38 4 920 928 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào) Chinese Journal of Biological Control 2022 年 8 月 收稿日期 2022 06 26 基金項(xiàng)目 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃 2019YFD1002000 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系北京市特色作物創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)土壤生態(tài)評(píng)價(jià)與產(chǎn)品開(kāi)發(fā)崗位 北京市鄉(xiāng)村振 興科技項(xiàng)目農(nóng)業(yè)微生物制劑創(chuàng)制與落地平谷產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā) 作者簡(jiǎn)介 馬榮 碩士研究生 E mail 1418859866 通信作者 魏海雷 博士 研究員 E mail weihailei 張曉霞 博士 研究員 E mail zhangxiaoxia DOI 10 16409 ki 2095 039x 2022 04 011 北京地區(qū)番茄青枯病健康和發(fā)病植株根際細(xì)菌群落比較分析 馬 榮 馬毅楠 王 星 谷醫(yī)林 魏海雷 張曉霞 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100081 摘要 本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)研究了北京地區(qū)番茄青枯病健康與發(fā)病植株根際細(xì)菌組成差異 構(gòu)建相 關(guān)性網(wǎng)絡(luò) 并從健康植株根際分離和篩選青枯菌拮抗菌群 結(jié)果顯示 pH和速效磷是影響各采樣地區(qū)土 壤細(xì)菌群落組成的主要因子 發(fā)病植株根際土壤群落結(jié)構(gòu)比健康植株更復(fù)雜 群落間相互作用數(shù)量增多 網(wǎng)絡(luò)分析表明有15個(gè)屬與Ralstonia直接相關(guān) 通過(guò)拮抗實(shí)驗(yàn)獲得14株對(duì)青枯菌具有顯著拮抗能力的根際 細(xì)菌 其中包括3個(gè)不常見(jiàn)拮抗細(xì)菌類群 為無(wú)色桿菌屬Achromobacter 劍菌屬Ensifer和賴氨酸芽胞桿 菌屬Lysinibacillus 該研究結(jié)果為北京地區(qū)番茄青枯病預(yù)警和防控提供了理論基礎(chǔ)和資源儲(chǔ)備 關(guān) 鍵 詞 高通量測(cè)序 番茄青枯病 根際群落 相關(guān)性網(wǎng)絡(luò) 中圖分類號(hào) S476 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1005 9261 2022 04 0920 09 Comparative Analysis of Healthy and Diseased Rhizosphere Bacterial Communities of Tomato Bacterial Wilt in Beijing Region MA Rong MA Yinan WANG Xing GU Yilin WEI Hailei ZHANG Xiaoxia Key Laboratory of Microbial Resources Collection and Preservation Ministry of Agriculture and Rural Affairs Institute of Agricultural Resources and Regional Planning Chinese Academy of Agricultural Sciences Beijing 100081 Abstract In this study the difference of rhizosphere bacteria composition between healthy and bacterial wilt tomato plants was investigated by high throughput sequencing and the correlation network was constructed Antagonistic bacteria against Ralstonia solanacearum were isolated from the rhizosphere of healthy plants It was found that soil pH and available phosphorus in different regions were the main factors to shape the rhizosphere bacterial community The rhizosphere community structure of the diseased plants was more complex than that of healthy plants which demonstrated by the increase of interactive nodes Fifteen bacterial genera directly related to Ralstonia was defined Fourteen strains of rhizosphere bacteria were obtained by antagonistic experiments including three uncommon antagonistic groups Achromobacter Ensifer and Lysinibacillus The results provided information for the early warning and control of tomato wilt in Beijing region Key words high throughput sequencing tomato bacterial wilt rhizosphere community correlation network 番茄青枯病是由茄科雷爾氏菌 Rasltonia solanacearum 簡(jiǎn)稱青枯菌 引起的一種毀滅性土傳病害 1 青枯菌寄主范圍廣泛 可侵染包括茄科植物在內(nèi)的 400 多種植物 2 3 青枯病在我國(guó)番茄種植區(qū)大面積發(fā)生 且危害嚴(yán)重 目前尚未發(fā)現(xiàn)高效的防治方法 生物防治因其對(duì)環(huán)境友好且高效的特點(diǎn)而備受關(guān)注 根際促 生菌 Plant Growth Promoting Rhizobacteria PGPR 是主要的生防微生物資源 其特點(diǎn)為增加土壤微生物 群落多樣性或增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的抗性 4 5 植物根際是植物根部與土壤之間動(dòng)態(tài)而復(fù)雜的界面 根際微生 第 4 期 馬榮等 北京地區(qū)番茄青枯病健康和發(fā)病植株根際細(xì)菌群落比較分析 921 物是一種特定的微生物群落 對(duì)于植株的生長(zhǎng) 健康和抵御病原菌的侵染有著重要作用 6 7 青枯菌的入侵 能夠破壞根際微生物群落組成 8 導(dǎo)致根際土壤中的革蘭氏陽(yáng)性菌 厚壁菌門和放線菌門 的失調(diào)進(jìn)而促 進(jìn)了青枯病的發(fā)生 9 因此 研究番茄健康與發(fā)病植株根際土壤微生物群落組成差異有助于深入了解青枯 菌與其他群落成員之間的關(guān)系 此外 還可以利用構(gòu)建相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)的方法來(lái)探討根際微生物群落間的相互 作用 在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中 相互作用的微生物成員之間的連接配置和分布可以對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的功能和穩(wěn)定性提供 強(qiáng)有力的預(yù)測(cè) 也可以識(shí)別出菌群中占據(jù)重要位置的特定微生物 10 11 番茄是北京市設(shè)施蔬菜的重要果菜 對(duì)推動(dòng)農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化等方面起著極其重要的作用 由于青枯菌喜好 高溫高濕的土壤環(huán)境 青枯病的發(fā)生大多集中在我國(guó)華中 華南和華東地區(qū) 而華北地區(qū)相對(duì)較少 12 但 隨著氣候和種植方式的變化 青枯病的發(fā)生已經(jīng)有北移的趨勢(shì) 此外 由于北京保護(hù)地常年連作 造成了 嚴(yán)重的土壤生物障礙 本研究通過(guò)解析北京地區(qū)番茄青枯病發(fā)生的根際群落變化特征并結(jié)合分離培養(yǎng)篩選 有利于番茄抗病促生的有益菌群 為青枯病的生物防控提供重要參考 1 材料與方法 1 1 供試材料 供試病原菌 為實(shí)驗(yàn)室保藏的青枯菌 Ralstonia solanacearum GMI1000 番茄根際土壤樣品 采自北京市昌平區(qū) 順義區(qū) 通州區(qū) 大興區(qū) 具體采樣點(diǎn)見(jiàn)表 1 各個(gè)采樣地 點(diǎn)分別采集散土 健康和發(fā)病植株根際土壤 挖出整個(gè)根系 輕抖根系 收集緊密附著根上的土壤 即為 根際土壤 13 表 1 北京市番茄根際土壤采樣統(tǒng)計(jì)表 Table 1 Area of sampling collection statistical of tomato rhizosphere soil in Beijing region 行政區(qū) Sampling areas 采樣地點(diǎn) Sampling locations 樣品編號(hào) Sampling codes 順義區(qū) Shunyi District 趙全營(yíng)鎮(zhèn)前桑園村 興農(nóng)鼎力種植專業(yè)合作社 QSY 大興區(qū) Daxing District 長(zhǎng)子營(yíng)鎮(zhèn)東北臺(tái)村 奧肯尼克家庭農(nóng)場(chǎng) DBT 潞城鎮(zhèn)大東各莊村 中農(nóng)富通 DDG 通州區(qū) Tongzhou District 西集鎮(zhèn)王上村 潤(rùn)土園 WSC 南邵鎮(zhèn)姜屯村 金六環(huán)農(nóng)業(yè)園 JT 昌平區(qū) Changping District 興壽鎮(zhèn)西營(yíng)村 樹(shù)蜂采摘園 XS 1 2 土壤理化性質(zhì)的測(cè)定 土壤理化性質(zhì)測(cè)定參照 土壤農(nóng)化分析 土壤 pH 利用復(fù)合玻璃電極儀測(cè)定 土水比為 1 2 5 利用 電導(dǎo)率儀測(cè)定土壤電導(dǎo)率 土水比為 1 5 有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法 外加熱法 土壤全氮采用半微量開(kāi) 氏法 堿解氮采用堿解擴(kuò)散法 土壤全磷和有效磷采用鉬銻抗比色法 土壤全鉀和速效鉀采用火焰光度法 利用流動(dòng)分析儀測(cè)定土壤懸液的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量 14 1 3 番茄根際土壤基因組的提取與檢測(cè) 利用 FastDNA Spin Kit For Soil MP 試劑盒提取 DNA 首先稱取 0 5 g 土壤樣品 在滅菌后的研缽 中利用液氮研磨至粉狀 裝入 Lysing Matrix Etube 中 之后步驟按照 MP 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作 利用核 酸定量?jī)x NanoDrop 2000 測(cè)定 DNA 核酸濃度與純度 DNA 于 20 保存?zhèn)溆?1 4 16S rRNA 基因 PCR 擴(kuò)增及測(cè)序樣品的準(zhǔn)備 16S rRNA 基因擴(kuò)增使用帶有不同 barcode 序列的通用引物 V3 V4 區(qū) 534F 5 CCAGCAGCCGCGGTA AT 3 和 783R 5 ACCMGGGTATCTAATCCKG 3 15 PCR 體系 50 L 2 Taq PCR Mix 25 L 534 F 與 783 R 引物各 2 L DNA 30 ng ddH 2 O 補(bǔ)足至 50 L PCR 反應(yīng)程序?yàn)?95 預(yù)變性 3 min 94 變性 45 s 53 退火 1 min 72 延伸 1 min 共 35 個(gè)循環(huán) 72 延伸 10 min 使用 OMEGA 純化試劑盒 進(jìn)行膠回收 用 Nanodrop 檢測(cè)已純化產(chǎn)物 按照 Marker 250 bp 條帶的凈光密度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行等質(zhì)量 DNA 150 ng 混樣 采用雙端 Nova PE 250 模式進(jìn)行測(cè)序 由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成 922 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 38 卷 1 5 擴(kuò)增子數(shù)據(jù)處理和分析 將 16S rRNA 基因的下機(jī)測(cè)序數(shù)據(jù) 正向 反向序列文件 與 barcode 序列 txt 文件 上傳至 Galaxy 平臺(tái) 16 有序去除 barcode 序列與正反向引物序列 利用 Flash 工具將正反向序列拼接 去除非細(xì)菌序列 后 按照 97 的相似度水平生成 OTU Operational Taxonomic Units 表 借助在線平臺(tái) MicrobiomeAnalyst https www microbiomeanalyst ca 17 和 ImageGP 18 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析 選 用 Canonical Correspondence Analysis CCA 對(duì)土壤養(yǎng)分和土壤細(xì)菌群落的相關(guān)性進(jìn)行分析 明確驅(qū)動(dòng)細(xì) 菌群落發(fā)生變化的主要影響因子 利用 Chao1 Shannon 和 Simpson 指數(shù)來(lái)表征番茄根際土壤微生物群落 多樣性 基于 Bray Curtis 距離對(duì)微生物群落相似性進(jìn)行主成分分析 Principle coordinate analysis PCoA 基于 SparCC 算法進(jìn)行群落相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析 利用 Gephi v 0 9 2 軟件可視化 利用軟件 SAS 9 4 完成單 因素方差分析 1 6 根際細(xì)菌分離培養(yǎng)與 16S rRNA 基因測(cè)序分析 取 5 g 鮮土置于盛有玻璃珠和 45 mL 無(wú)菌水的三角瓶中 室溫 120 r min 振蕩 30 min 取 1 mL 土壤 懸液用無(wú)菌水進(jìn)行梯度稀釋 選取稀釋度 10 4 10 6 的土壤懸液各 0 1 mL 分別涂布在 R2A 培養(yǎng)基 19 30 恒溫培養(yǎng) 7 d 取單個(gè)菌落并進(jìn)一步純化 最后以 20 甘油懸液保存在 80 冰箱 采用細(xì)菌 16S rRNA 基 因通用引物 27F 和 1492R 20 擴(kuò)增供試菌的 16S rRNA 基因片段 每個(gè)反應(yīng)體系 25 L DNA 3 L 引物各 1 L 2 Taq PCR Mix 12 5 L ddH 2 O 補(bǔ)至 25 L PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94 預(yù)變性 3 min 94 變性 30 s 55 退火 30 s 72 延伸 2 5 min 35 個(gè)循環(huán)后于 4 保存 PCR 產(chǎn)物由生工生物公司 北京 進(jìn)行測(cè)序 將獲得的 16S rRNA基因序列與 EzBioCloud 和 GenBank www ncbi nlm nih gov GenBank 中菌株序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)鑒定 1 7 根際細(xì)菌拮抗功能篩選 將病原菌在 NA 固體培養(yǎng)基 21 上活化 再轉(zhuǎn)接 NA 液體培養(yǎng)基 同時(shí)培養(yǎng)試驗(yàn)菌株 30 120 r min 振蕩培養(yǎng) 24 h 后 離心去掉上清液 加入適量無(wú)菌水調(diào)至濃度為 OD 600 1 取 200 L 病原菌菌液涂布于 NA 平板上 晾干后 緩慢滴加 10 L 試驗(yàn)菌株 每株菌株 3 個(gè)重復(fù) 30 培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng) 觀察并測(cè)量 抑菌圈 2 結(jié)果與分析 2 1 不同采樣地區(qū)的土壤理化性質(zhì)分析 對(duì)順義區(qū) 大興區(qū) 通州區(qū)和昌平區(qū) 4 個(gè)區(qū)的 6 個(gè)采樣地區(qū)的散土理化指標(biāo)進(jìn)行方差分析 表 2 發(fā)現(xiàn) 6 個(gè)采樣地區(qū)的土壤養(yǎng)分均存在顯著性差異 其中興壽鎮(zhèn) XS 地區(qū)樣品 pH 最高 為 8 63 全 氮 全磷 有機(jī)質(zhì)和堿解氮含量最低 大東各莊村 DDG 各個(gè)理化指標(biāo)較高 但其土壤鹽分含量顯 著高于其他采樣地區(qū) 即土壤鹽漬化程度較重 2 2 土壤養(yǎng)分對(duì)不同采樣地細(xì)菌群落的影響 土壤養(yǎng)分與細(xì)菌群落相關(guān)分析結(jié)果表明 圖 1 pH 和速效磷是影響土壤細(xì)菌群落變異最顯著 的環(huán)境因子 其次是速效鉀 EC 硝態(tài)氮 全氮和 有機(jī)質(zhì) 而全鉀 全磷 堿解氮和銨態(tài)氮對(duì)細(xì)菌群 落差異化的貢獻(xiàn)率較小 2 3 番茄根際土壤細(xì)菌群落的組成分析 北京 6 個(gè)地區(qū) 36 份番茄根際土壤樣品共產(chǎn)生 777540 條 16S rRNA 基因序列 利用 RDP 數(shù)據(jù)庫(kù) 注釋后 6 個(gè)地區(qū)的樣本共檢測(cè)到 16 個(gè)細(xì)菌門 圖 XS QSY JT DDG DBT WSC Group CCA1 23 41 012 1 CCA2 1 3 74 1 0 1 2 圖 1 土壤養(yǎng)分因子與散土細(xì)菌群落典型相關(guān)分析 Fig 1 Canonical correspondence analysis of relationship between soil nutrient factors with bulk soil bacterial community Permutation test p value 0 001 第 4 期 馬榮等 北京地區(qū)番茄青枯病健康和發(fā)病植株根際細(xì)菌群落比較分析 923 2A 相對(duì)豐度大于 1 的門類 各個(gè)地區(qū)番茄根際微生物群落以放線菌門 Actinobacteria 占比 27 46 變形菌門 Proteobacteria 占比 21 50 和厚壁菌門 Firmicutes 占比 7 32 為主 在屬水平 圖 表 2 不同采樣地土壤樣品的理化性質(zhì)比較 Table 2 Comparison on the physical and chemical properties of soil samples at different sampling sites 地區(qū) pH EC s cm 全氮 g kg 全磷 g kg 全鉀 g kg 有機(jī)質(zhì) g kg DDG 7 78 0 03 cd 1891 67 324 61a 4 36 0 49 a 2 39 0 20 a 20 96 0 46 a 56 56 4 84 a JT 7 49 0 04 d 703 67 73 14 b 2 88 0 43 b 1 43 0 08 b 18 62 0 88 ab 48 49 1 62 ab QSY 8 00 0 09 c 334 73 151 74 b 2 35 0 29 bc 1 47 0 18 b 15 71 2 09 b 41 82 5 21 b DBT 8 12 0 11 bc 277 20 498 44 b 2 40 0 17 b 1 97 0 09 ab 17 66 0 40 ab 27 24 1 89 c WSC 8 40 0 10 ab 127 20 20 18 b 1 84 0 02 bc 1 55 0 09 b 16 09 0 42 b 22 50 1 49 c XS 8 63 0 13 a 268 73 163 86 b 1 01 0 25 c 0 81 0 11 c 18 36 0 32 ab 15 27 2 05 c 地區(qū) 堿解氮 mg kg 速效磷 mg kg 速效鉀 mg kg 銨態(tài)氮 mg kg 硝態(tài)氮 mg kg DDG 241 34 24 64 a 232 92 28 25 b 2227 42 189 57 a 5 60 1 39 a 668 05 99 25 a JT 174 22 31 95 ab 68 24 5 83 d 666 80 47 99 bc 5 80 2 43 a 214 70 51 02 b QSY 150 66 14 04 abc 143 18 18 99 c 551 85 159 52 bc 2 56 0 20 b 102 08 37 98 b DBT 152 75 14 03 abc 311 4 7 28 08 a 941 45 158 99 b 2 52 1 08 b 133 05 52 12 b WSC 129 73 4 04 bc 81 8 1 38 d 396 48 17 65 bc 2 25 1 18 b 22 63 4 20 b XS 76 13 26 31 c 82 98 8 85 d 335 95 144 68 d 2 24 1 36 b 13 57 6 23 b 注 數(shù)據(jù)為平均值 標(biāo)準(zhǔn)誤 不同小字母表示 0 05 水平上差異顯著 Note data were presented as mean SE data with different lowercase letters indicated significant difference at 0 05 level 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 DBTD DBTH DDGD DDGH JTD JTH QSYD QSYH WSCD WSCH XSD XSH Verrucomicrobia Acidobacteria Nitrospirae Bacteroidetes Gemmatimonadetes Firmicutes Proteobacteria Actinobacteria 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 DBTD DBTH DDGD DDGH JTD JTH QSYD QSYH WSCD WSCH XSD XSH Agromyces Mycobacterium Streptomyces Thermomonas Rhodoplanes Lysobacter Bacillus Steroidobacter Planifilum Arthrobacter A B 圖 2 各個(gè)地區(qū)健康和發(fā)病番茄根際土壤細(xì)菌群落組成比較 A 門水平 B 屬水平 樣品編號(hào)后的字母 D 和 H 分別是發(fā)病植株和健康植株 Fig 2 Comparison of rhizosphere bacterial community composition of healthy and diseased tomato at different sampling sites A phylum level B genus level the letters D and H after sample codes indicate the diseased and healthy plants respectively 924 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 38 卷 2B 大東各莊村 DDG 姜屯 JT 和前桑園村 QSY 的番茄植株根際的優(yōu)勢(shì)菌群為芽胞桿菌屬 占比 42 56 興壽鎮(zhèn) XS 和王上村 WSC 的優(yōu)勢(shì)菌群為節(jié)細(xì)菌屬 占比 16 34 所有采樣點(diǎn) 中 僅東北臺(tái)村 DBTD 和 DBTH 和前桑園村 QSYD 和 QSYH 的健康和發(fā)病植株根際組成存在差異 整體來(lái)看 不同地區(qū)的番茄根際植株群落組成在屬水平的優(yōu)勢(shì)菌群不同 而同一地區(qū)的健康和發(fā)病植株根 際組成差異較小 2 4 番茄根際土壤細(xì)菌群落多樣性分析 多樣性分析結(jié)果表明 健康植株根際群落 Chao1 Shannon 和 Simpson 指數(shù)均高于發(fā)病植株番茄根際 土壤 圖 3 主成分分析結(jié)果表明 6 個(gè)地區(qū)的番茄根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)顯著的區(qū)域性分布 P 0 001 R 2 0 46952 圖 4A 同時(shí)樣品聚類分析也說(shuō)明地域因素對(duì)于番茄根際細(xì)菌群體的影響大于病原微生物引 起的群落結(jié)構(gòu)變化 圖 4B 200 400 600 800 healthy disease 4 50 4 75 5 00 healthy disease 0 975 0 980 0 985 0 990 healthy disease healthy disease 圖 3 各個(gè)地區(qū)健康和發(fā)病番茄根際土壤微生物群落 多樣性分析 Fig 3 diversity analysis of healthy and diseased tomato rhizosphere soil community at different sampling sites 2 5 健康和發(fā)病植株根際細(xì)菌群落網(wǎng)絡(luò)相關(guān)性分析 在健康植株根際土壤的群落相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖中 圖 5A 點(diǎn)元素和邊元素分別是 93 和 113 正相互作 用數(shù)量為 71 負(fù)相互作用數(shù)量為 42 在發(fā)病植株根際土壤的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖中 圖 5B 點(diǎn)元素和邊元素 分別是 136 和 292 正相互作用數(shù)量為 152 負(fù)相互作用數(shù)量為 140 與健康番茄根際群落網(wǎng)絡(luò)相比 發(fā)病 番茄根際群落網(wǎng)絡(luò)中的點(diǎn)元素和邊元素的數(shù)量均明顯升高 說(shuō)明發(fā)病植株根際土壤的群落結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜且 存在更多的相互作用 即微生物群落的平衡關(guān)系發(fā)生了變化 Bacillus 在健康和發(fā)病植株根際細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)中 都占據(jù)核心位置 且在發(fā)病植株根際細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)中與其他類群存在更多的互作關(guān)系 degree 14 而 Stenotrophomonas Lysinibacillus 和 Pseudoxanthomonas 等類群僅在發(fā)病植株根際細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)核心位置 2 6 Ralstonia 相關(guān)類群分析 基于健康和發(fā)病土壤微生物群落相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)與 Ralstonia 直接相關(guān)的微生物有 15 個(gè)屬 圖 6 其中與 Ralstonia 呈正相關(guān)的屬有 9 個(gè) 分別是伯克霍爾德氏 Burkholderia 索氏菌屬 Thauera 根瘤菌屬 Rhizobium 海洋芽胞桿菌屬 Oceanobacillus 腸桿菌屬 Enterobacter 侏儒囊菌屬 Nannocystis 泛菌屬 Pantoea 散生桿菌屬 Patulibacter 和柯恩氏菌屬 Cohnella 與 Ralstonia 呈負(fù)相關(guān)的屬有 6 個(gè) 分別是芽胞 桿菌屬 Bacillus 寡養(yǎng)單胞菌屬 Stenotrophomonas 氣微菌屬 Aeromicrobium 噬冷菌屬 Algoriphagus 珊 瑚球菌屬 Corallococcus 和假黃單胞菌屬 Pseudoxanthomonas 第 4 期 馬榮等 北京地區(qū)番茄青枯病健康和發(fā)病植株根際細(xì)菌群落比較分析 925 0 2 0 0 2 Axis 1 13 0 2 0 0 2 Axi s 2 8 0 8 DDGH2 DDGD2 DDGD3 DDGH1 DDGH3 QSYD2 JTH1 JTH3 JTD3 JTD2 JTH2 DBTD3 DBTH2 DBTH1 DBTH3 DBTD1 DBTD2 XSH3 XSH1 XSH2 XSD3 XSD2 DDGD1 WSCD1 WSCH2 WSCH3 WSCD2 WSCH1 WSCD3 QSYH3 QSYH2 QSYD1 QSYD3 WSC DBT DDG XS QSY JT QSYH1 XSD1 JTD1 0 6 0 4 0 2 0 XS QSY JT DDG DBT WSC A B A Principle coordinate analysis B Cluster analysis of samples 圖 4 各個(gè)地區(qū)番茄根際土壤微生物群落 多樣性分析和樣品聚類分析 A 主成分分析 B 樣品聚類分析 Fig 4 diversity and cluster analysis of tomato rhizosphere soil microbial community at different sampling sites 2 7 健康番茄根際土壤細(xì)菌的拮抗功能篩選 從健康番茄根際土壤中共分離得到 152 株細(xì)菌 經(jīng)過(guò)拮抗功能篩選得到 14 株 表 3 對(duì)青枯菌 R solanacearum GMI1000 具有拮抗作用的菌株 圖 7 分別屬于無(wú)色桿菌屬 Achromobacter 芽胞桿菌屬 Bacillus 劍菌屬 Ensifer 腸桿菌屬 Enterobacter 賴氨酸芽胞桿菌屬 Lysinibacillus 假單胞菌屬 Pseudomonas 紅球菌屬 Rhodococcus 寡養(yǎng)單胞菌屬 Stenotrophomonas 和鏈霉菌屬 Streptomyces 926 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 38 卷 圖 5 健康和發(fā)病番茄根際群落相互作用的網(wǎng)絡(luò) A 健康植株根際土壤 B 發(fā)病植株根際土壤 不同的顏色代表不同的模塊 黑色鏈接 表示節(jié)點(diǎn)間的正交互作用 紅色鏈接表示負(fù)交互作用 Fig 5 Network of rhizosphere community interactions between healthy and diseased tomato A rhizosphere soil of healthy plants B rhizosphere soil of diseased plants different colors represent different modules black links represent positive interactions between nodes and red links represent negative interactions 圖 6 Ralstonia 與番茄根際群落中其它細(xì)菌的網(wǎng)絡(luò)相關(guān)分析 Fig 6 Network analysis of Ralstonia with other bacteria in tomato rhizosphere community 抑菌圈 mm 圖 7 14 株根際細(xì)菌對(duì)青枯菌的拮抗活性測(cè)定 Fig 7 Antagonistic activity of 14 rhizosphere bacteria against Ralstonia solanacearum GMI1000 3 討論 盡管青枯病不是北方設(shè)施番茄的主要病害 但由于全球變暖 連作障礙等因素的影響下 番茄青枯病 具有北移的趨勢(shì) 本研究對(duì)順義 大興 通州 昌平 4 個(gè)區(qū)域 6 個(gè)采樣點(diǎn)的健康與發(fā)病番茄植株進(jìn)行研究 第 4 期 馬榮等 北京地區(qū)番茄青枯病健康和發(fā)病植株根際細(xì)菌群落比較分析 927 表 3 青枯菌拮抗細(xì)菌鑒定結(jié)果 Table 3 Isolation culture and identification of bacteria from healthy tomato rhizosphere soil 菌株編號(hào) Strain 分離地點(diǎn) Separation location 菌種 Bacterial species 相似度 Identity of 16S rRNA gene HD15 長(zhǎng)子營(yíng)鎮(zhèn)東北臺(tái)村 Achromobacter xylosoxidans 100 HP14 長(zhǎng)子營(yíng)鎮(zhèn)東北臺(tái)村 Bacillus subtilis 100 HR8 長(zhǎng)子營(yíng)鎮(zhèn)東北臺(tái)村 B subtilis 100 HS8 南邵鎮(zhèn)姜屯村 B subtilis 99 75 H12 南邵鎮(zhèn)姜屯村 B velezensis 100 H9 趙全營(yíng)鎮(zhèn)前桑園村 Ensifer meliloti 98 57 HD10 趙全營(yíng)鎮(zhèn)前桑園村 Enterobacter cancerogenus 100 HD11 趙全營(yíng)鎮(zhèn)前桑園村 Lysinibacillus macroides 99 88 HD5 趙全營(yíng)鎮(zhèn)前桑園村 L macroides 100 HD6 潞城鎮(zhèn)大東各莊村 Pseudomonas geniculata 100 HD9 西集鎮(zhèn)王上村 Rhodococcus rhodochrous 99 88 HP5 西集鎮(zhèn)王上村 Stenotrophomonas maltophilia 99 88 HS18 興壽鎮(zhèn)西營(yíng)村 Streptomyces bobili 100 HS5 興壽鎮(zhèn)西營(yíng)村 S cyslabdanicus 100 通過(guò)主成分分析和樣品聚類分析發(fā)現(xiàn)地域因素對(duì)于番茄根際細(xì)菌群體的影響更大 即不同區(qū)域相比較 土 壤養(yǎng)分因子對(duì)微生物組成影響更顯著 但同一地區(qū) 青枯菌是根際細(xì)菌群落組裝的主要影響因子 已有報(bào) 道表明 pH 有效性養(yǎng)分磷和氮及有機(jī)質(zhì)是調(diào)節(jié)根際群落組裝的主要因素且影響病害的發(fā)生 22 26 Li 等 27 首次證明土壤磷很可能通過(guò)微生物間的相互作用來(lái)促進(jìn)青枯菌對(duì)土壤和植物系統(tǒng)的入侵 本研究對(duì)環(huán)境因 子相關(guān)性分析表明 pH 和速效磷是影響土壤細(xì)菌群落變異最顯著的環(huán)境因子 有關(guān)病原菌侵染對(duì)微生物 群落的影響 前人已有較多研究 Wei 等 8 發(fā)現(xiàn)青枯菌的侵染會(huì)導(dǎo)致非致病細(xì)菌的多樣性下降 與該研究 結(jié)果相似 本研究發(fā)現(xiàn)健康植株根際的 Chao1 Shannon Simpson 多樣性指數(shù)均高于發(fā)病土壤 可能是由 于病原菌的大量繁殖破壞了原有微生物群落的平衡 這些結(jié)果說(shuō)明在抵抗青枯菌入侵的過(guò)程中不能忽略土 壤養(yǎng)分對(duì)植株根際群落組裝的重要性 也預(yù)示著不同區(qū)域的生物防治需要采取不同的生物制劑 通過(guò)構(gòu)建群落相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)拮抗病原菌的細(xì)菌已經(jīng)成為研究微生物互作關(guān)系的有效方法 這些相關(guān) 的類群可能是病原菌的靶點(diǎn)或者是助手 10 本研究通過(guò)構(gòu)建群落相關(guān)性網(wǎng)絡(luò) 發(fā)現(xiàn) 15 個(gè)與 Ralstonia 直接 相關(guān)的菌屬 Hu 等 10 在研究根內(nèi)生潛在致病性雷爾氏菌和其他微生物成員的相互作用網(wǎng)絡(luò)時(shí)發(fā)現(xiàn)伯克氏 菌屬 Burkholderia 根瘤菌屬 Rhizobium 腸桿菌屬 Enterobacter 散生桿菌屬 Patulibacter 芽胞桿菌屬 Bacillus 和寡養(yǎng)單胞菌屬 Stenotrophomonas 等與 Ralstonia 直接相關(guān) 除此之外 本研究還發(fā)現(xiàn)另外 9 個(gè)與 Ralstonia 直接相關(guān)的菌屬 分別是索氏菌屬 Thauera 海洋芽胞桿菌屬 Oceanobacillus 侏儒囊菌屬 Nannocystis 泛 菌屬 Pantoea 柯恩氏菌屬 Cohnella 氣微菌屬 Aeromicrobium 噬冷菌屬 Algoriphagus 珊瑚球菌屬 Corallococcus 和假黃單胞菌屬 Pseudoxanthomonas 以此為參考 篩選得到 14 株對(duì)青枯菌具有拮抗能力的 菌株 分布在 9 個(gè)屬 其中芽胞桿菌屬 腸桿菌屬 寡養(yǎng)單胞菌屬 假單胞桿菌屬和鏈霉菌屬的細(xì)菌已被 用于青枯病的防治 28 此外 本研究還發(fā)現(xiàn) 3 個(gè)可以抑制青枯菌生長(zhǎng)但應(yīng)用較少的類群 無(wú)色桿菌屬 Achromobacter 劍菌屬 Ensifer 和賴氨酸芽胞桿菌屬 Lysinibacillus 這一發(fā)現(xiàn)增加了開(kāi)發(fā)微生物制劑資源 的多樣性 后續(xù)研究將重點(diǎn)通過(guò)構(gòu)建復(fù)合菌群用于青枯病的防治 參 考 文 獻(xiàn) 1 Hayward A C Biology and epidemiology of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum J Annual Review of Phytopathology 1991 29 65 87 2 Choi K Choi J Lee P A et al Alteration of bacterial wilt resistance in tomato plant by microbiota transplant J Frontiers in Plant Science 2020 11 1186 3 Scott J W Wang J F Hanson P M Breeding tomatoes for resistance to bacterial wilt a global view J Acta Horticulturae 2005 695 161 172 4 Hu J Wei Z Friman V P et al Probiotic diversity enhances rhizosphere microbiome function and plant disease suppression J Molecular Biosystems 928 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 38 卷 2016 7 6 e01790 16 5 Zhang Y Hu A Zhou J et al Comparison of bacterial communities in soil samples with and without tomato bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum species complex J BMC Microbiology 2020 20 1 89 6 Jones D L Nguyen C Finlay R D et al Carbon flow in the rhizosphere carbon trading at the soil root interface J Plant and Soil 2009 321 1 2 5 33 7 Philippot L Raaijmakers JM Lemanceau P et al Going back to the roots the microbial ecology of the rhizosphere J Nature Reviews Microbiology 2013 11 11 789 799 8 Wei Z Hu J Gu Y et al Ralstonia solanacearum pathogen disrupts bacterial rhizosphere microbiome during an invasion J Soil Biology Biochemistry 2018 118 8 17 9 Lee S M Kong H G Song G C et al Disruption of Firmicutes and Actinobacteria abundance in tomato