農(nóng) 業(yè) 環(huán) 境 科 學 學 報 J o u r n a l o f A g r o E n v i r o n m e n t S c i e n c e 2 0 2 2 4 1 1 2 2 5 9 3 2 6 0 3 2 0 2 2 年 1 2 月 徐 菲 楊 凱 朱 龍 吉 等 土 壤 病 原 微 生 物 檢 測 技 術(shù) 研 究 進 展 J 農(nóng) 業(yè) 環(huán) 境 科 學 學 報 2 0 2 2 4 1 1 2 2 5 9 3 2 6 0 3 X U F Y A N G K Z H U L J e t a l A d v a n c e s i n t h e d e t e c t i o n t e c h n o l o g y o f p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s i n s o i l J J o u r n a l o f A g r o E n v i r o n m e n t S c i e n c e 2 0 2 2 4 1 1 2 2 5 9 3 2 6 0 3 開 放 科 學 O S I D 土 壤 病 原 微 生 物 檢 測 技 術(shù) 研 究 進 展 徐 菲 1 2 3 楊 凱 1 朱 龍 吉 1 林 文 芳 1 崔 麗 1 1 中 國 科 學 院 城 市 環(huán) 境 研 究 所 福 建 省 流 域 生 態(tài) 重 點 實 驗 室 福 建 廈 門 3 6 1 0 2 1 2 中 國 科 學 院 大 學 北 京 1 0 0 0 4 9 3 福 建 農(nóng) 林 大 學 資 源 與 環(huán) 境 學 院 福 州 3 5 0 0 0 2 A d v a n c e s i n t h e d e t e c t i o n t e c h n o l o g y o f p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s i n s o i l X U F e i 1 2 3 Y A N G K a i 1 Z H U L o n g j i 1 L I N W e n f a n g 1 C U I L i 1 1 F u j i a n K e y L a b o r a t o r y o f W a t e r s h e d E c o l o g y I n s t i t u t e o f U r b a n E n v i r o n m e n t C h i n e s e A c a d e m y o f S c i e n c e s X i a m e n 3 6 1 0 2 1 C h i n a 2 U n i v e r s i t y o f C h i n e s e A c a d e m y o f S c i e n c e s B e i j i n g 1 0 0 0 4 9 C h i n a 3 C o l l e g e o f R e s o u r c e s a n d E n v i r o n m e n t F u j i a n A g r i c u l t u r e a n d F o r e s t r y U n i v e r s i t y F u z h o u 3 5 0 0 0 2 C h i n a A b s t r a c t P a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s e g b a c t e r i a v i r u s e s a n d f u n g i a r e u b i q u i t o u s i n s o i l e n v i r o n m e n t s t h r e a t e n i n g g l o b a l p u b l i c h e a l t h T h e d e v e l o p m e n t o f a r a p i d d e t e c t i o n t e c h n o l o g y f o r e n v i r o n m e n t a l p a t h o g e n s i s o f g r e a t s i g n i f i c a n c e t o r e d u c e t h e s p r e a d o f p a t h o g e n s p r e v e n t a n d c o n t r o l i n f e c t i o u s d i s e a s e s a n d m a i n t a i n b i o s e c u r i t y T h i s a r t i c l e r e v i e w e d t h e r e c e n t l y d e v e l o p e d a n d s t a t e o f t h e a r t t e c h n i q u e s f o r d e t e c t i n g p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s i n c l u d i n g c h r o m o g e n i c c u l t i v a t i o n m a t r i x a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n t i m e o f f l i g h t m a s s s p e c t r o m e t r y m o l e c u l a r b i o l o g y t o o l s R a m a n s p e c t r o s c o p y f l o w c y t o m e t r y a n d b i o s e n s o r s A c o m p r e h e n s i v e o v e r v i e w a n d c o m p a r i s o n o f t h e p r i n c i p l e s a p p l i c a t i o n s a d v a n t a g e s a n d d i s a d v a n t a g e s o f t h e p r e s e n t e d t e c h n i q u e s w e r e s h o w n F i n a l l y w e p u t f o r w a r d i m p o r t a n t p e r s p e c t i v e s f o r t h e f u t u r e d e v e l o p m e n t o f r a p i d d e t e c t i o n m e t h o d s a i m i n g t o p r o m o t e r a p i d d i a g n o s i s o f s o i l p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s a n d p r o v i d e g u i d a n c e f o r t h e c o n t r o l o f b i o l o g i c a l r i s k s K e y w o r d s b i o s a f e t y a n d b i o s e c u r i t y s o i l p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m r a p i d d e t e c t i o n t e c h n i q u e m o l e c u l a r b i o l o g y t o o l R a m a n s p e c t r o s c o p y 收 稿 日 期 2 0 2 2 1 0 1 1 錄 用 日 期 2 0 2 2 1 1 0 3 作 者 簡 介 徐 菲 1 9 9 8 女 河 北 衡 水 人 碩 士 研 究 生 從 事 環(huán) 境 病 原 微 生 物 快 速 檢 測 研 究 E m a i l f x u i u e a c c n 楊 凱 與 徐 菲 同 等 貢 獻 通 信 作 者 崔 麗 E m a i l l c u i i u e a c c n 基 金 項 目 國 家 自 然 科 學 基 金 項 目 2 1 9 2 2 6 0 8 2 2 1 7 6 1 8 6 中 科 院 從 0 到 1 原 始 創(chuàng) 新 項 目 Z D B S L Y D Q C 0 2 7 福 建 省 自 然 科 學 基 金 項 目 2 0 2 2 J 0 5 0 9 5 P r o j e c t s u p p o r t e d T h e N a t i o n a l N a t u r a l S c i e n c e F o u n d a t i o n o f C h i n a 2 1 9 2 2 6 0 8 2 2 1 7 6 1 8 6 C h i n e s e A c a d e m y o f S c i e n c e s Z D B S L Y D Q C 0 2 7 T h e N a t u r a l S c i e n c e F o u n d a t i o n o f F u j i a n P r o v i n c e C h i n a 2 0 2 2 J 0 5 0 9 5 摘 要 病 原 微 生 物 如 細 菌 病 毒 真 菌 等 廣 泛 存 在 于 土 壤 環(huán) 境 中 其 嚴 重 威 脅 著 全 球 公 共 衛(wèi) 生 安 全 發(fā) 展 病 原 微 生 物 快 速 檢 測 技 術(shù) 對 于 減 少 病 原 菌 擴 散 傳 播 防 控 傳 染 性 疾 病 維 護 生 物 安 全 具 有 重 要 意 義 本 文 對 病 原 微 生 物 檢 測 技 術(shù) 的 最 新 研 究 進 展 進 行 了 綜 述 包 括 顯 色 培 養(yǎng) 技 術(shù) 基 質(zhì) 輔 助 激 光 解 吸 電 離 飛 行 時 間 質(zhì) 譜 分 子 生 物 學 技 術(shù) 拉 曼 光 譜 技 術(shù) 流 式 細 胞 技 術(shù) 和 生 物 傳 感 器 等 并 對 其 原 理 應 用 及 優(yōu) 缺 點 進 行 了 全 面 比 較 最 后 對 病 原 微 生 物 檢 測 技 術(shù) 的 未 來 發(fā) 展 提 出 展 望 旨 在 促 進 土 壤 環(huán) 境 病 原 微 生 物 的 快 速 檢 測 和 生 物 風 險 防 控 關(guān) 鍵 詞 生 物 安 全 土 壤 病 原 微 生 物 快 速 檢 測 技 術(shù) 分 子 生 物 學 技 術(shù) 拉 曼 光 譜 中 圖 分 類 號 R 1 2 4 文 獻 標 志 碼 A 文 章 編 號 1 6 7 2 2 0 4 3 2 0 2 2 1 2 2 5 9 3 1 1 d o i 1 0 1 1 6 5 4 j a e s 2 0 2 2 1 0 1 2農(nóng) 業(yè) 環(huán) 境 科 學 學 報 第 4 1 卷 第 1 2 期 隨 著 新 型 冠 狀 病 毒 肺 炎 C O V I D 1 9 疫 情 的 全 球 蔓 延 由 病 原 微 生 物 引 起 的 生 物 安 全 受 到 了 全 球 的 關(guān) 注 病 原 微 生 物 是 長 期 引 起 人 類 傳 染 性 疾 病 的 罪 魁 禍 首 嚴 重 威 脅 著 公 共 健 康 安 全 為 了 有 效 防 控 病 原 微 生 物 的 威 脅 生 物 安 全 被 提 到 了 國 家 安 全 戰(zhàn) 略 的 層 面 2 0 2 0 年 1 0 月 1 7 日 通 過 的 中 華 人 民 共 和 國 生 物 安 全 法 為 維 護 國 家 安 全 防 范 和 應 對 生 物 安 全 風 險 保障人民生命健康 提供了法律準則 另外 我國國家 衛(wèi) 生 計 生 委 早 在 2 0 1 7 年 就 組 織 制 定 了 國 家 致 病 菌 識 別網(wǎng)工作實施方案 明確提出要通過加強國家致病菌 識 別 網(wǎng) 建 設 建 立 并 不 斷 完 善 適 合 我 國 國 情 的 細 菌 性 傳 染 病 監(jiān) 測 模 式 推 進 細 菌 性 傳 染 病 監(jiān) 測 預 警 新 技 術(shù) 和策略應用 從而提高疫情發(fā)現(xiàn)和防控能力 土 壤 中 棲 息 著 地 球 上 最 多 樣 和 最 復 雜 的 微 生 物 群 落 1 是 病 原 微 生 物 賦 存 和 大 規(guī) 模 傳 播 的 主 要 媒 介 之 一 并 且 土 壤 可 耦 合 空 氣 和 水 體 等 媒 介 使 得 土 壤 病 原 微 生 物 對 植 物 動 物 和 人 類 的 健 康 產(chǎn) 生 直 接 或 間 接 的 影 響 圖 1 土 壤 環(huán) 境 中 的 病 原 微 生 物 種 類 多 來 源 廣 風 險 異 質(zhì) 性 高 傳 播 方 式 復 雜 多 變 可 通 過 環(huán) 境 介 質(zhì) 在 全 球 進 行 傳 播 造 成 全 球 性 大 流 行 病 2 4 例 如 土 壤 中 廣 泛 存 在 單 核 細 胞 增 生 李 斯 特 菌 炭 疽 桿 菌 大 腸 桿 菌 O 1 5 7 H 7 軍 團 菌 諾 卡 氏 菌 等 病 原 細 菌 5 并 且 其 中 許 多 病 原 微 生 物 具 有 多 重 抗 生 素 耐 藥 性 除 細 菌 外 土 壤 中 還 生 存 著 3 0 0 多 種 可 感 染 人 類 和 植 物 的 真 菌 1 對 土 壤 病 原 微 生 物 進 行 快 速 監(jiān) 測 是 控 制 其 傳 播 的 關(guān) 鍵 為 提 高 病 原 微 生 物 的 檢 測 能 力 有 必 要 發(fā) 展 快 速 甚 至 實 時 靈 敏 準 確 的 檢 測 技 術(shù) 以 便 快 速 發(fā) 現(xiàn) 和 定 位 環(huán) 境 介 質(zhì) 中 的 病 原 微 生 物 采 取 適 當 措 施 實 施 精 準 消 殺 及 時 有 效 阻 控 病 原 微 生 物 的 傳 播 6 7 保 障 生 命 健 康 安 全 為 此 本 文 綜 述 了 新 近 發(fā) 展 的 多 種 環(huán) 境 病 原 微 生 物 檢 測 技 術(shù) 根 據(jù) 其 是 否 依 賴 培 養(yǎng) 劃 分 為 兩 大 類 并 進 一 步 根 據(jù) 其 檢 測 信 息 基 因 型 或 表 型 和 原 理 分 成 6 類 圖 2 包 括 顯 色 培 養(yǎng) 技 術(shù) 基 質(zhì) 輔 助 激 光 解 吸 電 離 飛 行 時 間 質(zhì) 譜 技 術(shù) 分 子 生 物 學 技 術(shù) 拉 曼 光 譜 技 術(shù) 流 式 細 胞 技 術(shù) 和 生 物 傳 感 器 本 文 對 這 些 病 原 微 生 物 檢 測 技 術(shù) 進 行 了 詳 細 總 結(jié) 和 對 比 并 進 一 步 對 未 來 病 原 微 生 物 檢 測 技 術(shù) 的 發(fā) 展 提 出 展 望 旨 在 為 土 壤 環(huán) 境 病 原 微 生 物 的 快 速 檢 測 和 防 控 提 供 技 術(shù) 指 導 保 障 生 物 安 全 1 基 于 培 養(yǎng) 的 病 原 菌 檢 測 技 術(shù) 1 1 顯 色 培 養(yǎng) 技 術(shù) 顯 色 培 養(yǎng) 技 術(shù) 的 原 理 是 利 用 微 生 物 生 長 繁 殖 過 程 中 自 身 代 謝 產(chǎn) 生 的 酶 與 相 應 顯 色 底 物 反 應 顯 色 從 而 對 目 標 微 生 物 進 行 鑒 定 該 技 術(shù) 可 直 接 對 臨 床 和 環(huán) 境 中 病 原 微 生 物 或 者 混 有 多 種 微 生 物 的 樣 本 進 行 檢 測 培 養(yǎng) 時 長 約 為 1 8 2 4 h 現(xiàn) 已 成 功 用 于 水 體 8 以 及 臨 床 9 中 病 原 微 生 物 的 檢 測 目 前 常 用 的 主 要 有 大 腸 桿 菌 O 1 5 7 H 7 金 黃 色 葡 萄 球 菌 李 斯 特 菌 沙 門 氏 菌 等 顯 色 培 養(yǎng) 基 該 技 術(shù) 可 對 病 原 微 生 物 進 行 粗 篩 和 分 離 其 靈 敏 度 和 特 異 性 優(yōu) 于 傳 統(tǒng) 培 養(yǎng) 基 但 由 于 環(huán) 境 復 雜 干 擾 較 大 顯 色 培 養(yǎng) 技 術(shù) 存 在 一 定 程 度 的 誤 判 其 準 確 性 需 要 借 助 其 他 技 術(shù) 進 行 進 一 步 確 認 1 2 基 質(zhì) 輔 助 激 光 解 吸 電 離 飛 行 時 間 質(zhì) 譜 技 術(shù) 除 顯 色 培 養(yǎng) 基 以 外 基 于 培 養(yǎng) 的 基 質(zhì) 輔 助 激 光 解 吸 電 離 飛 行 時 間 質(zhì) 譜 M A L D I T O F M S 也 被 廣 泛 用 于 病 原 微 生 物 的 快 速 檢 測 M A L D I T O F M S 是 近 年 來 興 起 的 基 于 不 同 細 菌 特 征 蛋 白 指 紋 圖 譜 的 檢 測 技 術(shù) 通 過 對 微 生 物 菌 落 進 行 檢 測 并 與 數(shù) 據(jù) 庫 中 已 知 病 原 菌 信 息 比 對 來 實 現(xiàn) 病 原 微 生 物 的 快 速 診 斷 該 技 術(shù) 具 有 高 通 量 快 速 準 確 流 程 簡 單 等 特 點 已 成 功 應 用 于 植 物 1 0 臨 床 1 1 病 原 微 生 物 及 其 耐 藥 性 的 相 關(guān) 研 究 中 這 兩 種 依 賴 培 養(yǎng) 的 方 法 雖 已 實 現(xiàn) 對 病 原 微 生 物 的 檢 測 但 是 局 限 性 在 于 無 法 對 V B N C V i a b l e B u t N o n c u l t u r a b l e 狀 態(tài) 的 病 原 菌 或 者 環(huán) 境 中 未 培 養(yǎng) 的 微 生 物 開 展 研 究 1 2 并 且 需 要 對 病 原 微 生 物 進 行 培 養(yǎng) 比 較 費 時 為 了 更 好 地 實 現(xiàn) 環(huán) 境 中 病 原 微 生 物 的 快 速 和 準 確鑒別 近年來發(fā)展出一些不依賴于培養(yǎng)的技術(shù) 這些 圖 1 土 壤 空 氣 水 體 植 物 動 物 和 人 類 病 原 微 生 物 之 間 的 聯(lián) 系 F i g u r e 1 L i n k b e t w e e n s o i l a i r w a t e r p l a n t a n i m a l a n d h u m a n p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s 2 5 9 4徐 菲 等 土 壤 病 原 微 生 物 檢 測 技 術(shù) 研 究 進 展 2 0 2 2 年 1 2 月 w w w a e s o r g c n 技 術(shù) 使 得 環(huán) 境 中 病 原 微 生 物 的 快 檢 得 以 迅 速 發(fā) 展 并 已投入到實際環(huán)境應用中 顯示出巨大的發(fā)展?jié)摿?2 分 子 生 物 學 技 術(shù) 分 子 生 物 學 技 術(shù) 用 于 快 速 檢 測 病 原 微 生 物 主 要 是 基 于 病 原 微 生 物 的 特 異 D N A 或 R N A 標 記 基 因 序 列 進 行 分 析 主 要 包 含 聚 合 酶 鏈 式 反 應 P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n P C R 技 術(shù) 高 通 量 測 序 技 術(shù) 等 2 1 P C R 技 術(shù) P C R 技 術(shù) 是 在 體 外 模 擬 D N A 合 成 過 程 通 過 三 步 反 應 循 環(huán) 變 性 退 火 和 延 伸 擴 增 特 定 的 靶 D N A 序 列 實 現(xiàn) 靶 序 列 的 指 數(shù) 擴 增 圖 3 A 實 時 熒 光 定 量 P C R q P C R 技 術(shù) 是 在 P C R 技 術(shù) 基 礎 上 引 入 熒 光 染 料 或 者 探 針 在 擴 增 過 程 中 實 時 監(jiān) 測 目 的 基 因 的 熒 光 信 號 強 度 通 過 內(nèi) 參 法 或 者 外 參 法 對 樣 品 中 特 定 的 基 因 進 行 定 量 分 析 圖 3 A q P C R 技 術(shù) 相 較 于 傳 統(tǒng) 培 養(yǎng) 方 法 大 幅 降 低 了 病 原 微 生 物 的 檢 測 限 且 分 析 快 速 目 前 已 廣 泛 用 于 快 速 檢 測 和 定 量 土 壤 水 體 和 空 氣 等 環(huán) 境 中 的 細 菌 真 菌 等 病 原 微 生 物 例 如 N G U Y E N 等 1 5 利 用 手 持 式 便 攜 q P C R 系 統(tǒng) 對 過 濾 水 樣 中 嗜 冷 黃 桿 菌 實 現(xiàn) 了 5 0 m i n 內(nèi) 的 快 速 現(xiàn) 場 監(jiān) 測 Y A O 等 1 6 利 用 q P C R 和 I l l u m i n a 測 序 技 術(shù) 對 施 用 生 物 炭 后 土 壤 細 菌 和 真 菌 群 落 的 變 化 進 行 了 長 期 監(jiān) 測 考 慮 到 P C R 技 術(shù) 檢 測 通 量 低 的 局 限 性 研 究 者 發(fā) 展 出 了 多 重 P C R 技 術(shù) 多 重 P C R 技 術(shù) 是 在 P C R 反 應 管 中 同 時 加 入 多 種 特 異 性 引 物 進 行 P C R 擴 增 該 技 術(shù) 具 有 高 通 量 低 成 本 等 優(yōu) 點 近 年 來 多 重 P C R 技 術(shù) 為 水 環(huán) 境 中 病 原 微 生 物 的 聯(lián) 合 檢 測 提 供 了 一 種 快 速 靈 敏 的 方 法 已 成 功 應 用 于 檢 測 地 表 水 中 的 大 腸 桿 菌 銅 綠 假 單 胞 菌 志 賀 氏 菌 屬 沙 門 氏 菌 等 病 原 微 生 物 檢 測 限 為 3 1 0 2 3 1 0 3 C F U m L 1 1 7 朱 永 官 團 隊 還 開 發(fā) 出 病 原 菌 檢 測 的 高 通 量 定 量 P C R 技 術(shù) 平 臺 1 8 1 9 圖 3 B 該 技 術(shù) 可 以 同 時 對 2 3 種 人 類 病 原 菌 的 6 8 個 標 記 基 因 和 1 0 種 糞 源 宿 主 的 2 3 個 標 記 基 因 進 行 定 量 檢 測 利 用 該 技 術(shù) A N 等 1 4 對 廈 門 1 3 個 海 濱 浴 場 的 水 體 進 行 病 原 菌 檢 測 和 污 染 溯 源 為 病 原 菌 相 關(guān) 的 健 康 評 估 提 供 了 數(shù) 據(jù) 支 持 微 滴 式 數(shù) 字 P C R D r o p l e t D i g i t a l P C R d d P C R 是 第 三 代 P C R 技 術(shù) 圖 3 A 可 用 于 絕 對 定 量 且 比 q P C R 具 有 更 高 的 聚 合 酶 鏈 式 反 應 抑 制 劑 的 耐 受 能 力 在 處 理 復 雜 環(huán) 境 樣 品 如 水 樣 沉 積 物 時 具 有 優(yōu) 勢 S I N G H 等 2 0 使 用 d d P C R 和 q P C R 分 別 對 河 流 沉 積 物 中 的 沙 門 氏 菌 進 行 檢 測 發(fā) 現(xiàn) d d P C R 顯 著 提 高 了 圖 2 土 壤 等 環(huán) 境 病 原 微 生 物 檢 測 技 術(shù) 匯 總 F i g u r e 2 S u m m a r y o f d e t e c t i o n t e c h n i q u e s f o r p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s i n s o i l a n d o t h e r e n v i r o n m e n t s 2 5 9 5農(nóng) 業(yè) 環(huán) 境 科 學 學 報 第 4 1 卷 第 1 2 期 分 析 靈 敏 度 和 低 濃 度 沙 門 氏 菌 的 檢 測 結(jié) 果 證 明 d d P C R 更 適 用 于 沙 門 氏 菌 的 檢 測 該 技 術(shù) 穩(wěn) 定 準 確 高 通 量 并 且 檢 測 河 流 沉 積 物 類 的 環(huán) 境 樣 品 比 q P C R 更 加 靈 敏 上 述 P C R 相 關(guān) 技 術(shù) 的 主 要 缺 點 是 設 備 昂 貴 需 要 繁 瑣 的 熱 循 環(huán) 額 外 的 設 備 以 及 較 高 的 專 業(yè) 技 能 為 了 加 快 環(huán) 境 病 原 微 生 物 的 快 速 檢 測 環(huán) 介 導 等 溫 擴 增 L o o p m e d i a t e d I s o t h e r m a l A m p l i f i c a t i o n L A M P 投 入 應 用 該 技 術(shù) 是 近 年 來 新 開 發(fā) 的 一 種 恒 溫 基 因 擴 增 技 術(shù) 2 1 主 要 包 括 模 板 合 成 循 環(huán) 擴 增 以 及 延 長 和 再 循 環(huán) 階 段 具 有 簡 便 經(jīng) 濟 快 速 靈 敏 度 高 特 異 性 強 等 優(yōu) 點 缺 點 是 擴 增 效 率 比 較 低 常 因 為 非 特 異 性 而 導 致 假 陽 性 結(jié) 果 引 物 設 計 復 雜 反 應 體 系 容 易 被 污 染 擴 增 產(chǎn) 物 難 定 量 等 2 2 L A M P 可 以 在 資 源 匱 乏 地 區(qū) 且 無 專 業(yè) 技 術(shù) 人 員 情 況 下 進 行 環(huán) 境 中 微 生 物 的 快 速 檢 測 2 3 該 技 術(shù) 已 經(jīng) 被 應 用 于 檢 測 空 氣 中 的 金 黃 色 葡 萄 球 菌 2 4 以 及 水 體 中 的 大 腸 桿 菌 2 5 沙 門 氏 菌 2 5 等 病 原 菌 2 2 高 通 量 測 序 高 通 量 測 序 主 要 利 用 特 異 性 標 記 基 因 毒 力 因 子 和 1 6 S r R N A 基 因 鑒 定 致 病 菌 利 用 此 技 術(shù) 可 以 獲 得 環(huán) 境 中 多 種 微 生 物 物 種 結(jié) 構(gòu) 功 能 以 及 遺 傳 多 樣 性 等 方 面 的 豐 富 信 息 該 技 術(shù) 具 有 通 量 大 可 直 接 測 定 病 原 微 生 物 的 核 酸 序 列 檢 測 限 低 等 優(yōu) 勢 但 是 檢 測 成 本 高 難 以 完 全 取 代 常 規(guī) 病 原 微 生 物 檢 測 方 法 且 數(shù) 據(jù) 分 析 耗 時 目 前 第 二 代 測 序 技 術(shù) 是 主 導 的 測 序 技 術(shù) 主 要 的 測 序 平 臺 為 4 5 4 測 序 平 臺 和 I l l u m i n a 測 序 平 臺 7 C A O 等 2 6 利 用 I l l u m i n a H i S e q 2 0 0 0 對 霧 霾 空 氣 微 生 物 宏 基 因 組 進 行 了 測 序 研 究 在 種 的 分 類 水 平 上 對 環(huán) 境 空 氣 中 細 菌 真 菌 古 菌 和 d s D N A 病 毒 等 微 生 物 進 行 了 檢 測 鑒 定 2 7 Y A N G 等 2 8 利 用 I l l u m i n a 對 水 體 環(huán) 境 和 塑 料 際 微 生 物 的 1 6 S r R N A 進 行 測 序 并 將 測 序 結(jié) 果 與 病 原 菌 數(shù) 據(jù) 庫 進 行 比 對 共 檢 測 到 水 體 及 塑 料 際 包 括 分 枝 桿 菌 李 斯 特 菌 芽 孢 桿 菌 假 單 胞 菌 腸 桿 菌 等 在 內(nèi) 的 多 種 人 體 潛 在 致 病 菌 3 拉 曼 光 譜 技 術(shù) 拉 曼 光 譜 正 發(fā) 展 成 為 一 種 不 依 賴 于 培 養(yǎng) 的 微 生 物 快 速 檢 測 和 識 別 的 新 興 檢 測 手 段 與 分 子 生 物 學 技 術(shù) 相 比 拉 曼 光 譜 可 以 直 接 快 速 無 損 地 對 低 至 單 個微生物進行檢測 且可借助穩(wěn)定同位素標記區(qū)分死 活細胞 為病原微生物的快速檢測提供了新的手段 3 1 拉 曼 光 譜 原 理 1 9 2 8 年 印 度 物 理 學 家 拉 曼 首 次 發(fā) 現(xiàn) 拉 曼 散 射 現(xiàn) 象 拉 曼 光 譜 是 一 種 基 于 分 子 振 動 的 光 譜 技 術(shù) 入 射 光 與 分 子 化 學 鍵 作 用 后 發(fā) 生 非 彈 性 拉 曼 散 射 通 過 檢 測 與 入 射 光 頻 率 不 同 的 拉 曼 散 射 光 獲 得 物 質(zhì) 的 化 學 組 成 和 分 子 結(jié) 構(gòu) 等 信 息 3 2 單 細 胞 拉 曼 光 譜 單 細 胞 拉 曼 光 譜 研 究 微 生 物 的 主 要 優(yōu) 點 包 括 2 8 2 9 單 細 胞 水 平 檢 測 與 光 學 顯 微 鏡 結(jié) 合 可 提 供 低 至 1 m m 的 空 間 分 辨 率 實 現(xiàn) 對 單 個 細 菌 的 直 接 圖 3 P C R 相 關(guān) 技 術(shù) 原 理 及 流 程 圖 F i g u r e 3 P r i n c i p l e s a n d f l o w c h a r t o f P C R r e l a t e d t e c h n o l o g y A P C R q P C R 以 及 d d P C R 原 理 圖 1 3 B 高 通 量 定 量 P C R 技 術(shù) 流 程 1 4 2 5 9 6徐 菲 等 土 壤 病 原 微 生 物 檢 測 技 術(shù) 研 究 進 展 2 0 2 2 年 1 2 月 w w w a e s o r g c n 檢 測 克 服 冗 長 的 培 養(yǎng) 限 制 實 現(xiàn) 快 速 檢 測 豐 富 的 化 學 信 息 拉 曼 光 譜 提 供 微 生 物 所 含 多 種 生 物 分 子 的 指 紋 圖 譜 包 括 核 酸 蛋 白 質(zhì) 脂 質(zhì) 色 素 如 類 胡 蘿 卜 素 細 胞 色 素 c 等 這 些 拉 曼 特 征 會 隨 種 屬 或 生 理 狀 態(tài) 的 變 化 而 靈 敏 改 變 與 統(tǒng) 計 分 析 或 機 器 學 習 結(jié) 合 時 拉 曼 光 譜 可 在 不 同 分 類 水 平 如 屬 種 甚 至 菌 株 水 平 區(qū) 分 病 原 菌 無 損 檢 測 允 許 下 游 特 定 功 能 單 細 胞 的 基 因 組 分 析 提 供 了 一 種 關(guān) 聯(lián) 拉 曼 表 型 和 基 因 型 的 方 法 對 于 全 面 深 入 認 識 環(huán) 境 中 致 病 菌 和 抗 生 素 耐 藥 性 非 常 重 要 2 9 近 年 來 基 于 不 同 微 生 物 的 特 征 指 紋 圖 譜 拉 曼 光 譜 已 被 用 于 快 速 識 別 土 壤 水 體 臨 床 中 的 病 原 微 生 物 甚 至 在 低 至 單 個 菌 株 水 平 上 有 很 高 的 準 確 度 例 如 W A L T E R 等 3 0 采 用 拉 曼 光 譜 結(jié) 合 線 性 判 別 分 析 L i n e a r D i s c r i m i n a n t A n a l y s i s L D A 研 究 了 作 為 土 壤 重 金 屬 污 染 的 生 物 指 示 劑 鏈 霉 菌 屬 細 菌 識 別 了 不 同 N i 2 濃 度 培 養(yǎng) 基 中 鏈 霉 菌 的 單 細 胞 拉 曼 光 譜 預 測 精 度 為 8 8 此 外 有 研 究 者 還 利 用 拉 曼 光 譜 結(jié) 合 支 持 向 量 機 鑒 定 瓶 裝 礦 泉 水 獨 立 樣 本 中 的 銅 綠 假 單 胞 菌 準 確 率 達 到 8 5 3 1 S C H U S T E R 等 3 2 3 3 首 先 在 單 細 胞 水 平 引 入 拉 曼 光 譜 進 行 微 生 物 研 究 證 明 拉 曼 光 譜 可 以 作 為 一 種 快 速 可 靠 的 技 術(shù) 方 法 用 于 人 類 致 病 菌 軍 團 菌 的 識 別 分 類 此 后 M O N T A N A R I 等 3 4 將 單 細 胞 拉 曼 技 術(shù) 與 經(jīng) 典 微 生 物 檢 測 技 術(shù) 相 結(jié) 合 成 功 鑒 別 出 2 8 8 份 血 液 透 析 用 水 中 分 離 的 1 4 6 種 臨 床 酵 母 菌 種 證 實 了 單 細 胞 拉 曼 光 譜 對 血 液 透 析 用 水 中 真 菌 鑒 別 的 可 行 性 由 于 微 生 物 光 譜 數(shù) 據(jù) 集 差 異 較 小 尤 其 是 低 信 噪 比 的 光 譜 利 用 傳 統(tǒng) 的 化 學 計 量 學 方 法 難 以 區(qū) 分 如 L D A 偏 最 小 二 乘 判 別 分 析 P a r t i a l L e a s t S q u a r e s D i s c r i m i n a n t A n a l y s i s P L S D A 支 持 向 量 機 S u p p o r t V e c t o r M a c h i n e S V M 以 及 隨 機 森 林 R a n d o m F o r e s t R F 等 1 9 3 5 為 了 解 決 這 些 挑 戰(zhàn) 深 度 學 習 算 法 如 卷 積 神 經(jīng) 網(wǎng) 絡 C o n v o l u t i o n a l N e u r a l N e t w o r k C N N 循 環(huán) 神 經(jīng) 網(wǎng) 絡 R e c u r r e n t N e u r a l N e t w o r k R N N 生 成 式 對 抗 網(wǎng) 絡 G e n e r a t i v e A d v e r s a r i a l N e t w o r k s G A N 等 成 為 一 種 有 前 景 的 解 決 途 徑 近 幾 年 在 致 病 菌 快 速 鑒 別 方 面 得 到 了 成 功 應 用 例 如 L U 等 3 6 利 用 拉 曼 光 鑷 結(jié) 合 C N N 快 速 鑒 定 微 生 物 單 細 胞 并 進 行 特 征 光 譜 提 取 圖 4 A 通 過 構(gòu) 建 1 4 種 微 生 物 的 拉 曼 組 數(shù) 據(jù) 庫 在 單 細 胞 水 平 鑒 定 微 生 物 的 平 均 準 確 率 達 到 9 5 6 4 并 且 整 個 鑒 定 過 程 在 5 m i n 內(nèi) 完 成 另 外 拉 曼 光 譜 快 速 鑒 別 病 原 微 生 物 也 被 應 用 到 了 臨 床 菌 株 的 鑒 定 例 如 H O 等 3 5 利 用 3 0 個 臨 床 病 原 菌 分 離 菌 株 的 拉 曼 光 譜 數(shù) 據(jù) 建 立 參 考 數(shù) 據(jù) 集 利 用 C N N 訓 練 識 別 模 型 圖 4 B 進 一 步 結(jié) 合 獨 立 驗 證 集 臨 床 患 者 新 分 離 菌 株 的 拉 曼 譜 圖 進 行 模 型 微 調(diào) 和 性 能 優(yōu) 化 實 現(xiàn) 了 臨 床 患 者 分 離 菌 株 的 成 功 鑒 定 且 僅 1 0 個 光 譜 就 可 以 獲 得 高 達 9 9 7 的 分 類 準 確 度 實 現(xiàn) 了 從 模 擬 到 臨 床 應 用 的 轉(zhuǎn) 變 此 外 Q I N 等 3 7 開 發(fā) 了 基 于 拉 曼 光 譜 結(jié) 合 深 度 學 習 的 方 法 實 現(xiàn) 了 對 6 種 典 型 病 原 菌 細 胞 外 囊 泡 的 快 速 精 準 識 別 和 生 成 機 制 研 究 在 菌 株 水 平 的 分 類 準 確 度 達 到 9 3 值 得 注 意 的 是 微 生 物 的 生 長 狀 態(tài) 和 環(huán) 境 因 素 很 容 易 引 發(fā) 拉 曼 光 譜 特 征 的 變 化 因 此 對 于 基 于 拉 曼 光 譜 的 病 原 菌 鑒 別 生 理 狀 態(tài) 生 長 階 段 介 質(zhì) 3 8 3 9 環(huán) 境 因 素 p H 溫 度 水 分 等 4 0 4 1 以 及 樣 品 處 理 過 程 4 2 等 都 需 納 入 拉 曼 數(shù) 據(jù) 集 以 構(gòu) 建 穩(wěn) 定 的 病 原 菌 鑒 別 模 型 此 外 單 細 胞 拉 曼 光 譜 結(jié) 合 穩(wěn) 定 同 位 素 標 記 還 可 用 于 研 究 微 生 物 的 活 性 1 9 2 9 4 3 當 細 菌 通 過 代 謝 活 動 攝 入 2 D 1 3 C 1 5 N 等 同 位 素 標 記 物 后 細 胞 重 要 組 成 成 分 如 脂 類 蛋 白