任敏華 張靜燕 崔曉東 等 贛南地區(qū)番茄青枯菌菌系多樣性分析 J 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 2022 43 1 67 76 REN Minhua ZHANG Jingyan CUI Xiaodong et al Diversity of Ralstonia solanacearum strains from tomato in the south of Jiangxi Province J Journal of South China Agricultural University 2022 43 1 67 76 贛南地區(qū)番茄青枯菌菌系多樣性分析 任敏華1 張靜燕2 崔曉東1 陳榮華2 劉瓊光1 3 1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院 廣東 廣州 510642 2 贛州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 江西 贛州 341000 3 廣東省微生物信號(hào)與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東 廣州 510642 摘要 目的 分離鑒定贛南地區(qū)番茄青枯病菌 明確菌系分化 為當(dāng)?shù)胤芽骨嗫莶∮N和病害防治奠定基礎(chǔ) 方法 從江西省贛南地區(qū)采集番茄青枯病病株 經(jīng)選擇性平板分離 純化和分子鑒定 獲得不同地理來(lái)源的青枯 菌Ralstonia solanacearum菌株 通過(guò)生理生化測(cè)定和接種番茄試驗(yàn) 鑒定青枯菌的生化變種和致病類(lèi)型 PCR擴(kuò)增內(nèi)切葡聚糖酶基因egl序列 明確青枯菌的演化型和序列變種 雙層平板培養(yǎng)法測(cè)定其對(duì)8個(gè)不同噬 菌體的敏感性 結(jié)果 獲得了來(lái)自贛南地區(qū)9個(gè)市 縣 的番茄青枯菌菌株44個(gè) 其中 41個(gè)菌株為生化變種 3個(gè)菌株為生化變種 致病力測(cè)定結(jié)果聚為I II和III類(lèi) 其致病力分別為強(qiáng) 中和弱 其中 強(qiáng)致病力菌株 占65 9 所有菌株屬于亞洲分支演化型 并進(jìn)一步劃分為Sequevar13 14 15 17 18 34 44和48等8個(gè) 序列變種 大部分菌株對(duì)供試的8個(gè)噬菌體敏感 結(jié)論 贛南地區(qū)番茄青枯菌以生化變種III和強(qiáng)致病力菌株 為主 對(duì)噬菌體較敏感 存在8個(gè)序列變種 具有明顯的菌系分化現(xiàn)象和遺傳多樣性 關(guān)鍵詞 茄科雷爾氏菌 番茄青枯病 生化變種 致病力 演化型 序列變種 噬菌體 中圖分類(lèi)號(hào) S436 412 1 5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001 411X 2022 01 0067 10 Diversity of Ralstonia solanacearum strains from tomato in the south of Jiangxi Province REN Minhua1 ZHANG Jingyan2 CUI Xiaodong1 CHEN Ronghua2 LIU Qiongguang1 3 1 College of Plant Protection South China Agricultural University Guangzhou 510642 China 2 Institute of Agricultural Sciences in Ganzhou Ganzhou 341000 China 3 Key Laboratory of Microbial Signals and Crop Disease Control of Guangdong Province Guangzhou 510642 China Abstract Objective Isolating and identifying Ralstonia solanacearum strains from tomato plants in the Southern of Jiangxi Province and clarifying the bacterial differentiation can lay the foundation for local tomato bacterial wilt resistance breeding and disease control Method The diseased tomato plants were collected from the south of Jiangxi Province R solanacearum strains with different geographical origins were isolated by selective plate purificated and identificated by PCR The test of physiology and biochemistry and inoculation on tomato plants were conducted for the determination of biovar and virulence difference The endoglucanase gene egl fragments were amplified by PCR to determine the phylotype and sequevar of R solanacearum Result A total of 44 R solanacearum strains were obtained from nine cities counties in the south of Jiangxi 收稿日期 2021 01 25 網(wǎng)絡(luò)首發(fā)時(shí)間 2021 06 15 11 08 45 網(wǎng)絡(luò)首發(fā)地址 作者簡(jiǎn)介 任敏華 碩士研究生 主要從事植物細(xì)菌病害研究 E mail renmishka 通信作者 陳榮華 研究 員 主要從事農(nóng)作物病害研究 E mail Chenronghua009 劉瓊光 副教授 博士 主要從事植物細(xì)菌 病害研究 E mail qgliu 基金項(xiàng)目 江西省贛州市科技項(xiàng)目 贛市財(cái)教字 2019 號(hào) 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) Journal of South China Agricultural University 2022 43 1 67 76 DOI 10 7671 j issn 1001 411X 202101041 Province among which 41 strains were identified as biovar III and three strains were identified as biovar IV According to the results of virulence difference 44 strains were clustered into three groups namely group I high virulence group II moderate virulence and group III weak virulence of which group I high virulence strains accounted for 65 9 All strains were belonged to the phylotype I and further divided into eight sequevars namely Sequevar 13 14 15 17 18 34 44 and 48 respeclively Most R solanacearum strains were sensitive to the eight tested bacteriophages Conclusion The strains of R solanacearum from tomato in the south of Jiangxi Province are mainly biovar III and high virulence sensitive to bacteriophages have eight sequevars and have obvious differentiation and genetic diversity Key words Ralstonia solanacearum Tomato bacterial wilt Biovar Virulence Phylotype Sequevar Bacteriophage 茄科雷爾氏菌Ralstonia solanacearum俗稱(chēng)青 枯菌 是危害嚴(yán)重的世界性植物病原細(xì)菌 1 廣泛分 布于熱帶 亞熱帶 溫帶地區(qū) 寄主范圍極廣 2 青 枯菌侵染番茄引起的番茄青枯病 在我國(guó)南方番茄 產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生且危害嚴(yán)重 3 4 青枯菌具有高度變異性及適應(yīng)性 菌系分化 明顯 不同菌株間基因組變異性較強(qiáng) 明確不同 來(lái)源青枯菌的致病力分化 探索青枯菌的種內(nèi)遺 傳多樣性 具有重要意義 關(guān)于青枯菌的種下分 類(lèi) Hayward等 5 華靜月等 6 根據(jù)3種雙糖和3種 己醇的利用能力不同 劃分出5個(gè)生化變種或生 化型 Prior等 7 根據(jù)地理起源的密切相關(guān)性 將青 枯菌分為4個(gè)演化型 即亞洲分支演化型 美 洲分支演化型 非洲分支演化型 和印度 尼西亞分支演化型 而在演化型內(nèi)根據(jù)內(nèi)切 葡聚糖酶 Endoglucanase 基因egl序列的差異 又 細(xì)分為多個(gè)序列變種 Sequevar 目前 國(guó)際上已 經(jīng)鑒定出51個(gè)序列變種 來(lái)自中國(guó)的青枯菌屬于 演化型 和 以及1 12 13 14 15 16 17 18 34 44和48等11個(gè)序列變種 8 盡管我國(guó)有些省 份對(duì)番茄青枯病菌有研究報(bào)道 9 但來(lái)自江西省的 番茄青枯菌菌系研究較少 近年來(lái) 在江西省贛南地區(qū)種植番茄 辣椒和 茄子等茄科蔬菜面積擴(kuò)大 發(fā)展態(tài)勢(shì)迅猛 然而 由 于青枯病的嚴(yán)重危害 給當(dāng)?shù)厥卟松a(chǎn)造成了巨大 的經(jīng)濟(jì)損失 目前 番茄青枯病的防治尚無(wú)有效的 防治藥劑 雖然有研究表明選擇合適的噬菌體或噬 菌體組合對(duì)作物青枯病具有較好的防治作用 10 12 但其應(yīng)用仍受到許多限制 選育抗病或耐病品種是 青枯病防治最經(jīng)濟(jì)有效的方法 但由于青枯菌菌系 分化明顯 且與寄主 環(huán)境之間構(gòu)成復(fù)雜的互作關(guān) 系 使得生產(chǎn)上推廣的抗病品種往往隨著種植年限 的延長(zhǎng) 青枯菌菌系致病力的變化 導(dǎo)致品種的抗 性喪失 13 15 因此 抗病育種工作任務(wù)艱巨 分離贛 南地區(qū)的番茄青枯菌菌株 建立該地區(qū)青枯菌資源 庫(kù) 明確青枯菌的生化變種 致病力 序列變種以及 對(duì)噬菌體的敏感性 將有助于解析青枯病的發(fā)生流 行機(jī)理 指導(dǎo)番茄抗青枯病育種和制定相關(guān)的病害 防治措施 1 材料與方法 1 1 供試培養(yǎng)基及噬菌體 固體培養(yǎng)基 牛肉膏3 g L 1 酵母膏3 g L 1 蛋 白胨3 g L 1 硫酸鎂0 25 g L 1 磷酸氫二鉀2 g L 1 磷酸二氫鉀0 5 g L 1 蔗糖15 g L 1 瓊脂粉18 g L 1 半固體培養(yǎng)基 牛肉膏3 g L 1 酵母膏3 g L 1 蛋白胨3 g L 1 硫酸鎂0 25 g L 1 磷酸氫二鉀2 g L 1 磷酸二氫鉀0 5 g L 1 蔗糖15 g L 1 瓊脂粉8 g L 1 LB液體培養(yǎng)基 酵母提取物5 g L 1 氯化鈉 10 g L 1 胰蛋白胨10 g L 1 生化變種鑒定基礎(chǔ)培養(yǎng)基 蛋白胨1 0 g L 1 磷 酸二氫胺 1 0 g L 1 氯化鉀 0 2 g L 1 七水硫酸鎂 0 2 g L 1 溴百里酚藍(lán)指示劑3 0 ml L 1 pH調(diào)至7 0 2 3 5 三苯基氯化四氮唑 TTC 培養(yǎng)基 水解 干酪素1 g L 1 蛋白胨10 g L 1 甘油5 mL L 1 瓊 脂粉32 g L 1 使用前 每1 L培養(yǎng)基加5 mL 質(zhì)量 濃度為10 g L 1的TTC溶液 牛肉膏蛋白胨 NA 液體培養(yǎng)基 牛肉浸膏3 g L 1 葡萄糖10 g L 1 蛋白胨5 g L 1 酵母粉0 5 g L 1 pH調(diào)至7 0 供試噬菌體 編號(hào)分別為P1556 1 P1556 2 P7 1 P574 P1521 P1555 L P1555 1和P1555 M 分離自江西 廣東等地作物青枯病土壤 由華南農(nóng) 業(yè)大學(xué)植物細(xì)菌研究室提供并保存 1 2 青枯菌的分離純化與保存 2019 2020年 在番茄青枯病發(fā)病高峰期間 68 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 第 43 卷 前往江西省贛南地區(qū)各市 縣區(qū)采集番茄青枯病標(biāo) 本 用TTC選擇性培養(yǎng)基分離青枯菌 30 條件下 培養(yǎng)24 48 h 挑取青枯菌典型單菌落 在TTC平 板上劃線純化 繼代3次 獲得純化菌株 用青枯菌 特異性引物759 5 GTCGCCGTCAACTCACTTTCC 3 和760 5 GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG 3 7 進(jìn)行PCR鑒定 將擴(kuò)增得到280 bp特異目的片段的 青枯菌菌株 80 甘油保存 同時(shí) 用細(xì)菌基因 組DNA提取試劑盒 提取各菌株DNA 20 保 存?zhèn)溆?1 3 青枯菌生化變種測(cè)定 參照Hayward等 5 華靜月等 6 方法 分別將 乳糖 甘露醇 山梨醇和甜醇加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中 質(zhì) 量濃度均為10 g L 1 分裝試管 每管4 5 mL 110 條件下滅菌20 min 纖維二糖和麥芽糖經(jīng)過(guò)濾滅菌 后 分別加入滅菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中 質(zhì)量濃度為 10 g L 1 每個(gè)菌株每種化合物接種3支試管 以不 接種青枯菌為對(duì)照 28 條件下培養(yǎng)21 d 1 4 青枯菌致病性測(cè)定及數(shù)據(jù)處理 參照何自福等 16 的方法 選擇對(duì)青枯病表現(xiàn)不 同抗性的5個(gè)番茄品種 分別為紅圣佳二號(hào) 抗 病 金艷 中抗 多寶 中抗 粉霸 感病 和精棚 T紅 高感 作為致病性分化的鑒別品種 將健康 番茄種子播于穴盤(pán)消毒基質(zhì)中 待4 5片葉苗齡時(shí) 用于接種 采用浸根接種方法 將番茄根部浸于 1 108 CFU mL 1青枯菌懸液中 15 min后移栽到盆 缽中 每盆種2株 以浸無(wú)菌水的植株為空白對(duì)照 每個(gè)菌株接種每個(gè)番茄品種20株 定期記錄發(fā)病 情況 接種后第45天 各處理病情穩(wěn)定 統(tǒng)計(jì)發(fā)病 率 采用離差平均和的系統(tǒng)聚類(lèi)方法 即Ward聚 類(lèi) 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)分析 1 5 egl基因擴(kuò)增和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 內(nèi)源葡聚糖酶基因 egl基因 擴(kuò)增引物 Endo F 5 ATGCATGCCGCTGGTCGCCGC 3 和Endo R 5 GCGTTGCCCGGCACGAACACC 3 PCR擴(kuò) 增反應(yīng)程序 96 預(yù)變性9 min 95 變性1 min 70 退火1 min 72 延伸2 min 30個(gè)循環(huán) 72 延伸10 min 擴(kuò)增產(chǎn)物交由睿博興科生物技 術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序 將序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù) 并與相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì) 參考序列信息見(jiàn)表1 用 Clustalx和MEGA軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析 采用 Jukes and Cantor模型鄰接法 Neighbor joining 表 1 參考序列信息 Table 1 Referenced sequence information 參考菌株 Reference strain 寄主 Host 來(lái)源 Origin 演化型 Phylotype 序列變種 Sequevar egl登錄號(hào) Accession number JT523馬鈴薯 Solanum tuberosum留尼汪島 Reunion 13 AF295252 PSS8番茄 S lycopersicum中國(guó) China 14 FJ561066 PSS358番茄 S lycopersicum中國(guó) China 15 EU407298 UW151姜 Zingiber officinale澳大利亞 Australia 16 AF295254 P11花生 Arachis hypogaea中國(guó) China 17 FJ561068 GMI1000番茄 S lycopersicum法國(guó) France 18 AF295251 JT519天竺葵 Pelargonium hortorum留尼汪島 Reunion 31 GU295032 PSS219番茄 S lycopersicum中國(guó) China 34 FJ561167 O3橄欖樹(shù) Olea europaea中國(guó) China 44 FJ561069 TB28煙草 Nicotiana tabacum中國(guó) China 44 FJ561127 Tb43煙草 N tabacum中國(guó) China 44 FJ561129 BdlI木槿 Hibiscus syriacus中國(guó) China 44 FJ561098 CIIP365馬鈴薯 S tuberosum菲律賓 The Philippines 45 GQ907151 MADI7辣椒 Capsicum annuum馬達(dá)加斯加 Madagascar 46 GU295040 GMI8254番茄 S lycopersicum印度尼西亞 Indonesia 47 GU295014 M2桑樹(shù) Morus alba中國(guó) China 48 FJ561067 CMR87番茄 S lycopersicum喀麥隆 Cameroon 35 EF439727 CMR12番茄 S lycopersicum喀麥隆 Cameroon 52 EF439725 CMR39番茄 S lycopersicum喀麥隆 Cameroon 41 EF439726 CFBP2972馬鈴薯 S tuberosum馬提尼克 Martinique 35 EF371809 UW551天竺葵 P hortorum肯尼亞 Kenya 1 DQ657596 ICMIP7963馬鈴薯 S tuberosum肯尼亞 Kenya 7 AF295263 第 1 期 任敏華 等 贛南地區(qū)番茄青枯菌菌系多樣性分析 69 NJ 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) 1 000次重復(fù)Bootstrap統(tǒng)計(jì) 學(xué)檢驗(yàn)后構(gòu)建發(fā)育樹(shù) 1 6 噬菌體敏感性測(cè)定 噬菌體培養(yǎng) 在15 mL的LB液體培養(yǎng)基中 將 青枯菌與噬菌體按照體積比1 1混勻 在30 180 r min 1條件下培養(yǎng)過(guò)夜 雙層平板制備 取青枯菌菌液100 L加入15 mL 50 的半固體培養(yǎng)基 迅速混勻倒入固體培養(yǎng)基 平板上 制成雙層平板 點(diǎn)接3 L噬菌體液 30 條件下培養(yǎng)24 h 觀察噬菌斑產(chǎn)生情況 根據(jù)青枯 菌被侵染的噬菌體數(shù)量 n 個(gè) 判別青枯菌對(duì)噬菌體 的敏感性 標(biāo)準(zhǔn) n 2 敏感性弱 3 n 5 敏感性 中等 6 n 7 敏感性強(qiáng) n 8 敏感性特強(qiáng) 2 結(jié)果與分析 2 1 青枯菌的分離純化 2019 2020年 在江西省贛南地區(qū)各市 縣番 茄種植地均有青枯病發(fā)生 采集自于都 上猶 石 城 瑞金等9個(gè)縣 市 的番茄青枯病病株中 共分 離和鑒定出44個(gè)青枯菌株 其中于都縣9個(gè) 上猶 縣7個(gè) 石城縣4個(gè) 瑞金市2個(gè) 大余縣3個(gè) 安 遠(yuǎn)縣3個(gè) 會(huì)昌縣6個(gè) 興國(guó)縣2個(gè) 全南縣8個(gè) 2 2 青枯菌的生化變種鑒定 根據(jù)對(duì)6種碳水化合物的利用情況 表2 44個(gè)番茄青枯菌可劃分為生化變種 和 其中 來(lái)自大余縣的3個(gè)青枯菌菌株為生化變種 其余 的41個(gè)青枯菌均為生化變種 表明贛南地區(qū)番 續(xù)表 1 Continued table 1 參考菌株 Reference strain 寄主 Host 來(lái)源 Origin 演化型 Phylotype 序列變種 Sequevar egl登錄號(hào) Accession number UW162香蕉 Musa nana秘魯 Peru 4 AF295256 MOLK2香蕉 M nana菲律賓 The Philippines 3 EF371841 CMR66木龍葵 S scabrum喀麥隆 Cameroon 49 EF439729 JT525天竺葵 P hortorum留尼汪島 Reunion 19 AF295272 CFBP3059茄子 S melongena布基納法索 Burkina Faso 23 AF295270 NCPPB332馬鈴薯 S tuberosum津巴布韋 Zimbabwe 22 DQ657649 MAFF301558馬鈴薯 S tuberosum日本 Japan 8 AY465002 Psi番茄 S lycopersicum印度尼西亞 Indonesia 10 EF371804 ACH732番茄 S lycopersicum澳大利亞 Australia 11 GQ907150 表 2 青枯菌生化變種鑒定1 Table 2 Biovar identification of Ralstonia solanacearum 來(lái)源 Origin 菌株編號(hào) No of strain 菌株數(shù) 個(gè) Strain quantity 麥芽糖 Maltose 纖維二糖 Cellobiose 乳糖 Lactose 甘露醇 Mannitol 山梨醇 Sorbitol 甜醇 Dulcitol 生化變種 Biovar 于都縣 Yudu County Tm1901 Tm1908 Tm1920 Tm1924 9 上猶縣 Shangyou County Tm1913 Tm1919 7 石城縣 Shicheng County Tm1925 Tm1929 4 瑞金市 Ruijin City Tm1930 Tm1931 2 大余縣 Dayu County Tm1932 Tm1934 3 安遠(yuǎn)縣 Anyuan County Tm1935 Tm1937 3 會(huì)昌縣 Huichang County Tm1938 Tm1943 6 興國(guó)縣 Xingguo County Tm2046 Tm2047 2 全南縣 Quannan County Tm1944 Tm1945 Tm2048 Tm2058 8 1 表示被利用 表示不被利用 1 indicates to be used indicates not to be used 70 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 第 43 卷 茄青枯菌以生化變種 為主 2 3 青枯菌的致病力測(cè)定 青枯菌接種紅圣佳二號(hào) 抗病 金艷 中抗 多 寶 中抗 粉霸 感病 精棚T紅 高感 5個(gè)抗性程 度不同的番茄品種 結(jié)果表明 44個(gè)菌株在不同的 番茄品種上的致病力存在明顯差異 表3 表 3 44個(gè)青枯菌接種5個(gè)番茄品種的發(fā)病率及聚類(lèi)分組 Table 3 Incidence of 44 Ralstonia solanacearum strains inoculated to five tomato cultivars and their clustering results 來(lái)源 Origin 菌株編號(hào) No of strain 發(fā)病率 Incidence rate聚類(lèi)分組 Cluster紅圣佳2號(hào)Hongshengjia 2金艷Jinyan多寶Duobao粉霸Fenba精棚T紅Jingpeng T red 于都縣 Yudu County Tm1901 55 80 95 100 95 Tm1902 90 85 75 100 100 Tm1903 85 80 95 100 100 Tm1904 90 95 70 100 100 Tm1907 85 75 80 100 100 Tm1908 37 65 60 72 90 上猶縣 Shangyou County Tm1913 90 70 90 100 90 Tm1914 95 75 85 95 100 Tm1915 85 75 95 90 100 Tm1916 60 75 90 85 95 Tm1917 40 70 85 90 100 Tm1918 50 70 95 90 100 Tm1919 0 5 15 40 65 于都縣 Yudu County Tm1920 80 85 80 90 90 Tm1923 50 80 95 68 95 Tm1924 80 95 85 85 100 石城縣 Shicheng County Tm1925 65 85 85 95 85 Tm1926 95 100 90 100 100 Tm1928 80 75 100 95 100 Tm1929 35 21 40 50 95 瑞金市 Ruijin City Tm1930 90 95 95 100 100 Tm1931 100 100 100 100 100 大余縣 Dayu County Tm1932 20 35 65 45 80 Tm1933 35 35 55 80 90 Tm1934 20 40 75 60 100 安遠(yuǎn)縣 Anyuan County Tm1935 40 52 85 95 100 Tm1936 30 35 90 80 89 Tm1937 85 95 90 100 95 會(huì)昌縣 Huichang County Tm1938 90 85 95 100 100 Tm1939 80 85 95 100 95 Tm1940 85 90 100 95 100 Tm1941 100 84 100 100 100 Tm1942 95 100 100 100 95 Tm1943 40 85 95 90 100 全南縣 Quannan County Tm1944 100 100 95 100 100 Tm1945 100 90 100 90 100 興國(guó)縣 Xingguo County Tm2046 100 100 100 100 100 Tm2047 100 100 100 100 100 全南縣 Quannan County Tm2048 100 95 100 100 89 Tm2049 100 95 100 100 90 Tm2050 100 95 100 100 100 Tm2054 100 100 100 100 100 Tm2055 100 95 100 100 100 Tm2058 90 90 100 100 100 第 1 期 任敏華 等 贛南地區(qū)番茄青枯菌菌系多樣性分析 71 采用系統(tǒng)聚類(lèi)中的離差平均和的聚類(lèi)方法 即 Ward聚類(lèi) 對(duì)44個(gè)菌株接種5個(gè)番茄品種的青枯 病發(fā)病率結(jié)果進(jìn)行聚類(lèi)分析 明確青枯菌之間的致 病力差異 采用離差平均和方法 樣本間的距離采 用歐氏距離 該距離數(shù)值的大小反映樣本之間的相 似度 數(shù)值越小 2個(gè)樣本之間的相似度越高 數(shù)值 越大 則相似度越低 本研究以歐氏距離1 2為參 考標(biāo)準(zhǔn) 將44個(gè)青枯菌聚為3個(gè)組 圖1 第 組 共有29個(gè)菌株 分別來(lái)自除大余縣外的8個(gè)縣 市 第 組的7個(gè)菌株分離自于都 上猶 石城 會(huì) 昌4個(gè)縣 該組致病力為中等強(qiáng)度 第 組的8個(gè) 菌株分離自于都 上猶 石城 大余 安遠(yuǎn)5個(gè)縣 致 病力弱 其中來(lái)自上猶縣的Tm1919致病力最弱 上述結(jié)果表明 贛南地區(qū)番茄青枯菌致病力分化現(xiàn) 象明顯 在于都 上猶和石城縣均存在致病力強(qiáng) 中 弱3種類(lèi)型的菌株 但總體來(lái)看 贛南地區(qū)番茄 青枯菌以致病較強(qiáng)的菌株占優(yōu)勢(shì) 2 4 青枯菌序列變種及系統(tǒng)發(fā)育分析 44個(gè)青枯菌的egl基因片段序列與標(biāo)準(zhǔn)參考菌 株進(jìn)行比對(duì) 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) 圖2 結(jié)果表明 江 西省贛南地區(qū)的番茄青枯菌屬于亞洲分支 演化型 I Phylotype 的8個(gè)序列變種 Sequevar 其中 Tm1929 Tm1935和Tm1937與馬鈴薯青枯菌 JT523 留尼汪島 屬于Sequevar 13 Tm1908 Tm1920 Tm1923 Tm1924 Tm1930 Tm1931 Tm1933 Tm1934 Tm1940 Tm1943 Tm2046 Tm2054共14個(gè)菌株與來(lái)自中國(guó)的番茄青枯菌 PSS8屬于Sequevar 14 Tm1925 Tm1928 Tm1932 Tm2055和Tm2058與來(lái)自中國(guó)的番茄青枯菌 PSS358屬于Sequevar 15 Tm1913 Tm1919 Tm1931 Tm2046 Tm2047 Tm2054 Tm1944 Tm2050 Tm2055 Tm1942 Tm2049 Tm2048 Tm1945 Tm1941 Tm1930 Tm1937 Tm1926 Tm1938 Tm1903 Tm1939 Tm1940 Tm2058 Tm1928 Tm1915 Tm1914 Tm1907 Tm1913 Tm1904 Tm1902 Tm1920 Tm1924 Tm1917 Tm1918 Tm1943 Tm1923 Tm1916 Tm1901 Tm1925 Tm1908 Tm1933 Tm1936 Tm1935 Tm1934 Tm1932 Tm1929 Tm1919 0 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 歐氏距離 Euclidean distance 圖 1 基于44個(gè)青枯菌接種5個(gè)番茄品種發(fā)病率的聚類(lèi)分析結(jié)果 Fig 1 Clustering results based on the incidence of 44 Ralstonia solanacearum strains inoculated to five tomato cultivars 72 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 第 43 卷 Tm2047共8個(gè)菌株與來(lái)自中國(guó)的花生青枯菌 P11屬于Sequevar 17 Tm1901 Tm1904 Tm1907 Tm1926 Tm1938 Tm1939共8個(gè)菌株與來(lái)自法國(guó) 的番茄青枯菌GMI1000均為Sequevar 18 Tm1944 與來(lái)自中國(guó)臺(tái)灣的番茄青枯菌PSS219為Sequevar 34 Tm1936與來(lái)自中國(guó)的煙草青枯菌Tb28為 Sequevar 44 Tm1945 Tm2048 Tm2050共4個(gè)菌株 與來(lái)自中國(guó)的桑青枯菌M2同為Sequevar 48 GMI1000 Sequevar18 MADI7 Sequevar46 GMI8254 Sequevar47 Tm1945 Tm2048 49 50 M2 Sequevar48 Tm1913 14 15 16 17 18 19 Tm2047 P11 Sequevar17 CIIP365 Sequevar45 Tm1929 35 37 JT523 Sequevar13 JT519 Sequevar31 Tm1908 20 23 24 30 31 33 34 40 41 42 43 Tm2046 54 PSS8 Sequevar14 Tm1936 Tb28 Sequevar44 Tm1944 PSS219 Sequevar34 Tm1925 28 32 Tm2055 58 PSS358 Sequevar15 UW151 Sequevar16 MAFF301558 Sequevar8 Psi Sequevar10 ACH732 Sequevar11 CMR66 Sequevar49 CFBP3059 Sequevar23 JT525 Sequevar19 NCPPB332 Sequevar22 UW551 Sequevar1 MOLK2 Sequevar3 UW162 Sequevar4 ICMIP7963 Sequevar7 CMR39 Sequevar41 CMR87 Sequevar35 CMR12 Sequevar52 0 01 演化型 Phylotype 演化型 Phylotype 演化型 Phylotype 演化型 Phylotype Tm1901 02 03 04 07 26 38 39 將序列變種相同的菌株置于同一水平分支上 代表參考菌株 Strains with the same sequevar are settled at the same branch indicates reference strain 圖 2 基于青枯菌egl基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析 Fig 2 Phylogenetic analysis based on sequence of egl gene of Ralstonia solanacearum 第 1 期 任敏華 等 贛南地區(qū)番茄青枯菌菌系多樣性分析 73 2 5 青枯菌序列變種 Sequevar 的地理分布 在所分離的44個(gè)番茄青枯菌中 Sequevar 14共有14個(gè)菌株 分布于于都 瑞金 大余 會(huì)昌 興國(guó) 全南6個(gè)縣 市 Sequevar 18有8個(gè)菌株 分 布于會(huì)昌 石城 于都3個(gè)縣 Sequevar 17有8個(gè)菌 株 其中7個(gè)分布于上猶縣 1個(gè)來(lái)自興國(guó)縣 Sequevar 15有5個(gè)菌株 來(lái)自于石城 大余 全南 3個(gè)縣 Sequevar 48的4個(gè)菌株 全部來(lái)自全南縣 Sequevar 13有3個(gè)菌株 分布于石城和安遠(yuǎn)縣 Sequevar 34和Sequevar 44各有1個(gè)菌株 分別來(lái) 自全南和安遠(yuǎn)縣 上述結(jié)果表明 贛南地區(qū)番茄青 枯菌序列變種存在豐富的多樣性 2 6 青枯菌對(duì)噬菌體的敏感性測(cè)定 雙層平板法檢測(cè)8個(gè)噬菌體裂解青枯菌的試 驗(yàn)結(jié)果 表4 表明 44個(gè)番茄青枯菌中 只有菌株 Tm2047對(duì)噬菌體的敏感性弱 有12個(gè)菌株對(duì)噬菌 體的敏感性表現(xiàn)為中等 有4個(gè)菌株對(duì)噬菌體的敏 感性較強(qiáng) 另有27個(gè)菌株都能被8個(gè)噬菌體裂解 其敏感性表現(xiàn)為特強(qiáng) 上述結(jié)果表明 贛南地區(qū)番 茄青枯菌對(duì)噬菌體普遍表現(xiàn)敏感 表 4 44個(gè)青枯菌對(duì)8個(gè)噬菌體的敏感性測(cè)定 Table 4 Sensitivity determination of 44 Ralstonia solanacearum to eight bacteriophages 來(lái)源 Origin 菌株編號(hào) No of strain 數(shù)量 個(gè) Quantity 噬菌體1 Bacteriophage敏感性2 SensitivityP1555 L P1555 1 P1555 M P1556 1 P1556 2 P7 1 P574 P1521 于都縣 Yudu County Tm1901 Tm1907 5 M Tm1908 1 V 上猶縣 Shangyou County Tm1913 Tm1914 2 S Tm1915 Tm1919 4 V Tm1916 1 S 于都縣 Yudu County Tm1920 Tm1924 3 V 石城縣 Shicheng County Tm1925 Tm1929 3 V Tm1928 1 S 瑞金市 Ruijin City Tm1930 Tm1931 2 V 大余縣 Dayu County Tm1932 Tm1934 3 V 安遠(yuǎn)縣 Anyuan County Tm1935 Tm1937 3 V 會(huì)昌縣 Huichang County Tm1938 Tm1939 2 M Tm1940 Tm1943 4 V 全南縣 Quannan County Tm1944 1 M Tm1945 1 M 興國(guó)縣 Xingguo County Tm2046 1 V Tm2047 1 W 全南縣 Quannan County Tm2048 Tm2049 2 M Tm2050 1 M Tm2054 Tm2058 3 V 1 表示產(chǎn)生噬菌斑 表示不產(chǎn)生噬菌斑 2 M 中等 S 強(qiáng) V 特強(qiáng) W 弱 1 indicates having plaques indicates no having plaques 2 M Moderate S Strong V Very strong W Weak 3 討論與結(jié)論 不同地理來(lái)源的青枯菌在與寄主長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn) 化的過(guò)程中 演化出明顯的生理分化型或菌系多樣 性 國(guó)外報(bào)道 番茄青枯菌屬于1號(hào)生理小種 分為 演化型 和 17 18 生化變種 II III和 IV 19 20 存在Sequevar 1 4 5 6 7 8 9 10 11 13 14 15 18 20 29 31 35 41 38 39 46 52等22個(gè) 序列變種 21 23 在我國(guó) 已報(bào)道的番茄青枯菌屬于 1號(hào)生理小種 演化型 分為生化變種II III和 74 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 第 43 卷 IV 存在Sequevar13 14 15 16 17 18 34 44 48和54等10個(gè)序列變種 24 25 曾憲銘等 26 曾測(cè)定 廣東省13種農(nóng)作物上的129個(gè)青枯菌 其生化變 種鑒定為 及其亞型 其中番茄青枯菌 為生化變種 和 鄭向華等 27 也獲得類(lèi)似的研究 結(jié)果 將番茄青枯菌鑒定為生化變種 2009年 Xu等 28 基于演化型分類(lèi)框