gòu)正常 細(xì)胞壁及細(xì)胞膜完整 細(xì)胞核 線粒體 液 泡均清晰可見 由圖4 b 可見 與GUI12對(duì)扣培 養(yǎng)的灰葡萄孢菌絲呈現(xiàn)出變粗 褶皺 塌陷的現(xiàn) 象 其細(xì)胞核 線粒體及液泡等細(xì)胞器呈現(xiàn)出輪廓 模糊 甚至溶解和消失的現(xiàn)象 結(jié)果表明 GUI12 菌株產(chǎn)生的VOCs可能引起細(xì)胞器損傷 最終導(dǎo) 圖 4 GUI菌株產(chǎn)VOCs對(duì)灰葡萄孢0201菌絲超微結(jié)構(gòu)的影響 Fig 4 Effect of VOCs produced by GUI12 strain on the ultrastructure of B cinerea 0201 mycelium a 為PDA培養(yǎng)基上GUI12菌株菌落的正面形態(tài) b 為GUI12菌株的分生孢子及分生孢子梗 c 為基于ITS基因序列采用 鄰接法構(gòu)建的GUI12菌株系統(tǒng)發(fā)育樹 a shows the top view of the colony morphology of the GUI12 strain on PDA medium b shows the conidia and conidiophores of the GUI12 strain c is the phylogenetic tree of the GUI12 strain constructed using the neighbor joining method based on the ITS gene sequence 圖 3 GUI12菌株鑒定 Fig 3 Identification of GUI12 strain 43 中 國 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 2025 年 第 30 卷 致菌體死亡 2 4 GUI12菌株產(chǎn)生的VOCs對(duì)葡萄灰霉病的防 效驗(yàn)證 GUI12菌株產(chǎn)生的VOCs對(duì)葡萄灰霉病的防治 效果見表1 可見 對(duì)照組病斑平均直徑為17 80 mm 經(jīng)GUI12菌株產(chǎn)生的VOCs處理后的葡萄果 實(shí)病斑平均直徑為8 27 mm 病斑擴(kuò)展相對(duì)緩慢 GUI12菌株產(chǎn)生的VOCs對(duì)葡萄灰霉病斑擴(kuò)展具有 一定的抑制作用 抑制率為53 56 2 5 GUI12菌株產(chǎn)生的 VOCs成分鑒定及活性 篩選 利用GC MS技術(shù)對(duì)培養(yǎng)3 d的GUI12菌株產(chǎn) 生的VOCs進(jìn)行成分分析 鑒定結(jié)果見表2 共鑒 定出19種VOCs 這些化合物包括酮類 醇類 烷烴 類 吡喃類 酯類 測(cè)定可購買到的GUI12菌株產(chǎn)生的12種 VOCs 乙酸異丁酯 2 3 丁二酮 丁酸乙酯 2 甲基 丁基乙酸酯 巴豆酸乙酯 2 甲基丁醇 異戊醇 惕各 酸乙酯 3 乙酰氧基丁酸乙酯 戊內(nèi)酯 苯甲酸乙 酯 苯乙醇 對(duì)灰葡萄孢的抑制率結(jié)果見圖5 a 可見 12種VOCs在100 L L的濃度下均能夠不 同程度地抑制灰葡萄孢菌落擴(kuò)展 其中2 3 丁二酮 及苯乙醇對(duì)灰葡萄孢的抑制效果較為顯著 抑制率 均為100 不同濃度的2 3 丁二酮及苯乙醇對(duì)灰葡萄孢 抑制率結(jié)果見圖5 b 及圖5 c 由圖5 b 可見2 3 丁二酮對(duì)灰葡萄孢的毒力回歸方程為 y 4 84x 22 47 EC 50 為14 97 L L 由圖5 c 可 見苯乙醇對(duì)灰葡萄孢的毒力回歸方程為 y 0 97x 3 24 其EC 50 為48 21 L L 2 6 2 3 丁二酮及苯乙醇對(duì)葡萄灰霉病的防效 驗(yàn)證 2 3 丁二酮和苯乙醇對(duì)葡萄灰霉病的防治效果 見表3 可見 接菌培養(yǎng)3 d后 對(duì)照組葡萄的病斑 發(fā)病率為100 00 病斑直徑為18 20 mm 與之 相比 2 3 丁二酮在EC 50 及2 EC 50 濃度下均未發(fā) 病 且無病斑出現(xiàn) 對(duì)葡萄灰霉病斑擴(kuò)展的抑制率 為100 00 苯乙醇在EC 50 及2 EC 50 濃度下的發(fā) 病率分別為86 67 0 00 病斑直徑分別為 4 73 mm 0 00 mm 對(duì)葡萄灰霉病斑擴(kuò)展的抑制率 分別為74 00 100 00 3 討 論 生防菌及其代謝產(chǎn)物等生物防治劑的開發(fā)和 應(yīng)用 為植物病原真菌的生物防治提供了一種有前 途的替代方案 本研究發(fā)現(xiàn)檸檬綠木霉GUI12菌 株產(chǎn)生的VOCs能夠有效抑制灰葡萄孢的菌絲生 長 抑制效果并未隨著時(shí)間的延長而減弱 目前已 報(bào)道木霉菌屬的一些物種產(chǎn)生的VOCs具有抗真菌 活性 如康寧木霉 T koningii T2 15 哈茨木霉 T harzianum 16 哈馬圖木霉 T hamatum 17 棘孢木霉 T asperellum T1 18 等產(chǎn)生的VOCs能 夠抑制植物病原真菌菌絲的體外生長 孢子形成 導(dǎo)致病原菌菌絲畸形 頂端膨大 分支增多 細(xì)胞質(zhì) 外滲等 Hu等 16 發(fā)現(xiàn)哈茨木霉VOCs處理會(huì)導(dǎo)致 馬鈴薯晚疫病菌 Phytophthora infestans 細(xì)胞壁和 細(xì)胞膜變形 塌陷以及細(xì)胞器的退化并導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì) 材料泄漏 本研究中GUI12菌株產(chǎn)生的VOCs能 夠?qū)е禄移咸焰叩木z呈現(xiàn)出變粗 褶皺 塌陷的 現(xiàn)象 并使包括細(xì)胞核 線粒體及液泡等在內(nèi)的細(xì) 胞器呈現(xiàn)出模糊現(xiàn)象 且能夠抑制葡萄果實(shí)上灰霉 病病斑的生長 對(duì)葡萄灰霉病斑擴(kuò)展的抑制率為 53 56 具有生物活性的微生物VOCs由于不同的化學(xué) 基團(tuán)被分為烯烴 醇類 酮類 苯類 吡嗪類 硫化物 和萜烯類等 19 Abdenaceur 等 20 研究發(fā)現(xiàn)粗糙木 霉 T asperellum 產(chǎn)生的主要VOCs異丁醇 3 戊 酮和 1 戊烯 3 醇對(duì)大麗輪枝菌 Verticillium dahliae 表現(xiàn)出明顯的抑菌活性 Rao 21 等報(bào)道橘綠 木霉 T atroviride LZ42產(chǎn)生的2 庚酮 2 戊基呋 喃及 欖香烯能有效抑制尖孢鐮刀菌 Fusarium oxysporum 對(duì)GUI12菌株產(chǎn)生的VOCs進(jìn)行分 析 共鑒定出包括酮類 醇類 烷烴類 吡喃類 酯類 在內(nèi)的19種VOCs 與復(fù)雜的VOCs組分相比 純 化合物具有清晰的結(jié)構(gòu)特性 易于生產(chǎn)和合成 未 來可能具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值 22 本研究依據(jù)GUI12 表1 GUI12菌株分泌的VOCs對(duì)葡萄灰霉病的防治效果 Table 1 Control effect of VOCs secreted by GUI12 strain on grape gray mold 處理 Treatment CK VOCs 病斑直徑 mm Lesion diameter 17 80 8 27 發(fā)病率 Incidence 100 00 100 00 抑制率 Inhibition rate 53 56 44 第 8 期 石精濤等 拮抗灰葡萄孢木霉菌的鑒定及其防病作用 表2 氣相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)GUI12菌株產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)化合物 Table 2 Detection of VOCs produced by GUI12 strain by GC MS 峰編號(hào) Peak number 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 保留時(shí)間 min Retention time 10 705 10 132 11 139 12 101 12 703 13 640 14 161 14 190 14 988 16 074 16 500 18 418 19 678 20 449 21 406 21 710 22 065 22 249 25 423 名稱 Name 乙酸異丁酯 Isobutyl acetate 2 3 丁二酮 2 3 butanedione 丁酸乙酯 Ethyl butyrate 異丁醇 2 methyl 1 propanol 2 甲基丁基乙酸酯 2 methylbutyl acetate 巴豆酸乙酯 Ethyl crotonate 2 甲基丁醇 2 methylbutanol 異戊醇 3 methylbutanoI 惕各酸乙酯 Ethyl tiglate 3 羥基 2 丁酮 3 hydroxy 2 oxobutane 乙酸3 辛酯 3 octylacetat 1 庚醇 1 heptanol 3 羥基丁酸乙酯 Ethyl 3 hydroxybutyrate 3 乙酰氧基丁酸乙酯 Ethyl 3 acetoxybutyrate 2 糠酸乙酯 Ethyl 2 furoate 戊內(nèi)酯 valerolactone 丁內(nèi)酯 butyrolactone 苯甲酸乙酯 Ethyl benzoate 苯乙醇 Phenylethyl alcohol 分子式 Molecular formula C 6 H 12 O 2 C 4 H 6 O 2 C 6 H 12 O 2 C 4 H 10 O C 7 H 14 O 2 C 6 H 10 O 2 C 5 H 12 O C 5 H 12 O C 7 H 12 O 2 C 4 H 8 O 2 C 10 H 20 O 2 C 7 H 16 O C 6 H 12 O 3 C 8 H 14 O 4 C 7 H 8 O 3 C 5 H 8 O 2 C 4 H 6 O 2 C 9 H 10 O 2 C 8 H 10 O CAS編號(hào) CAS number 110 19 0 431 03 8 105 54 4 78