現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技 2023年第2期 植物保護(hù)學(xué) 水草組培中常見污染菌的初步鑒定分析 李偉杰 朱孟乾 曹廣龍 張一林 周 蓉 孫驗玲 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島 266237 摘要 本研究以紅絲青葉為例 對其組培過程中出現(xiàn)的典型污染菌進(jìn)行分離與鑒定 并通過系統(tǒng)進(jìn)化樹明 確了各菌種的進(jìn)化關(guān)系 結(jié)果表明 在紅絲青葉組培過程中出現(xiàn)的污染菌種類繁多 包含細(xì)菌和真菌 細(xì)菌歸類 于芽孢桿菌屬 腸桿菌屬 泛菌屬 科薩克氏菌屬 劍菌屬和克雷伯菌屬 真菌歸類于寡營養(yǎng)叢孢霉屬 枝孢霉屬 和隔孢伏革菌屬 本研究結(jié)果可為后期組培培養(yǎng)基的優(yōu)化及污染菌的防治提供參考 關(guān)鍵詞 紅絲青葉 組織培養(yǎng) 細(xì)菌 真菌 污染 中圖分類號 S859 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007 5739 2023 02 0069 06 DOI 10 3969 j issn 1007 5739 2023 02 017 開放科學(xué) 資源服務(wù) 標(biāo)識碼 OSID Preliminary Identification and Analysis of Common Pollutant Bacteria in Waterweed Tissue Culture LI Weijie ZHU Mengqian CAO Guanglong ZHANG Yilin ZHOU Rong SUN Yanling School of Marine Science and Engineering Qingdao Agricultural University Qingdao Shandong 266237 Abstract In this study the typical pollutant bacteria in the process of tissue culture of Hygrophila polysperma were isolated and identified and the evolutionary relationship of each strain was clarified through the phylogenetic tree The results showed that there were a wide variety of pollutant bacteria in the process of tissue culture including bacteria and fungi The bacteria belonged to six genera Bacillus Enterobacter Pantoea Kosakonia Ensifer and Klebsiella the fungi belonged to three genera Plectosphaerella Cladosporium and Peniophora The results provide references for the optimi zation of tissue culture medium and the prevention and control of pollutant bacteria Keywords Hygrophila polysperma tissue culture bacterium fungus pollution 水生草本植物不僅具有重要的觀賞價值 還具 有重要的藥用價值及生態(tài)價值 1 7 近年來 水草造景 藝術(shù)在國內(nèi)外風(fēng)行 同時我國每年也進(jìn)出口大量的 水草 運用植物組織培養(yǎng)技術(shù)可以節(jié)省大量生產(chǎn)成 本 雖然植物組織培養(yǎng)的理論研究已非常精深 但在 許多技術(shù)研究領(lǐng)域仍存在空白 如培養(yǎng)過程中難以 避免的污染菌問題 一旦污染菌大量繁殖 將導(dǎo)致整 個培養(yǎng)過程失敗 8 10 在陸生植物組織培養(yǎng)過程中 培養(yǎng)基被雜菌污染問題普遍 水草亦是如此 目前 水草組織培養(yǎng)研究報道較少 水草相較于陸地植物 根系欠發(fā)達(dá) 組培難度更高 且培養(yǎng)基更容易出現(xiàn)污 染菌 上述問題在小水榕 11 雪花草 12 小圓葉和葉底 紅 13 等水草的組織培養(yǎng)中已有相關(guān)報道 之前有研 究表明 陸生植物組培中發(fā)現(xiàn)主要污染菌有細(xì)菌和 真菌2種 其中細(xì)菌主要有芽孢桿菌屬 假單胞菌屬 14 真菌主要有芽枝霉屬 曲霉屬 青霉屬和酵母 但 是關(guān)于水草組培過程中污染菌的種類目前尚不清 楚 紅絲青葉 Hygrophila polysperma 是常見的水草 之一 屬于爵床科有莖類水草 原產(chǎn)于東南亞 是青 葉草的改良品種 其水上草外觀與青葉草相似 但葉 脈明顯 葉色翠綠 有披針形十字對生葉 水中草的 葉型較為狹長 有明顯的白色葉脈 強(qiáng)光下葉片呈粉 基金項目 國家自然科學(xué)基金青年基金 牙鲆 miR 7133 和 PC 3p 9227 調(diào)控 lamp2 在抗海豚鏈球菌侵染中 的作用機(jī)理研究 31902408 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)博 士啟動基金 海豚鏈球菌感染牙鲆的早晚期蛋白 譜解析 1120035 通信作者 收稿日期 2022 04 03 69 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技 2023年第2期植物保護(hù)學(xué) 紅色 非常漂亮 紅絲青葉具有紅色伴白色斑紋的葉 片 栽培容易 廣受歡迎 市場需求量大 培養(yǎng)基中出 現(xiàn)污染菌是導(dǎo)致該水草組織培養(yǎng)失敗的主要原因 但有關(guān)污染菌的研究尚未見報道 基于此 本研究 以紅絲青葉為研究對象 針對水草組培過程中出現(xiàn) 的典型污染菌進(jìn)行分離 純化和種類鑒定 并明確各 菌種的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系 以為后期紅絲青葉組織培養(yǎng) 的培養(yǎng)基優(yōu)化及組培苗批量化生產(chǎn)提供參考 1 材料與方法 1 1 試驗材料 供試材料為紅絲青葉 購于山東省濰坊市水草 水美超市 水族箱設(shè)備購于青島市市北區(qū)鹿疆造景 有限公司 培養(yǎng)基有MS培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基 試驗試劑包括 6 KT 激動素 6 糠氨基嘌呤 IBA 3 吲哚丁酸 活性炭 蔗糖 瓊脂粉 真菌 DNA 提取試劑盒 均購于北京索萊寶科技有限公司 16S rDNA 通用引物 2 Taq PCR Master Mix 均由青島睿 博興科生物技術(shù)有限公司提供 1 2 試驗方法 1 2 1 菌株形態(tài)觀察與分離 純化 將紅絲青葉莖段 置于超凈工作臺上 用75 乙醇浸泡30 s 2 NaClO 溶液浸泡 10 min 進(jìn)行表面消毒 用無菌水洗 3 6 次 后接種于MS培養(yǎng)基中 置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12 h 光照 12 h黑暗循環(huán) 溫度 26 1 濕度60 70 一定時間后 培養(yǎng)基表面或外植體周圍出現(xiàn)明顯的 黏液狀 渾濁水漬狀 油污狀和云霧狀痕跡 甚至出 現(xiàn)泡沫發(fā)酵狀 或干縮呈紅 黃 乳白等顏色 即為細(xì) 菌污染 這些細(xì)菌包括外植體本身所帶的內(nèi)生菌和 操作過程中引入的外來菌 選取出現(xiàn)頻繁的典型污 染菌苔分別于LB固體培養(yǎng)基接種劃線 并觀察單菌 落顏色和形態(tài) 挑取 2 份單菌落置于新鮮液體 LB 培養(yǎng)基中 26 振搖培養(yǎng)24 48 h 培養(yǎng)結(jié)束后 其中 一份再次劃線于 LB 培養(yǎng)基培養(yǎng) 置于 4 備用 另 一份用 15 甘油保存 置于 80 中長期保存 培養(yǎng)基表面或外植體周圍出現(xiàn)白色 黑色 綠色 等不同顏色的菌絲體 即為真菌污染 將菌落邊緣的 新鮮菌絲塊 直徑 6 mm 分別接種至新鮮的 PDA 培 養(yǎng)基上 于26 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 48 h 并觀察菌落 顏色和菌絲豐度 后置于4 保存?zhèn)溆?1 2 2 細(xì)菌的鑒定分析 將上述細(xì)菌進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng) 后 以菌液為模板進(jìn)行 16S rDNA 序列分析 15 16S rDNA通用引物 27F 上游引物 為5 AGAGTTTGA TCCTGGCTCA 3 1492R 下游引物 為5 GGTTAC CTTGTTACGACTT 3 PCR采用20 0 L反應(yīng)體系 2 Taq PCR Master Mix 10 0 L 上游引物 10 mol L 0 4 L 下游引物 10 mol L 0 4 L 模板 1 0 L 滅 菌雙蒸水補(bǔ)足至20 0 L PCR反應(yīng)條件為 95 預(yù) 變性5 min 95 變性 30 s 55 退火30 s 72 延伸 1 min 重復(fù) 30 個循環(huán) 72 延伸 5 min 16 保存 反應(yīng)結(jié)束后 取各反應(yīng)產(chǎn)物在 1 2 瓊脂糖凝膠上電 泳 在凝膠成像儀下觀察并拍照 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送青 島睿博興科生物技術(shù)有限公司完成測序 測序結(jié)果 采用 NCBI Blast 軟件進(jìn)行序列比對分析 選取相似 度最高 99 或 100 的序列作為菌種歸屬的判斷 標(biāo)準(zhǔn) 從 GenBank 中獲取與該菌株序列同源性較高 的部分菌株序列 采用MEGA 6 0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育 樹 進(jìn)一步判定細(xì)菌的種屬 1 2 3 真菌的鑒定分析 取分離純化后的菌絲體 然 后用真菌基因組 DNA 提取試劑盒 Solarbio 進(jìn)行菌 絲體基因組提取 進(jìn)而進(jìn)行真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間 隔區(qū) ITS 序列的測序比對分析 ITS引物 ITS F 上 游引物 為 5 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3 ITS R 下游引物 為5 TCCTCCGCTTATTGATATGC 3 PCR 配制體系和反應(yīng)條件同 1 2 2 反應(yīng)結(jié)束后 進(jìn) 行如上所述的測序和序列分析 1 2 4 進(jìn)化樹構(gòu)建 對于細(xì)菌 再次基于菌種的16S rDNA全序列 采用MEGA 6 0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 選用鄰接法建樹 進(jìn)化樹用 Bootstrap 法 1 000 次重 復(fù) 檢驗 通過進(jìn)化樹確定這些菌種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系 如上類似 對于真菌 再次基于菌種的 ITS 全序列進(jìn) 行建樹和分析 2 結(jié)果與分析 2 1 細(xì)菌的分離 純化及鑒定 將水草紅絲青葉的外植體 諸如莖節(jié) 莖段和葉 片 進(jìn)行消毒后 接種于水草組培的常見 MS 培養(yǎng)基 70 李偉杰等 水草組培中常見污染菌的初步鑒定分析 表1 污染源細(xì)菌的種類及菌落特征 樣品 菌落特征 細(xì)菌種類 A 1 白色 科薩克氏菌 Kosakonia oryzendophytica strain A 2 白色 泛菌屬菌株 Pantoea sp strain BHUJPCS 26 B 1 褶皺 解淀粉芽孢桿菌 Bacillus amyloliquefaciens strain BV2007 B 2 褶皺 暹羅芽孢桿菌 Bacillus siamensis strain C 1 黏液 枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis strain C 2 黏液 解淀粉芽孢桿菌 Bacillus amyloliquefaciens strain Y5 C 3 黏液 韓國芽孢桿菌 Bacillus koreensis strain C 4 黏液 阿氏芽孢桿菌 Bacillus aryabhattai strain B8W22T 35 D 水滴狀 劍菌屬 Ensifer sp strain BO 30 E 1 白色干燥 芽孢桿菌 Bacillus zanthoxyli strain E 2 白色干燥 阿氏芽孢桿菌 Bacillus aryabhattai strain WH6 F 1 黃色透明 陰溝腸桿菌 Enterobacter cloacae strain PR3 F 2 黃色 密歇根克雷伯菌 Klebsiella michiganensis strain F 3 黃色 腸桿菌屬 Enterobacter sp strain Glu2 F 4 黃色 腸桿菌屬 Enterobacter sp strain E24 a b c d e f 圖1 組培瓶的細(xì)菌污染形態(tài) 注 a為細(xì)菌A 白色 b為細(xì)菌B 褶皺狀 c為細(xì)菌C 黏液狀 d為細(xì)菌 D 水滴狀 e為細(xì)菌E 白色 干燥 f為細(xì)菌 F 黃色透明 中 置于光照培養(yǎng)箱約 14 d 后 培養(yǎng)瓶內(nèi)出現(xiàn)了常 見的菌類污染現(xiàn)象 從圖1可以看出 培養(yǎng)基上污染 菌菌落呈現(xiàn)出白色 褶皺狀 黏液狀 水滴狀 白色干 燥狀和黃色透明狀等不同形態(tài)特征 挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)后分別進(jìn)行生理生化檢測 和16S rDNA序列擴(kuò)增 得到各種不同菌株的序列 大 小約1 500 bp 如圖2 所示 進(jìn)一步進(jìn)行 16S rDNA 片段測序和進(jìn)化樹分析 經(jīng)鑒定 共分離獲得 15 種 細(xì)菌 表1 歸屬于6個屬 分別是泛菌屬 Pantoea 科薩克氏菌屬 Kosakonia 芽孢桿菌屬 Bacillus 劍 菌屬 Ensifer 腸桿菌屬 Enterobacter 和克雷伯菌屬 Klebsiella 注 M為DNA Maker 1 15 為各菌株的 16S rDNA核酸電泳條帶 M 12345678910 151413121 圖2 污染源細(xì)菌菌株的16S rDNA擴(kuò)增片段 71 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技 2023年第2期植物保護(hù)學(xué) MF083510 1 聚在一大枝 2種解淀粉芽孢桿菌聚在 不同的分枝 其中解淀粉芽孢桿菌BV2007 MT6136 61 1 與密歇根克雷伯菌 MT509914 1 聚在一枝 而 解淀粉芽孢桿菌 Y5 MT613660 1 與腸桿菌屬 Glu2 MK955362 1 聚在一枝 表明這 2 株解淀粉芽孢桿 菌可能朝著不同的方向進(jìn)化 由此可見 水草組培過 程中出現(xiàn)的常見污染菌種類多樣 且這些菌的系統(tǒng) 進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn) 同樣的 對分離獲得的3種污染源真菌進(jìn)行ITS 序列擴(kuò)增 分別得到各個菌種的 ITS 序列 對此進(jìn)行 發(fā)育樹構(gòu)建 因進(jìn)化樹的構(gòu)建序列要在3個以上 所 以通過 NCBI Blast 比對 選擇同源性較高的隔孢伏 革菌屬菌株 M161 一起構(gòu)建 圖6 結(jié)果顯示 隔孢 伏革菌屬菌株 M161 與隔孢伏革菌屬菌株 HM595 610 同源性非常高 聚為一枝 寡營養(yǎng)叢孢霉屬 MT 447499 和枝孢霉屬 MK387898 有一定同源性 聚 在一枝 兩者與隔孢伏革菌屬的菌株獨立分為兩枝 表明它們的親緣關(guān)系較遠(yuǎn) 可能經(jīng)歷了不同的進(jìn)化 歷程 圖6 3 結(jié)論與討論 本研究對水草紅絲青葉組培過程中出現(xiàn)的污染 菌進(jìn)行了分離 純化和初步鑒定 結(jié)果表明 常見污 染細(xì)菌主要有芽孢桿菌屬和腸桿菌屬 常見污染真 菌為枝孢霉菌 寡營養(yǎng)叢孢霉菌和隔孢伏革菌屬 這 為以后水草組培培養(yǎng)基的抗菌優(yōu)化和污染菌的防治 奠定了基礎(chǔ) 表2 污染源真菌的種類及菌落特征 樣品 菌落特征 真菌種類 G 白色羽毛 隔孢伏革菌屬 Peniophora sp strain H 乳白色黏液 寡營養(yǎng)叢孢霉菌 Plectosphaerella oligotrophica strain I 綠毛 枝孢霉菌 Cladosporium crousii strain 2 2 真菌的分離 純化及鑒定 由圖 3 可知 水草紅絲青葉的組培培養(yǎng)基中出 現(xiàn)了真菌污染 典型的真菌菌落呈現(xiàn)出白色羽毛狀 乳白色黏液狀和綠毛狀3種形態(tài)特征 挑取菌絲接 種到新鮮的PDA培養(yǎng)基中 進(jìn)行分離 純化 對真菌 進(jìn)行基因組 DNA 提取 擴(kuò)增其 ITS 序列條帶 大小 約400 bp 如圖4所示 并對其進(jìn)行測序分析 結(jié)果 獲得 3種真菌 歸屬于3個屬 分別是寡營養(yǎng)叢孢霉 屬 Plectosphaerella 枝孢霉屬 Cladosporium 和隔 孢伏革菌屬 Peniophora 表2 2 3 菌類的系統(tǒng)進(jìn)化分析 對分離獲得的多種污染源細(xì)菌進(jìn)行 16S rDNA 序列擴(kuò)增 分別得到各個菌種的 16S rDNA 序列 以 此采用鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 圖 5 結(jié)果表 明 細(xì)菌的芽孢桿菌屬 Bacillus 與其他屬均有聚在 一枝的現(xiàn)象 暹羅芽孢桿菌 MK382639 1 韓國芽 孢桿菌 MF079292 1 與阿氏芽孢桿菌 MN543785 1 序列同源性最高 三者聚在一枝 與腸桿菌屬 E24 a b c 圖3 組培瓶內(nèi)真菌污染的特征 注 a為真菌G 白色羽毛狀 b為真菌 H 乳白色黏液狀 c為真菌 I 綠毛狀 注 M 為DNA Maker 1 3為各菌株的 ITS核酸電泳條帶 圖4 污染源真菌菌株的 ITS擴(kuò)增片段 M 1 2 3 72 注 使用 MEGA 6 0 軟件中的鄰近法建樹 進(jìn)化樹采用Bootstrap 法 1 000次重復(fù) 檢驗 括號中的序號為 GenBank 登錄號 分枝上 的數(shù)字為Bootstrap 值 下同 線段0 50為核酸替換率 Bacillus aryabhattai strain B8W22T35 MN543785 1 89 26 Bacillus amyloliquefaciens strain BV2007 MT613661 1 Klebsiella michiganensis strain MT509914 1 Pantoea sp strain BHUJPCS 26 OK271409 1 Bacillus amyloliquefaciens strain Y5 MT613660 1 Enterobacter sp strain Glu2 MK955362 1 Bacillus zanthoxyli strain MT225770 1 Enterobacter cloacae strain PR3 KP226568 1 Bacillus subtilis strain MH748615 1 Ensifer sp strain BO 30 MH094652 1 Kosakonia oryzendophytica strain MW020337 1 Bacillus aryabhattai strain WH6 MK825204 1 Enterobacter sp strain E24 MF083510 1 Bacillus siamensis strain MK382639 1 Bacillus koreensis strain MF079292 1 38 66 25 99 60 47 52 74 100 100 0 50 圖5 基于細(xì)菌16S rDNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹 圖6 基于真菌ITS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹 Cladosporium crousii strain MK387898 Peniophora sp strain HM595610 Peniophora sp strain M161 Plectosphaerella oligotrophica strain MT447499 1 00 100 注 線段 1 00為核酸替換率 植物組織培養(yǎng)技術(shù)是一項可以將離體的植物組 織或細(xì)胞在體外培養(yǎng)基上再生出完整植株的創(chuàng)新性 應(yīng)用技術(shù) 能夠及時解決自然繁育困難或名貴植物 擴(kuò)繁問題 近十幾年來 該技術(shù)發(fā)展迅速 但仍存在 一些技術(shù)盲區(qū) 如在植物組織培養(yǎng)過程中 雜菌污染 情況十分普遍 水草組培亦不例外 早期研究表明 外植體培養(yǎng)2 3 d后 若培養(yǎng)基表面出現(xiàn)乳白 黃 粉 紅色的水 油 污狀 氣泡或干縮狀菌落 為外在細(xì)菌 的污染 外植體培養(yǎng)3 5 d后 并未有細(xì)菌污染 而是 在 10 d 以后才出現(xiàn) 則可能是內(nèi)生細(xì)菌引起的 16 17 本研究中 紅絲青葉外植體在培養(yǎng) 3 5 d 后 培養(yǎng)基 中出現(xiàn)了許多污染菌 推測外源細(xì)菌是導(dǎo)致紅絲青 葉組培培養(yǎng)基污染的主要原因 在培養(yǎng)10 d后 外植 體表面及周圍也出現(xiàn)了明顯的菌落 表明內(nèi)生菌也 是導(dǎo)致紅絲青葉組培培養(yǎng)基污染的重要因素之一 目前 水草組織培養(yǎng)污染方面的研究報道較少 而陸生植物的相關(guān)研究較多 其中芽孢桿菌屬細(xì)菌 是最常見的污染源 在化血膽 巨龍竹和鐵皮石斛等 的組培過程中均見報道 18 20 且為污染優(yōu)勢內(nèi)生菌 另外 被鑒定出的種類還有腸桿菌屬 假單胞菌屬 土壤桿菌屬 黃單胞菌屬 棒桿狀菌屬 沙雷氏菌屬 短小桿菌屬 葡萄球菌屬 歐文氏菌屬等 19 本研究 結(jié)果表明 水草紅絲青葉組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的污 染菌主要為芽孢桿菌屬 其次為腸桿菌屬 與陸生植 物的研究結(jié)果一致 不同的是 通過檢測發(fā)現(xiàn) 水草 組培過程中還出現(xiàn)了泛菌屬 劍菌屬 科薩克氏菌屬 和克雷伯菌屬的菌株 這些菌種在水草及陸生植物 組培過程中均尚未報道 細(xì)菌的16S rDNA序列具有保守性與高變性 該 序列的同源比對是新菌種鑒定時的重要分類標(biāo)準(zhǔn) 15 一般來說 當(dāng)供試菌種與已知菌種的16S rDNA序列 相似度低于97 時 可初步判斷該菌為一個新種 當(dāng) 相似度低于95 時 可初步判斷該菌為一個新屬 但 有研究表明 當(dāng)16S rDNA序列相似度高于97 閾值 甚至高達(dá)99 以上時 仍有可能出現(xiàn)新菌種 21 根據(jù) 其16S rDNA序列構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示 這些菌株多與 芽孢桿菌屬的菌株聚為一枝 表明這些菌屬與芽孢 桿菌屬具有不同程度的親緣關(guān)系 因此 今后需要結(jié) 合其他遺傳特征等進(jìn)一步確定這些菌種的歸屬問 題 其親緣進(jìn)化關(guān)系也值得后續(xù)深究 另外 這些菌 在水草組培過程中發(fā)揮促進(jìn)作用或抑制作用 還有 待進(jìn)一步研究探索 本研究中 在前期嘗試了 3 種序列片段進(jìn)行水 草組培中污染真菌的種類鑒定 其中 ITS 序列檢測 是最好用的 真菌的 ITS 序列是位于真菌核糖體 DNA rDNA 上 18S 和 28S 基因之間的區(qū)域片段 又 叫內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) 作為非編碼區(qū) 該區(qū)域承受的進(jìn)化 選擇壓力較小 在種間表現(xiàn)出較高的差異 已廣泛應(yīng) 用于真菌的分類鑒定 之前有研究報道 陸生植物組 培中真菌污染通常表現(xiàn)為培養(yǎng)容器內(nèi)出現(xiàn)白色 黑 色 綠色等不同顏色的菌絲塊 多為曲霉屬 毛霉屬 和青霉屬等菌種 14 這些真菌主要以菌絲形式傳播 22 方麗等 14 研究發(fā)現(xiàn) 組培中污染的真菌種類達(dá)18 個 之多 其中枝孢霉 黑曲霉 青霉為優(yōu)勢菌株 在水草 組培方面 本研究以紅絲青葉為例 結(jié)果顯示 組培 李偉杰等 水草組培中常見污染菌的初步鑒定分析 73 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技 2023年第2期植物保護(hù)學(xué) 污染的真菌主要是白毛狀的隔孢伏革菌屬 綠毛狀 的枝孢霉菌和乳白色的寡營養(yǎng)叢孢霉菌 經(jīng)比較可 知 綠色的枝孢霉菌是陸生植物和水生植物組培過 程中的共同常見污染真菌 而隔孢伏革菌和寡營養(yǎng) 叢孢霉菌是水草組培中出現(xiàn)的污染真菌 本研究采 用鄰接法構(gòu)建真菌菌株的 ITS 序列系統(tǒng)發(fā)育樹 結(jié) 果表明 水草組培污染真菌中的白毛狀的隔孢伏革 菌和乳白色的寡營養(yǎng)叢孢霉菌聚為一枝 均與綠色 的枝孢霉菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn) 與其菌種的表型特征相 一致 4 參考文獻(xiàn) 1 KARATAS M AASIM M 覶INAR A et al Adventitious shoot regeneration from leaf explant of dwarf hygro Hygrophila polysperma Roxb T Anderson J The Scientific World Journal 2013 2013 680425 2 HARGUINTEGUY C A Nickel lead and zinc accumulation and performance in relation to their use in phytoremediation ofmacrophytesMyriophyllumaquaticum and Egeria densa J Ecological Engineering 2015 82 512 516 3 REZANIA S Comprehensive review on phytotechnology heavy metals removal by diverse aquatic plants species from wastewater J Journal of Hazardous Materials 2016 318 587 599 4 CHANDANSHIVE V V RANE N R TAMBOLI A S et al Co plantation of aquatic macrophytes Typha angustifolia and Paspalum scrobiculatum for effective treatment of textile industry effluent J Journal of Hazardous Materials 2017 338 47 56 5 GU C G LI F F XIAO J B et al A novel submerged Rotala rotundifolia its growth characteristics and remediation po tential for eutrophic waters J Scientific Reports 2019 9 14855 6 EBRAHIMBABAIE P MEEINKUIRT W PICHTEL J Phy toremediation of engineered nanoparticles using aquatic plants mechanisms and practical feasibility J Journal of Environmental Sciences 2020 93 151 163 7 CESCHIN S BELLINI A SCALICI M Aquatic plants and ecotoxicological assessment in freshwater ecosystems a review J Environmental Science and Pollution Research 2021 28 5 4975 4988 8 曾文虎 肖輝海 郝小花 等 植物組織培養(yǎng)過程中的防 污染技術(shù) J 生物學(xué)通報 2012 47 12 52 55 9 溫璐華 武瑞娜 植物組培內(nèi)生菌污染的防治措施 J 防 護(hù)林科技 2020 2 83 85 10 白一葦 張世壯 王雁楠 等 植物組織培養(yǎng)中抗污染培 養(yǎng)基新配方的探索 J 中國農(nóng)學(xué)通報 2021 37 6 89 96 11 馬紹鋆 金青 聶凡 等 消毒時間和激素水平對小水榕 組織培養(yǎng)的影響 J 中國農(nóng)學(xué)通報 2007 23 11 90 94 12 徐世強(qiáng) 李宇峰 王繼華 觀賞水草雪花草的離體培養(yǎng) 與快速繁殖 J 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016 3 16 19 13 孫月芳 陸瑞菊 周潤梅 等 觀賞水草的離體培養(yǎng) J 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報 2004 20 2 17 19 14 方麗 王連平 茹水江 等 植物組培過程中污染微生物 種類及其季節(jié)性的變化 J 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報 2013 25 2 284 287 15 WU S LIU G JIN W et al Antibiofilm and anti infection of a marine bacterial exopolysaccharide against Pseudomo nas aeruginosa J Frontiers in Microbiology 2016 7 102 16 LEIFERT C RITCHIE J Y WAITES W M Contaminants of plant tissue and cell cultures J World Journal of Micro biology and Biotechnology 1991 7 4 452 469 17 LEVIN R STAV R ALPER Y et al In vitro multiplication in liquid culture of Syngonium contaminated with Bacillus spp and Rathayibacter tritici J Plant Cell Tissue and Organ Culture 1996 45 3 277 280 18 趙鳳 耿開友 胡昳 等 一株化血膽組織培養(yǎng)污染內(nèi)生 細(xì)菌的分離鑒定及防治 J 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報 2016 29 7 1707 1712 19 劉紹雄 王娟 王明月 等 巨龍竹組培苗污染優(yōu)勢內(nèi)生 菌的分離與鑒定 J 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報 2013 44 3 416 421 20 尹利方 陳澤斌 夏體淵 等 一株鐵皮石斛組織培養(yǎng)污 染內(nèi)生細(xì)菌的分離與鑒定 J 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報 2016 29 8 1982 1986 21 FOX G E WISOTZKEY J D JURTSHUK P How close is close 16S rRNA sequence identity may not be sufficient to guarantee species identity J International Journal of Sys tematic Bacteriology 1992 42 1 166 170 22 程逸宇 鄭建秋 遲卉 等 植物組織培養(yǎng)中真菌污染防 治方法研究 J 貴州科學(xué) 2006 24 3 40 43 74