鮮切茄子褐變研究進展 周亞茹 null null 肖 凱 null 張愛冬 null 譚 楓 null null 吳雪霞 null nullnull nullnull上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所 上海 nullnullnullnullnullnull nullnull上海海洋大學(xué) 上海 nullnullnullnullnullnull 摘要 鮮切茄子作為一種新型食品工業(yè)產(chǎn)品而深受消費者喜愛 但茄子切片處理很快就會褐變 這會對其口感 營養(yǎng)和商業(yè)價值產(chǎn)生負 面影響 酶促褐變是茄子果實在收獲 運輸 儲存和加工過程中褐變發(fā)生的主要形式 這一過程主要是由多酚氧化酶引起的 綜述了鮮 切茄子褐變的影響因素 褐變分子機制以及褐變控制措施 以期為解決茄子果實褐變研究提供參考 關(guān)鍵詞 茄子 鮮切 褐變 中圖分類號 nullnullnullnullnullnullnull 文獻標(biāo)識碼 null 文章編號 nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull doi nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 開放科學(xué) 資源服務(wù) 標(biāo)識碼 OSID esearch Progress on Browning of Fresh cut Eggplant ZHOU Ya ru 1 2 XIAO Kai 1 ZHANG Ai dong 1 et al nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull Abstract nullnull null nullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnull null nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull Key words nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull 基金項目 國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目 nullnullnullnullnullnullnull 作者簡介 周亞茹 nullnullnullnull 女 安徽合肥人 碩士研究生 研究方向 分子植物育種 null 通信作者 研究員 博士 從事茄子分子 遺傳育種研究 收稿日期 nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 茄子 Solanum melongena nullnull 是世界上重要的大宗蔬菜 種植面積大 營養(yǎng)價值豐富 年供應(yīng)量穩(wěn)定 null 鮮切果蔬是 新鮮果蔬經(jīng)一系列工序制成的不影響其自然品質(zhì)的一種成 品 作為一種新興的輕度加工產(chǎn)品 以食用方便而備受消費 者歡迎 鮮切果蔬既保持了果蔬原有的新鮮狀態(tài) 又經(jīng)過加 工使產(chǎn)品清潔衛(wèi)生 逐漸成為果蔬消費的主流 被認為是今 后果蔬業(yè)發(fā)展的方向之一 null 鮮切茄子由于受到人為鮮切 加工造成的機械損傷 誘導(dǎo)果蔬組織發(fā)生加速代謝 酶促褐 變以及品質(zhì)劣變等變化 1 褐變 食品在加工過程中或長期貯存于濕熱環(huán)境下 其所含的 氨基化合物如蛋白質(zhì) 氨基酸及醛 酮等與還原糖相遇 經(jīng)過 一系列反應(yīng)生成褐色聚合物的現(xiàn)象稱為褐變反應(yīng) 簡稱褐 變 褐變是食品中一種常見的變色反應(yīng) 這可能會對食品質(zhì) 量產(chǎn)生積極或消極的影響 null 根據(jù)褐變機理的不同 食品中 的褐變反應(yīng)一般分為酶促褐變和非酶促褐變 非酶褐變反 應(yīng)通過涉及食品中單一化合物或多種成分的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生 棕色物質(zhì) 而不涉及任何酶 非酶褐變反應(yīng)包括美拉德反 應(yīng) 焦糖化和抗壞血酸氧化 null 并且由于食物復(fù)雜的組成成 分 這些反應(yīng)大多是以組合反應(yīng)而不是單獨反應(yīng)發(fā)生的 與 非酶促褐變不同 酶促褐變反應(yīng)涉及食品中存在的多酚氧化 酶 nullnullnull 的作用 主要發(fā)生在果蔬產(chǎn)品的收獲 運輸 儲存和 加工過程中 null 在食品加工過程中 機械和物理刺激包括剝 落 切割 切片 切粒和撕碎 以及儲存期間的劇烈溫度變化 可導(dǎo)致果蔬產(chǎn)品的物理組織損傷 當(dāng)組織受損時 葉綠體破 裂釋放多酚氧化酶 nullnullnull 與液泡破裂釋放的酚類化合物接 觸 null nullnullnull 的活性中心由 null 個銅原子組成 在分子氧存在下 該酶催化 null 種不同的反應(yīng) 單酚的羥基化 單酚酶活性 和鄰 二酚的氧化成鄰苯二酚 二酚酶活性 在這個反應(yīng)之后 對 苯二酚進行非酶聚合 形成一種相對不溶性的棕色色素 稱 為黑素 null 2 鮮切茄子褐變影響因素 果蔬褐變研究歷史悠久 鮮切果蔬的品質(zhì)變化主要集中 在呼吸速率加快 乙烯合成增加 水分流失增大 微生物侵染 和酶促褐變五個方面 null 2 1 非酶促褐變 由于加工機械損傷引起組織細胞中線粒 體結(jié)構(gòu)改變以及數(shù)量增加 導(dǎo)致線粒體有氧呼吸增強 另外 果蔬阻滯在遭受去皮切分等機械損傷后 會引起乙烯合成增 加 乙烯合成增加會產(chǎn)生許多不良的生理效應(yīng) 如傷呼吸 酶 促褐變和次生代謝等 加速鮮切果蔬器官組織的老化 機 械損傷也會增大果蔬水分流失 使?fàn)I養(yǎng)成分流失 并且因為 汁水的流出極易滋生細菌 2 2 酶促褐變 酶促褐變是果蔬加工中普遍存在的一種現(xiàn) 象 目前較為大眾所接受的理論是酚 null 酚酶區(qū)域化分布學(xué) 說 null 在蘋果 null 南果梨 nullnull 絲瓜 nullnull 和馬鈴薯 nullnull 等水果和 蔬菜中 影響褐變的因素已經(jīng)得到了廣泛的研究 鮮切產(chǎn)品 的酶促褐變通常被認為是一個多因素的過程 nullnullnull 在植物體 中參與酶促褐變反應(yīng)的酶類主要是由多酚氧化酶 nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnull 多基因家族編碼的多酚氧化酶 null 當(dāng)果蔬 受到機械破壞或處于不利環(huán)境中時 果蔬內(nèi)部的多酚會在多 酚氧化酶 nullnullnull 的催化作用下發(fā)生氧化 變成褐色 null 這需 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnull null nullnullnullnullnull nullnull 要氧氣 酶和底物的參與 許多其他酶 包括過氧化物酶 nullnullnull 苯丙氨酸解氨酶 nullnullnull 超氧化物歧化酶 nullnullnull 和 過氧化氫酶 nullnullnull 也參與了誘導(dǎo)或抑制鮮切食品酶促褐變 的復(fù)雜過程 nullnullnullnullnull 當(dāng)細胞遭受逆境時 活性氧清除酶如超氧 化物歧化酶 nullnullnull 過氧化氫酶 nullnullnull 和抗壞血酸過氧化物 酶 nullnullnull 的活性降低 從而降低了水果清除自由基的能力 導(dǎo)致活性氧 nullnullnull 的積累 nullnull 過氧化物酶 nullnullnull 和脂氧合 酶 nullnullnull 也是導(dǎo)致水果和蔬菜褐變的關(guān)鍵酶 健康水果中 的酚類酶和酚類物質(zhì)在細胞中呈區(qū)域性分布 當(dāng)細胞完整 時 它們不能接觸 也不會發(fā)生褐變反應(yīng) nullnull 3 鮮切茄子褐變分子機制 3 1 酚類底物和多酚氧化酶 PPO 的釋放 酚類物質(zhì)是果 蔬褐變的底物 水果和蔬菜在切割時細胞的結(jié)構(gòu)會被破壞 導(dǎo)致 nullnullnull 及其酚類底物的釋放 nullnull nullnullnull 在水果和蔬菜切面 上的氧氣存在下氧化酚類物質(zhì) 產(chǎn)生苯二酚 再自動聚合形 成棕色的色素 nullnull 酚類物質(zhì)主要通過苯丙氨酸代謝途徑合 成 苯丙氨酸解氨酶 nullnullnull 是苯丙烷代謝途徑的起始酶 nullnull 此外 酶促褐變主要是在多酚氧化酶 nullnullnull 的催化下將酚轉(zhuǎn) 化為鄰苯二酚的結(jié)果 nullnull 有研究結(jié)果表明 增加茄子果肉 中酚酸的含量 特別是綠原酸的含量 會增加茄子果肉對褐 變的敏感性 nullnull 在新鮮茄子中 褐變也歸因于酚類含量和 nullnullnull 比活性的影響 而總酚含量在貯藏水果的褐變中起著顯 著的作用 nullnull nullnullnull 等 nullnull 研究發(fā)現(xiàn) 隨著褐變程度的增加 果 實的丙二醛含量和 null nullnull 的產(chǎn)生速率逐漸增加 而抗氧化能力 逐漸降低并且切傷顯著激活苯丙氨酸解氨酶 nullnullnull 的表 達 從而誘導(dǎo)酚酸的積累 nullnullnull 基因顯著上調(diào) 激活了多酚 氧化酶的活性 這些結(jié)果都表明 綠原酸氧化為綠原酚導(dǎo)致 了茄子褐變的發(fā)生 說明綠原酸是鮮切茄子褐變的主要 底物 有研究發(fā)現(xiàn) 茄子在鮮切后 nullnullnull nullnullnull 和 nullnullnull null 種酶在 鮮切前期有明顯升高 鮮切后 nullnullnull nullnullnull nullnullnull 活性隨時間增 加而增加 與 null nullnullnull 相比 nullnullnull nullnullnull 時分別增加了 nullnullnullnullnull nullnullnull nullnull和 nullnullnullnullnull nullnull 因此 明確褐變相關(guān)酶的功能和作用方 式是研究鮮切褐變分子機制的關(guān)鍵 3 2 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控褐變 近年來 隨著測序技術(shù)的興起和發(fā) 展 研究者們挖掘出了許多與鮮切果蔬褐變相關(guān)的基因 nullnullnull 等 nullnull 研究發(fā)現(xiàn) 在易褐變和不易褐變品種鮮切材料中轉(zhuǎn) 錄組中有 nullnull 個顯著差異表達基因和 nullnullnull 個顯著差異表達的 轉(zhuǎn)錄因子 轉(zhuǎn)錄因子 nullnull 已被證明在各種系統(tǒng)中增加基因 表達 轉(zhuǎn)錄因子代表一組特定的蛋白質(zhì) 它們調(diào)節(jié)植物的逆 境和信號傳遞 并與下游基因啟動子中的順式作用元件結(jié) 合 以調(diào)節(jié)基因的表達 nullnullnullnullnull nullnullnullnull 等 nullnull 通過全基因組分析 在茄子中鑒定出 nullnull 個 nullnullnullnull 轉(zhuǎn)錄因子 nullnullnullnullnullnull 等 nullnull 已在茄 子的 nullnullnullnull 基因中檢測到與 nullnullnull 轉(zhuǎn)錄因子相互作用的順式 作用元件 多酚氧化酶和過氧化物酶是紅茶發(fā)酵過程中產(chǎn) 生色素的關(guān)鍵酶 nullnullnull 催化茶葉中兒茶素氧化成橙色茶黃素 和紅棕色茶黃素 并催化香氣前體的酶偶聯(lián)氧化 nullnullnullnullnullnullnull 激活了 nullnullnullnullnullnull 啟動子的轉(zhuǎn)錄 并可能通過激活 nullnullnullnullnullnull 來 調(diào)節(jié)茶樹中 nullnullnull 的活性 nullnull 4 鮮切茄子褐變控制措施 由于 nullnullnull 活性是控制酶促褐變的關(guān)鍵 因此所有降低 nullnullnull 活性的因素 包括減少內(nèi)源酚類化合物的種類和數(shù)量 降低氧氣的含量和 nullnull 都是為了防止酶促褐變 常用的防 止酶褐變的方法有物理方法 化學(xué)方法和基因工程改良 方法 nullnull 4 1 物理方法 控制酶促褐變的物理方法包括熱處理 防止 氧氣暴露 使用低溫和輻射 熱處理很容易抑制酶的活性 因為酶是由蛋白質(zhì)組成的很容易變性 nullnullnullnullnull 葡萄酒釀造過 程中 通常在釀造之前 nullnull null下加熱 null nullnullnull 來抑制酶褐變 nullnull 趙云峰等 nullnull 發(fā)現(xiàn) 通過熱處理的物理方法可有效降低茄子 果實 nullnullnull nullnullnull 和 nullnullnull 的活性 抑制酚類物質(zhì)積累的下降 控制細胞膜透性的升高 維持細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性 限制胞 內(nèi)物質(zhì)的外滲 減少酚類物質(zhì)與其氧化酶的接觸機會 從而 減輕褐變的發(fā)生 呂運萍等 nullnull 通過比較不同褐變抑制劑對 鮮切茄子褐變的保鮮效果 發(fā)現(xiàn)用 nullnullnullnull食用鹽抑制鮮切茄 子褐變具有良好的效果 吳志霜等 nullnull 研究發(fā)現(xiàn) 加壓氬氣 nullnullnull nullnullnull 降低了鮮切蘋果的呼吸速率和乙烯產(chǎn)量 但其對 顏色和硬度產(chǎn)生了一些負面影響 當(dāng)加壓氬氣與抗壞血酸等 多種抗氧化劑聯(lián)合處理后 有效抑制了鮮切蘋果的褐變和軟 化 在 null null下將感官品質(zhì)保持了 nullnull null 鮮切菠蘿在 null null保存 情況下 經(jīng)過加壓氬 nullnull nullnullnull 處理貨架期為 null null 通過高壓氙 氣或氮氣 nullnull nullnullnull 處理后 貨架期可延長至 nullnull null nullnull 4 2 化學(xué)方法 抑制 nullnullnull 活性的化學(xué)方法包括酸化或使用 抗氧化劑 螯合劑或天然提取物進行還原 nullnullnull 的最適 nullnull 為 nullnullnull 當(dāng) nullnull 在 null 以下對 nullnullnull 表現(xiàn)出抑制作用 nullnull 檸檬 酸 抗壞血酸和谷胱甘肽等酸化劑可通過降低 nullnull 使 nullnullnull 失 活 還原劑硫酸鹽及其衍生物是 nullnullnull 的不可逆抑制劑 nullnull 抗氧化劑包括抗壞血酸 null null 半胱氨酸和 null null 己基間苯二酚 能 夠通過與中間體結(jié)合來防止黑色素的形成 nullnull 銅絡(luò)合劑 如檸檬酸和草酸 能夠通過與 nullnullnull 酶結(jié)構(gòu)中的金屬輔因子 結(jié)合來抑制 nullnullnull 活性 nullnull 王肽等 nullnull 研究了臭氧水處理對 鮮切茄子 nullnull null貯藏條件下品質(zhì)和生理的影響 結(jié)果發(fā)現(xiàn)臭 氧水處理相比于對照組可以顯著殺滅鮮切茄子表面微生物 臭氧水作用時間越長 殺菌越有效 在臭氧水處理 null nullnullnull對鮮 切茄子保鮮效果最佳 此外臭氧水處理可以有效維持鮮切 茄子的 L null 值 抑制多酚氧化酶的活性 nullnull nullnull甲基環(huán)丙烯 null nullnullnullnull 是一種有效的乙烯效應(yīng)抑制劑 null nullnullnullnull 處理能有效 抑制鮮切茄子呼吸強度的上升 維持產(chǎn)品硬度 可滴定酸含 量 降低產(chǎn)品失重率及褐變指數(shù) 延長鮮切茄子保鮮期 nullnull 外源鈣通過調(diào)節(jié)苯酚代謝和增強氧化酶系統(tǒng)來延緩茄子果 實褐變 nullnull 4 3 基因編輯 nullnullnullnullnullnull 等 nullnull 采用基于 nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 的誘變 方法 敲除了茄子果實鮮切后高轉(zhuǎn)錄水平的 null 個目標(biāo) nullnullnull 基 因 Smelnullnullnullnull Smelnullnullnullnull 和 Smelnullnullnullnull 采用優(yōu)化的茄子子 葉轉(zhuǎn)化方法 結(jié)果經(jīng)過編輯的 nullnull 和 nullnull 代茄子果實表現(xiàn)出典 型的棕色 這是酚氧化作用的結(jié)果 nullnullnullnull 卷 null 期 周亞茹等 鮮切茄子褐變研究進展 5 展望 茄子除了具有很高的經(jīng)濟價值之外 還具有較高的營養(yǎng) 價值和藥用價值 目前 茄子的加工產(chǎn)品較少 僅有茄子干 和茄子醬兩類 主要用途為烹飪 在此背景下 具有新鮮 營 養(yǎng) 方便和無公害等優(yōu)點的鮮切茄子成為一個新的研究方 向 鮮切茄子的應(yīng)用不僅可以進一步拓展茄子的加工產(chǎn)品種 類 而且可為中央廚房提供茄子菜肴的統(tǒng)一配菜 目前鮮有 關(guān)于鮮切茄子的褐變機理的研究 僅限于基因表達以及生理 水平的分析 其內(nèi)部的分子機制還沒有深入的研究報道 闡 明茄子褐變機理 探索抑制褐變發(fā)生的調(diào)控機制 選育抗褐 變的茄子新品種從根本上解決茄子果實褐變的問題具有重 要意義 參考文獻 null nullnullnullnullnull null nullnullnullnullnullnull null nullnullnullnull null null nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnull Solanum melongena nullnull nullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull null nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull null null null nullnullnullnull null 趙曼如 胡文忠 于皎雪 等 null乙醇對鮮切果蔬抗氧化活性及品質(zhì)變化影 響的研究進展 null null現(xiàn)代園藝 nullnullnullnull nullnull null nullnullnull nullnull null nullnullnullnull null null nullnullnullnull null null nullnullnull null nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull null nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnull nullnull nullnullnullnullnull null nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull null nullnullnullnullnullnullnullnull null nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull null nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull null nullnullnullnullnullnullnull null nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull null null nullnullnullnullnullnull null nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull null nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnull null nullnullnullnullnullnullnullnull null nullnullnullnullnull null null nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnull null nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnull nullnull null nullnullnullnullnullnullnullnull null nullnullnullnullnullnullnullnull null null nullnullnullnullnullnull null null nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull null null nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull null nullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull null nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnull null nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull null null nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull null null nullnull nullnull nullnullnullnull null null nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull null nullnullnullnullnullnull null nullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnull null nullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull null nullnullnullnull null null nullnullnull null null nullnullnull null nullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnull null nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnull null nullnullnull nullnull nullnullnull null null nullnullnullnull null null nullnullnullnullnull null nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnulln