R e s p o n s e c h a r a c t e r i s t i c s o f s o i l f u n g i t o m e t a m s o d i u m f u m i g a t i o n Z H A O X i a o d o n g 1 2 Z H A O P e n g y u 1 L I X i a o j i n g 2 Y A N P i n g m e i 1 R E N T i a n z h i 2 L I Y o n g t a o 3 1 D e p a r t m e n t o f B i o l o g y T a i y u a n N o r m a l U n i v e r s i t y Y u c i 0 3 0 6 1 9 C h i n a 2 A g r o E n v i r o n m e n t a l P r o t e c t i o n I n s t i t u t e M i n i s t r y o f A g r i c u l t u r e a n d R u r a l A f f a i r s K e y L a b o r a t o r y o f O r i g i n a l A g r o E n v i r o n m e n t a l P o l l u t i o n P r e v e n t i o n a n d C o n t r o l T i a n j i n K e y L a b o r a t o r y o f A g r o E n v i r o n m e n t a n d A g r o P r o d u c t S a f e t y T i a n j i n 3 0 0 1 9 1 C h i n a 3 C o l l e g e o f N a t u r a l R e s o u r c e s a n d E n v i r o n m e n t S o u t h C h i n a A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y G u a n g z h o u 5 1 0 6 4 2 C h i n a A b s t r a c t I n o r d e r t o r e v e a l t h e e f f e c t o f f u m i g a n t s o n t h e s o i l e c o s y s t e m t h e v a r i a t i o n i n t h e s o i l f u n g a l c o m m u n i t y c o m p o s i t i o n a n d t h e i n t e r s p e c i f i c r e l a t i o n s h i p s a f t e r f u m i g a t i o n w e r e e x p l o r e d M e t a m s o d i u m w a s s e l e c t e d a s a t y p i c a l f u m i g a n t f o r t h e s o i l o f c u c u m b e r c o n t i n u o u s l y c r o p p e d f o r t h r e e y e a r s A f t e r d i f f e r e n t p e r i o d s t h e f u n g a l c o m m u n i t i e s i n e a c h t r e a t m e n t w e r e d e t e c t e d b y h i g h t h r o u g h p u t s e q u e n c i n g C o m p a r e d w i t h t h e n o n f u m i g a t i o n t r e a t m e n t N M t h e C h a o 1 i n d e x d e c r e a s e d b y 1 4 P 0 0 0 1 a n d 1 6 P 0 0 0 5 i n t h e f u m i g a t i o n t r e a t m e n t w i t h a l o w c o n c e n t r a t i o n L M 5 0 m g k g 1 a n d a h i g h c o n c e n t r a t i o n o f m e t a m s o d i u m H M 1 0 0 m g k g 1 r e s p e c t i v e l y T h e d i s c r e p a n c y i n t h e f u n g a l c o m m u n i t y s t r u c t u r e s a s a r e s u l t o f t h e d i f f e r e n t t r e a t m e n t s w a s a l s o s i g n i f i c a n t T h e g e n e r a G i b b e r e l l a a n d F u s a r i u m t y p i c a l p o t e n t i a l l y p a t h o g e n i c f u n g i o f t h e s o i l w e r e i n h i b i t e d b y m e t a m s o d i u m f u m i g a t i o n e s p e c i a l l y i n t h e 2 0 2 1 4 0 3 5 8 0 5 9 0 2 0 2 1 年 3 月 趙 曉 東 趙 鵬 宇 李 曉 晶 等 土 壤 真 菌 對 威 百 畝 熏 蒸 的 響 應 特 征 J 農(nóng) 業(yè) 環(huán) 境 科 學 學 報 2 0 2 1 4 0 3 5 8 0 5 9 0 Z H A O X i a o d o n g Z H A O P e n g y u L I X i a o j i n g e t a l R e s p o n s e c h a r a c t e r i s t i c s o f s o i l f u n g i t o m e t a m s o d i u m f u m i g a t i o n J J o u r n a l o f A g r o E n v i r o n m e n t S c i e n c e 2 0 2 1 4 0 3 5 8 0 5 9 0 趙 曉 東 1 2 趙 鵬 宇 1 李 曉 晶 2 燕 平 梅 1 任 天 志 2 李 永 濤 3 1 太 原 師 范 學 院 生 物 系 山 西 榆 次 0 3 0 6 1 9 2 農(nóng) 業(yè) 農(nóng) 村 部 環(huán) 境 保 護 科 研 監(jiān) 測 所 農(nóng) 業(yè) 農(nóng) 村 部 產(chǎn) 地 環(huán) 境 污 染 防 控 重 點 實 驗 室 天 津 市 農(nóng) 業(yè) 環(huán) 境 與 農(nóng) 產(chǎn) 品 安 全 重 點 實 驗 室 天 津 3 0 0 1 9 1 3 華 南 農(nóng) 業(yè) 大 學 資 源 環(huán) 境 學 院 廣 州 5 1 0 6 4 2 2 0 2 0 1 1 1 7 2 0 2 1 0 1 2 5 趙 曉 東 1 9 9 0 男 山 西 武 鄉(xiāng) 人 博 士 講 師 主 要 從 事 土 壤 污 染 與 植 物 病 害 防 控 技 術 研 究 E m a i l 1 5 1 1 0 6 7 2 5 6 0 1 6 3 c o m 李 曉 晶 E m a i l l i x i a o j i n g c a a s c n 國 家 自 然 科 學 基 金 項 目 4 2 0 0 7 1 2 1 4 0 8 7 1 1 3 1 山 西 省 重 點 研 發(fā) 項 目 2 0 1 6 0 3 D 2 2 1 0 0 8 1 P r o j e c t s u p p o r t e d T h e N a t i o n a l N a t u r a l S c i e n c e F o u n d a t i o n o f C h i n a 4 2 0 0 7 1 2 1 4 0 8 7 1 1 3 1 T h e K e y P r o g r a m o f S h a n x i P r o v i n c e 2 0 1 6 0 3 D 2 2 1 0 0 8 1 為 探 明 土 壤 熏 蒸 后 真 菌 群 落 的 演 變 特 征 及 其 種 間 關 系 的 變 化 規(guī) 律 以 揭 示 熏 蒸 劑 對 土 壤 生 態(tài) 系 統(tǒng) 的 利 害 關 系 選 取 威 百 畝 作 為 典 型 熏 蒸 劑 對 連 作 3 年 黃 瓜 的 土 壤 進 行 熏 蒸 處 理 并 采 用 高 通 量 測 序 手 段 檢 測 了 各 處 理 在 不 同 時 段 的 真 菌 群 落 與 未 熏 蒸 對 照 處 理 N M 相 比 C h a o 1 指 數(shù) 在 低 濃 度 L M 5 0 m g k g 1 和 高 濃 度 威 百 畝 熏 蒸 處 理 H M 1 0 0 m g k g 1 中 分 別 降 低 了 1 4 P 0 0 0 1 和 1 6 P 0 0 0 5 各 處 理 真 菌 群 落 結(jié) 構(gòu) 的 差 異 也 達 顯 著 水 平 供 試 土 壤 中 潛 在 典 型 病 原 真 菌 主 要 為 G i b b e r e l l a 和 F u s a r i u m 且 受 到 威 百 畝 熏 蒸 的 顯 著 抑 制 尤 其 在 H M 處 理 中 其 豐 度 較 N M 處 理 分 別 降 低 了 9 5 和 5 3 P 0 0 5 而 潛 在 典 型 有 益 菌 如 T a l a r o m y c e s 和 A r t h r o g r a p h i s 展 現(xiàn) 出 與 潛 在 病 原 菌 相 反 的 趨 勢 且 這 種 趨 勢 在 H M 處 理 中 更 明 顯 隨 著 培 養(yǎng) 時 間 延 長 雖 然 G i b b e r e l l a 和 F u s a r i u m 在 L M 處 理 中 展 現(xiàn) 出 抑 制 恢 復 的 趨 勢 但 在 H M 處 理 中 其 豐 度 隨 時 間 逐 漸 降 低 N e t w o r k 關 聯(lián) 分 析 結(jié) 果 顯 示 在 N M 處 理 中 各 功 能 菌 豐 度 間 均 為 正 相 關 關 系 而 高 濃 度 威 百 畝 熏 蒸 后 出 現(xiàn) 了 優(yōu) 勢 菌 對 潛 在 病 原 菌 的 拮 抗 作 用 綜 上 所 述 相 比 于 低 濃 度 威 百 畝 熏 蒸 高 濃 度 威 百 畝 不 僅 有 效 抑 制 了 土 壤 中 潛 在 病 原 真 菌 的 活 性 而 且 還 通 過 調(diào) 控 真 菌 群 落 種 間 關 系 從 而 強 化 了 優(yōu) 勢 菌 對 潛 在 病 原 真 菌 的 拮 抗 作 用 進 而 間 接 地 增 強 了 部 分 有 益 菌 的 活 性 威 百 畝 土 壤 植 物 病 原 真 菌 群 落 組 成 種 間 關 系 薰 蒸 劑 S 4 7 2 A 1 6 7 2 2 0 4 3 2 0 2 1 0 3 0 5 8 0 1 1 d o i 1 0 1 1 6 5 4 j a e s 2 0 2 0 1 3 3 3 開 放 科 學 O S I D J o u r n a l o f A g r o E n v i r o n m e n t S c i e n c e趙 曉 東 等 土 壤 真 菌 對 威 百 畝 熏 蒸 的 響 應 特 征 2 0 2 1 3 w w w a e s o r g c n 由 土 壤 中 植 物 病 原 菌 引 起 的 土 傳 病 害 極 大 地 威 脅 著 全 球 的 農(nóng) 產(chǎn) 品 質(zhì) 量 與 安 全 在 蔬 菜 種 植 土 壤 中 尤 為 嚴 重 1 2 常 見 的 土 傳 病 害 包 括 病 原 真 菌 病 原 細 菌 和 線 蟲 易 發(fā) 生 土 傳 病 害 的 蔬 菜 主 要 有 茄 子 番 茄 芹 菜 黃 瓜 和 辣 椒 等 3 對 河 南 設 施 蔬 菜 大 棚 的 調(diào) 查 發(fā) 現(xiàn) 土 傳 病 害 嚴 重 程 度 隨 著 蔬 菜 連 作 年 限 的 延 長 而 增 大 病 害 種 類 主 要 包 括 根 結(jié) 線 蟲 病 根 腐 病 莖 基 腐 病 和 青 枯 病 發(fā) 病 率 分 別 達 8 5 5 4 2 6 和 1 8 4 因 此 采 取 有 效 措 施 降 低 植 物 土 傳 病 害 至 關 重 要 生 物 防 治 和 化 學 土 壤 熏 蒸 消 毒 是 當 前 防 治 植 物 土 傳 病 害 的 兩 大 關 鍵 技 術 3 5 其 中 生 物 防 治 技 術 主 要 由 有 益 微 生 物 介 導 通 過 浸 種 蘸 根 混 土 等 途 徑 接 種 6 目 前 已 經(jīng) 成 功 研 發(fā) 多 種 生 物 防 治 劑 如 產(chǎn) 紫 籃 狀 菌 T a l a r o m y c e s s p 7 木 霉 菌 T r i c h o d e r m a s p 8 和 芽 孢 桿 菌 B a c i l l u s s p 9 并 實 現(xiàn) 了 對 土 傳 病 害 的 預 防 然 而 雖 然 生 物 防 治 具 有 環(huán) 境 友 好 性 但 該 技 術 對 土 傳 病 害 相 對 較 弱 的 防 治 效 果 導 致 它 目 前 很 難 完 全 替 代 土 壤 熏 蒸 消 毒 技 術 土 壤 熏 蒸 劑 是 指 施 入 土 壤 后 能 夠 產(chǎn) 生 具 有 殺 滅 農(nóng) 業(yè) 病 蟲 草 害 能 力 的 氣 體 從 而 在 人 為 密 閉 環(huán) 境 中 防 治 土 傳 病 害 的 一 類 農(nóng) 藥 1 0 繼 溴 甲 烷 被 禁 止 使 用 后 威 百 畝 氯 化 苦 二 甲 基 二 硫 和 1 3 二 氯 丙 烯 等 物 質(zhì) 成 為 替 代 溴 甲 烷 的 常 見 土 壤 熏 蒸 劑 且 在 防 治 土 傳 病 害 方 面 取 得 了 顯 著 的 成 效 1 1 1 3 例 如 采 用 滴 灌 法 將 氯 化 苦 4 0 g m 2 施 入 種 植 辣 椒 的 土 壤 后 對 辣 椒 黃 萎 病 的 控 制 效 率 達 8 0 9 6 同 時 辣 椒 根 腐 病 也 得 到 有 效 控 制 1 4 采 用 威 百 畝 二 甲 基 二 硫 組 合 熏 蒸 方 式 能 夠 極 大 地 抑 制 黃 瓜 病 原 菌 如 M e l o i d o g y n e s p F u s a r i u m s p 和 P h y t o p h t h o r a s p 的 豐 度 黃 瓜 產(chǎn) 量 和 經(jīng) 濟 收 入 較 對 照 處 理 分 別 增 加 了 7 7 1 2 3 和 1 0 0 1 3 0 1 5 土 壤 熏 蒸 劑 也 可 能 在 一 定 程 度 上 引 起 環(huán) 境 的 污 染 一 方 面 由 于 大 部 分 替 代 溴 甲 烷 的 熏 蒸 劑 依 舊 具 有 一 定 的 揮 發(fā) 性 這 會 對 大 氣 環(huán) 境 造 成 潛 在 的 威 脅 1 6 然 而 通 過 薄 膜 覆 蓋 水 封 滴 灌 添 加 生 物 炭 等 措 施 可 很 大 程 度 地 降 低 其 向 大 氣 環(huán) 境 的 釋 放 1 7 1 9 例 如 鐵 改 性 生 物 炭 可 以 活 化 過 氧 化 尿 素 產(chǎn) 生 O H 自 由 基 從 而 有 效 促 進 吸 附 在 生 物 炭 上 的 1 3 二 氯 丙 烯 的 降 解 其 殘 余 的 順 式 異 構(gòu) 體 從 3 3 下 降 至 1 1 1 9 這 將 有 助 于 降 低 土 壤 熏 蒸 技 術 對 大 氣 環(huán) 境 的 危 害 從 而 增 強 該 技 術 的 環(huán) 境 友 好 性 另 一 方 面 熏 蒸 劑 也 可 能 會 對 土 壤 環(huán) 境 造 成 一 定 影 響 如 引 起 土 壤 酸 化 抑 制 酶 活 性 等 2 0 2 1 同 時 土 壤 微 生 物 群 落 是 土 壤 生 態(tài) 系 統(tǒng) 中 的 重 要 組 成 部 分 它 們 除 作 為 植 物 病 原 菌 的 主 要 源 頭 外 其 中 的 有 益 菌 還 能 夠 促 進 土 壤 養(yǎng) 分 循 環(huán) 2 2 參 與 土 壤 污 染 修 復 2 3 由 于 現(xiàn) 有 的 大 部 分 熏 蒸 劑 如 威 百 畝 和 氯 化 苦 均 具 有 廣 譜 殺 菌 性 導 致 土 壤 熏 蒸 過 程 也 可 能 會 抑 制 部 分 有 益 菌 的 活 性 如 硝 化 細 菌 和 反 硝 化 細 菌 2 4 2 5 也 有 研 究 指 出 雖 然 氯 化 苦 熏 蒸 抑 制 了 氨 氧 化 古 菌 活 性 但 氨 氧 化 細 菌 活 性 得 到 了 增 強 2 6 此 外 1 3 二 氯 丙 烯 熏 蒸 改 變 了 固 氮 細 菌 硝 化 細 菌 和 反 硝 化 細 菌 在 土 壤 中 的 組 成 雖 然 在 短 期 內(nèi) 該 熏 蒸 劑 降 低 了 土 壤 中 固 氮 硝 化 和 反 硝 化 功 能 基 因 的 豐 度 但 氮 循 環(huán) 功 能 基 因 豐 度 在 試 驗 后 期 又 不 同 程 度 地 恢 復 到 未 熏 蒸 水 平 2 7 近 期 研 究 表 明 氯 化 苦 熏 蒸 可 提 高 參 與 磷 循 環(huán) 微 生 物 的 豐 度 有 利 于 土 壤 中 磷 的 釋 放 2 8 土 壤 真 菌 是 植 物 病 原 菌 的 重 要 來 源 如 F u s a r i u m s p 2 9 P y t h i u m s s p 3 0 和 G i b b e r e l l a s p 3 1 先 前 研 究 表 明 熏 蒸 劑 能 夠 明 顯 抑 制 土 壤 真 菌 群 落 的 活 性 且 真 菌 群 落 豐 度 隨 時 間 的 推 移 很 難 再 恢 復 至 原 來 的 水 平 3 2 3 4 然 而 由 土 壤 熏 蒸 造 成 真 菌 群 落 這 種 難 以 恢 復 式 的 演 變 趨 勢 是 否 有 利 于 土 壤 生 態(tài) 系 統(tǒng) 的 發(fā) 展 有 待 深 入 研 究 同 時 微 生 物 在 土 壤 環(huán) 境 中 并 非 獨 立 H M t r e a t m e n t a n d d e c l i n e d b y 9 5 a n d 5 3 P 0 0 5 r e s p e c t i v e l y c o m p a r e d t o t h e N M t r e a t m e n t I n c o n t r a s t s o m e t y p i c a l p o t e n t i a l l y b e n e f i c i a l f u n g i s u c h a s T a l a r o m y c e s a n d A r t h r o g r a p h i s w e r e i n v e r s e l y r e l a t e d t o t h e p o t e n t i a l l y p a t h o g e n i c f u n g i a n d t h i s t r e n d w a s m o r e o b v i o u s i n t h e H M t r e a t m e n t C o m p a r e d t o t h e N M t r e a t m e n t t h e a b u n d a n c e o f G i b b e r e l l a a n d F u s a r i u m i n L M s h o w e d d e c l i n e i n c r e a s e t r e n d i n c o m p a r i s o n t h e a b u n d a n c e o f G i b b e r e l l a a n d F u s a r i u m i n t h e H M t r e a t m e n t a l w a y s d e c r e a s e d o v e r t i m e A c c o r d i n g t o t h e n e t w o r k a n a l y s i s t h e a b u n d a n c e o f d i f f e r e n t f u n c t i o n a l f u n g i i n t h e N M t r e a t m e n t s h o w e d p o s i t i v e c o r r e l a t i o n w i t h d o m i n a n t f u n g i a n t a g o n i s t i c t o p o t e n t i a l l y p a t h o g e n i c f u n g i a p p e a r i n g i n t h e H M t r e a t m e n t C o m p a r e d t o l o w c o n c e n t r a t i o n m e t a m s o d i u m f u m i g a t i o n h i g h c o n c e n t r a t i o n m e t a m s o d i u m n o t o n l y e f f e c t i v e l y i n h i b i t e d t h e a c t i v i t y o f p o t e n t i a l l y p a t h o g e n i c f u n g i i n t h e s o i l b u t a l s o s t r e n g t h e n e d t h e a n t a g o n i s t i c e f f e c t o f d o m i n a n t f u n g i o n p o t e n t i a l l y p a t h o g e n i c f u n g i b y r e g u l a t i n g t h e i n t e r s p e c i f i c r e l a t i o n s h i p s i n t h e f u n g a l c o m m u n i t y a n d i n d i r e c t l y e n h a n c e d t h e a c t i v i t y o f s o m e b e n e f i c i a l b a c t e r i a K e y w o r d s m e t a m s o d i u m s o i l p l a n t p a t h o g e n i c f u n g i c o m m u n i t y c o m p o s i t i o n i n t e r s p e c i f i c r e l a t i o n s h i p f u m i g a n t 5 8 1 4 0 3 生 存 相 反 它 們 之 間 復 雜 的 種 間 關 系 造 就 了 一 個 密 集 的 代 謝 網(wǎng) 絡 3 5 目 前 為 止 土 壤 熏 蒸 后 真 菌 群 落 中 病 原 真 菌 與 其 他 功 能 菌 間 種 間 關 系 的 變 化 規(guī) 律 需 進 一 步 加 以 闡 明 本 研 究 采 集 黃 瓜 大 棚 連 作 3 年 以 上 的 土 壤 選 取 威 百 畝 作 為 典 型 的 土 壤 熏 蒸 劑 并 設 置 不 同 的 熏 蒸 濃 度 和 采 樣 時 間 梯 度 采 用 高 通 量 測 序 技 術 研 究 威 百 畝 熏 蒸 土 壤 后 不 同 功 能 菌 群 的 演 變 特 征 探 明 優(yōu) 勢 菌 有 益 菌 與 病 原 真 菌 之 間 的 內(nèi) 在 聯(lián) 系 以 期 為 土 壤 中 土 傳 病 害 的 防 控 提 供 科 學 依 據(jù) 1 1 1 供 試 土 壤 為 褐 土 采 自 山 西 省 太 原 市 小 店 區(qū) 黃 瓜 大 棚 連 作 3 年 以 上 的 耕 層 土 壤 0 2 0 c m 過 2 m m 篩 經(jīng) 調(diào) 查 該 土 壤 無 威 百 畝 熏 蒸 史 土 壤 p H 為 6 9 8 有 機 質(zhì) 和 全 氮 含 量 分 別 為 2 4 8 5 g k g 1 和 1 2 7 g k g 1 堿 解 氮 有 效 磷 和 速 效 鉀 含 量 分 別 為 5 0 0 8 4 3 9 6 m g k g 1 和 2 2 3 m g k g 1 威 百 畝 的 化 學 名 稱 為 N 甲 基 二 硫 代 氨 基 甲 酸 鈉 分 子 式 為 C 2 H 4 N N a S 2 易 溶 于 水 7 7 2 g L 1 2 0 難 溶 于 大 多 數(shù) 有 機 溶 劑 在 酸 和 重 金 屬 鹽 存 在 的 條 件 下 易 分 解 1 0 其 分 子 結(jié) 構(gòu) 見 圖 1 它 通 過 釋 放 出 異 硫 氰 酸 甲 酯 C 2 H 3 N S 等 物 質(zhì) 阻 斷 生 物 體 內(nèi) 細 胞 分 裂 和 D N A R N A 以 及 蛋 白 質(zhì) 的 合 成 過 程 從 而 達 到 防 治 病 蟲 害 的 目 的 1 1 異 硫 氰 酸 甲 酯 的 半 衰 期 在 9 9 3 1 0 5 1 h 3 4 這 將 在 很 大 程 度 上 降 低 由 威 百 畝 熏 蒸 對 土 壤 環(huán) 境 造 成 的 持 續(xù) 威 脅 本 研 究 使 用 的 威 百 畝 為 4 2 的 水 劑 購 自 山 東 金 暢 鑫 化 工 科 技 有 限 公 司 1 2 采 用 微 宇 宙 模 式 進 行 土 壤 熏 蒸 試 驗 具 體 方 法 如 下 3 4 將 3 0 0 g 供 試 土 壤 置 于 棕 色 廣 口 瓶 中 分 別 設 定 高 濃 度 威 百 畝 熏 蒸 處 理 H M 1 0 0 m g k g 1 低 濃 度 威 百 畝 熏 蒸 處 理 L M 5 0 m g k g 1 和 未 熏 蒸 對 照 處 理 N M 每 個 處 理 9 個 平 行 添 加 威 百 畝 后 將 廣 口 瓶 進 行 密 封 處 理 并 在 恒 溫 2 5 培 養(yǎng) 箱 中 避 光 培 養(yǎng) 7 d 7 d 后 打 開 廣 口 瓶 蓋 隨 后 再 用 透 氣 膜 將 瓶 口 封 好 并 繼 續(xù) 在 避 光 恒 溫 條 件 下 培 養(yǎng) 培 養(yǎng) 周 期 為 4 0 d 不 包 括 最 開 始 7 d 的 密 閉 熏 蒸 過 程 在 整 個 試 驗 周 期 所 有 處 理 土 壤 含 水 量 均 保 持 最 大 持 水 量 的 6 0 同 時 分 別 在 試 驗 的 第 3 1 5 d 和 4 0 d 進 行 破 壞 性 取 樣 每 次 隨 機 抽 取 3 個 平 行 取 出 的 樣 品 經(jīng) 液 氮 處 理 后 保 存 至 8 0 冰 箱 中 待 用 以 測 定 土 壤 熏 蒸 后 真 菌 群 落 的 變 化 規(guī) 律 1 3 1 3 1 土 壤 D N A 的 提 取 使 用 P o w e r S o i l 試 劑 盒 提 取 土 壤 中 的 D N A 每 個 樣 品 約 需 0 5 g 土 壤 具 體 方 法 按 照 試 劑 盒 提 供 的 說 明 書 進 行 D N A 的 純 度 和 濃 度 通 過 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 檢 測 將 適 量 樣 品 置 于 離 心 管 中 并 用 無 菌 水 將 待 測 樣 品 稀 釋 至 1 n g L 1 1 3 2 P C R 擴 增 將 稀 釋 后 的 基 因 組 D N A 進 行 P C R 擴 增 P C R 反 應 程 序 如 下 9 8 預 變 性 1 m i n 3 0 個 循 環(huán) 包 括 9 8 1 0 s 5 0 3 0 s 7 2 3 0 s 在 7 2 條 件 下 最 終 延 伸 5 m i n 真 菌 的 擴 增 引 物 為 I T S 1 F 5 C T T G G T C A T T T A G A G G A A G T A A 3 和 I T S 2 R 5 G C T G C G T T C T T C A T C G A T G C 3 3 6 1 3 3 P C R 產(chǎn) 物 的 鑒 定 純 化 與 定 量 基 于 P C R 產(chǎn) 物 濃 度 的 結(jié) 果 進 行 混 樣 處 理 隨 后 用 2 的 瓊 脂 糖 膠 電 泳 對 P C R 的 產(chǎn) 物 進 行 檢 測 使 用 A x y P r e p D N A 對 P C R 產(chǎn) 物 進 行 純 化 主 要 步 驟 如 下 將 包 含 目 的 D N A 的 瓊 脂 糖 凝 膠 在 紫 外 燈 下 切 下 并 計 質(zhì) 量 分 別 先 后 混 入 B u f f e r D E A 和 B u f f e r D E B 混 合 液 經(jīng) 過 離 心 洗 脫 等 步 驟 后 再 用 Q u a n t u s F l u o r o m e t e r 對 P C R 產(chǎn) 物 進 行 檢 測 定 量 1 3 4 文 庫 構(gòu) 建 與 上 機 測 序 構(gòu) 建 文 庫 所 用 的 試 劑 盒 購 自 T h e r m o f i s h e r 公 司 待 文 庫 構(gòu) 建 完 成 后 需 檢 測 是 否 合 格 Q u b i t 定 量 文 庫 檢 測 通 過 后 進 行 樣 品 上 機 測 序 步 驟 上 海 美 吉 生 物 醫(yī) 藥 科 技 有 限 公 司 待 測 序 完 成 后 進 行 數(shù) 據(jù) 處 理 主 要 包 括 R e a d s 的 拼 接 T a g s 數(shù) 據(jù) 的 過 濾 和 質(zhì) 控 O T U s 的 聚 類 及 后 續(xù) 的 信 息 挖 掘 1 4 使 用 軟 件 E x c e l 2 0 0 7 進 行 數(shù) 據(jù) 分 析 采 用 軟 件 S P S S S t a t i s t i c s 2 2 進 行 組 間 差 異 分 析 單 因 素 方 差 分 析 和 t 檢 驗 結(jié) 合 美 吉 生 物 云 平 臺 和 軟 件 O r i g i n 2 0 1 9 制 圖 N e t w o r k 圖 除 外 運 用 軟 件 C y t o s c a p e 3 7 1 進 行 N e t w o r k 關 聯(lián) 分 析 用 于 揭 示 土 壤 真 菌 群 落 種 間 關 系 的 變 化 規(guī) 律 先 借 助 軟 件 S P S S S t a t i s t i c s 2 2 對 屬 水 H 3 C H N C S N a S 1 F i g u r e 1 M o l e c u l a r s t r u c t u r e o f m e t a m s o d i u m 5 8 2趙 曉 東 等 土 壤 真 菌 對 威 百 畝 熏 蒸 的 響 應 特 征 2 0 2 1 3 w w w a e s o r g c n 平 真 菌 進 行 S p e a r m a n 相 關 性 分 析 篩 選 出 顯 著 相 關 P 0 0 5 的 兩 兩 關 系 再 進 行 制 圖 以 提 高 N e t w o r k 的 可 讀 性 2 2 1 通 過 對 2 7 個 土 壤 樣 品 真 菌 群 落 進 行 測 序 總 共 得 到 1 4 3 7 3 9 5 條 有 效 序 列 各 樣 品 平 均 5 3 2 3 7 條 r e a d s 平 均 長 度 為 2 3 7 2 4 4 b p 表 1 測 序 序 列 在 9 7 的 相 似 度 水 平 下 被 歸 類 后 比 對 出 4 8 1 6 9 1 個 O T U s 覆 蓋 度 均 高 于 9 9 說 明 測 序 深 度 能 夠 很 好 地 反 映 真 菌 群 落 的 狀 況 2 1 1 A l p h a 多 樣 性 從 總 體 來 看 不 同 處 理 間 S h a n n o n 指 數(shù) 幾 乎 沒 有 差 別 圖 2 e 而 經(jīng) 過 威 百 畝 熏 蒸 后 C h a o 1 指 數(shù) 較 對 照 處 理 顯 著 降 低 了 1 4 1 6 P 0 0 1 圖 2 a 說 明 威 百 畝 熏 蒸 可 以 抑 制 土 壤 中 真 菌 群 落 的 豐 度 同 時 在 N M 和 L M 處 理 中 C h a o 1 和 S h a n n o n 指 數(shù) 均 隨 時 間 推 移 沒 有 顯 著 的 變 化 圖 2 b 圖 2 c 和 圖 2 f 圖 2 g 然 而 C h a o 1 指 數(shù) 在 H M 處 理 中 隨 時 間 而 逐 漸 降 低 且 在 第 4 0 d 較 第 3 d 顯 著 下 降 了 2 8 P 0 0 5 圖 2 d 說 明 高 劑 量 的 威 百 畝 熏 蒸 對 土 壤 真 菌 群 落 的 影 響 更 為 明 顯 2 1 2 B e t a 多 樣 性 在 O T U s 分 類 水 平 下 采 用 B r a y C u r t i s 距 離 算 法 對 不 同 處 理 的 真 菌 群 落 進 行 了 主 坐 標 分 析 P C o A 兩 排 序 軸 的 總 解 釋 度 達 5 4 1 2 圖 3 聚 類 結(jié) 果 顯 示 不 同 處 理 間 的 真 菌 群 落 分 別 各 自 聚 集 在 了 一 起 其 中 H M 處 理 的 聚 類 效 果 尤 為 明 顯 進 一 步 通 過 A N O S I M 檢 驗 發(fā) 現(xiàn) 組 間 差 異 達 顯 著 水 平 P 0 0 1 說 明 威 百 畝 熏 蒸 顯 著 改 變 了 土 壤 真 菌 群 落 的 結(jié) 構(gòu) 2 2 2 2 1 威 百 畝 對 土 壤 真 菌 門 水 平 豐 度 的 影 響 由 圖 4 可 知 供 試 土 壤 中 豐 度 排 名 前 5 的 門 水 平 真 菌 依 次 分 別 為 A s c o m y c o t a 8 4 8 9 M o r t i e r e l l o m y c o t a 2 9 1 1 u n c l a s s i f i e d k F u n g i 1 8 4 4 B a s i d i o m y c o t a 1 4 3 和 C h y t r i d i o m y c o t a 0 7 2 4 總 體 來 看 與 未 熏 蒸 處 理 相 比 威 百 畝 熏 蒸 后 A s c o m y c o t a u n c l a s s i f i e d k F u n g i 和 C h y t r i d i o m y c o t a 豐 度 呈 增 加 趨 勢 而 M o r t i e r e l l o m y c o t a 在 L M 和 H M 處 理 中 分 別 降 低 了 4 5 和 7 5 圖 4 a 圖 4 c 隨 著 時 間 的 推 移 A s c o m y c o t a 豐 度 在 N M 處 理 中 逐 漸 降 低 而 在 H