婁喜艷 郭洋洋 裴冬麗 河南商丘月季黑斑病病原菌鑒定及生物學特性 江蘇農業(yè)科學 河 南 商 丘 月 季 黑 斑 病 病 原 菌 鑒 定 及 生 物 學 特 性 婁喜艷 郭洋洋 裴冬麗 商丘工學院 河南商丘 商丘師范學院測繪與規(guī)劃學院 河南商丘 商丘師范學院生物與食品學院 河南商丘 摘 要 月季是一種世界上常見的 重要的觀賞植物 年 月在河南省商丘市平原路 長江路 文化路等綠化 帶發(fā)現(xiàn)月季植株患有黑斑病 為鑒定河南省商丘市月季黑斑病病原菌 采集月季患病植株葉片 使用單孢分離法對該 病原菌進行分離 純化得到 株病原菌 對該病原菌 進行形態(tài)學鑒定 利用室內人工接種的 方法對其進行致病性測定 對其 和 等 個基因序列進行 擴增和測序分析 結果表明 病 原菌的分生孢子為棕褐色 呈倒棒狀 表面有橫隔膜和縱隔膜 該菌株能使健康月季離體葉片出現(xiàn)黑斑病病癥 多基 因系統(tǒng)進化分析表明 該病原菌菌株 序列 序列 序列 與鏈格孢 a aa a a 序列 序列 序列 聚于 個分支 由此 確定河南省商丘市月季黑斑病病原菌 為鏈格孢 生物學特性分析表明 菌絲最適宜生長的 溫度為 值為 光照條件為 光照 最適宜 菌絲生長的碳源為葡萄糖 氮源為蛋白胨 研 究結果為河南省商丘月季黑斑病的防治提供了理論依據和應用價值 關 鍵 詞 月季 黑斑病 鏈格孢 形態(tài)學鑒定 分子生物學鑒定 生物學特性分析 中 圖 分 類 號 文 獻 標 志 碼 文 章 編 號 收稿日期 基金項目 河南省高等學校青年骨干教師培養(yǎng)資助項目 編號 作者簡介 婁喜艷 女 河南商丘人 碩士 副教授 主要從事 植物生理學教學與研究工作 通信作者 裴冬麗 博士 教授 主要從事植物分子遺傳學研究 月季 a 被稱為花中皇后 一年四 季開花 是一種重要的觀賞植物 也是表達友誼 歡 慶和祝賀的首選花卉 月季屬于薔薇科 薔薇屬 a 栽培面積非常廣 自然花 期從 月到次年 月 月季的花朵成大型 由內向 外發(fā)散形地生長 有濃郁撲鼻的香氣 可廣泛用于 園藝栽培和切花 花朵可提取香精 也可入藥 澆水 施肥 光照 蟲害等環(huán)境外因與月季自身 生長內因促使其發(fā)病 據統(tǒng)計 目前已發(fā)現(xiàn)的月季 常見病害有黑斑病 白粉病 灰霉病 霜霉病 葉霉 病 灰斑病 銹病 葉枯病 枝枯病 炭疽病 褐斑病 根癌病 花葉病等共 種病害 其中 黑斑病最 為嚴重 是月季病害的世界性三大病害之一 在我 國大多數的月季種植區(qū)經常發(fā)生 發(fā)病率很高 尤 其是月季的葉片上發(fā)病率很高 破壞性很強 初 始 月季葉片上形成黑色小斑點 之后小斑點間相 互聯(lián)結形成大斑點 月季黑斑病已報道的病原 菌主要為薔薇盤二孢和鏈格孢屬 鏈格孢屬又分 為鏈格孢和細極鏈格孢 等首次報道在巴基 斯坦暴發(fā)的月季黑斑病主要由鏈格孢屬 a a 的菌種引起 在國內 年陜西省生物 技術重點實驗室在西安市采集具有典型黑斑癥狀 的月季植株 分離純化鑒定為薔薇盤二孢 a a a 年 月山西省運城 學院花圃采集具有典型黑斑癥狀的月季植株 分離純 化鑒定為鏈格孢 a a a 年 月在河南省商丘市平原路 長江路 和文化路等多個綠化帶發(fā)現(xiàn)月季植株患有黑斑病 本試驗為明確河南省商丘市月季黑斑病病原菌的 種類 對其進行分離純化 從形態(tài)和分子方面進行 鑒定 并對引起月季黑斑病病原菌鏈格孢的生物學 特性進行研究 為生產實踐中月季黑斑病科學防控 提供依據 材 料 與 方 法 材料 供試植株 年 月于河南省商丘市 江蘇農業(yè)科學 年第 卷第 期 平原路 長江路 文化路等綠化帶采集患有黑斑病 的月季葉片 試劑和培養(yǎng)基 試劑 a 等試劑購于大連 公司 引物 引物 引物 引物 引物 和 引物 由生工生物工程 上海 股份有限 公司合成 測序由生工生物工程 上海 股份 有限公司測序完成 馬鈴薯葡萄糖瓊脂 培養(yǎng)基的配制 先把馬鈴薯清洗干凈并且把 皮去掉 把芽眼也去掉 然后把稱取好的 的馬 鈴薯切成玉米粒大小的塊狀 開始加水煮爛 直到 這些小塊狀的馬鈴薯能被玻璃棒一碰就戳破即可 用 層紗布過濾 把濾液倒入燒杯中 把稱取好的 瓊脂粉也倒在盛有濾液的燒杯中 用玻璃棒充 分攪拌并混勻 待瓊脂完全溶解后 在向其中加入 葡萄糖 稍微冷卻后用蒸餾水定容至 調節(jié) 值至 然后將配制好的培養(yǎng)基分裝至錐形瓶 中 包扎好放入滅菌鍋中滅菌 滅菌結束后 取出錐 形瓶 冷卻后貯存?zhèn)溆?方法 病原菌分離 采用單孢分離法進行病原菌 分離 首先選取有明顯黑斑病病斑的葉片 在病健 交界處切取 大小的組織塊 在 乙 醇溶液中浸泡消毒 后用無菌水連續(xù)漂洗 次 再用 次氯酸鈉溶液浸泡 然后用無菌水浸 洗 次 放在滅過菌的濾紙上晾干后轉移至 培 養(yǎng)基上于 恒溫培養(yǎng) 用第 次的清洗液涂布平 板作為陰性對照 后觀察菌落生長狀況 然 后重新把菌絲尖端放置于新的 培養(yǎng)基中 在 下恒溫培養(yǎng) 一直重復操作到分離菌株純化 為止 病原菌形態(tài)學鑒定 觀察菌落的正反面顏 色 菌絲疏密程度等菌落特征 然后在光學顯微鏡 下進行鏡檢 觀察月季黑斑病病原菌的菌絲以及分 生孢子的特征 如分生孢子的大小 形狀 孢子梗和 有無隔膜等 病原菌分子生物學鑒定 提取 使用 法 具體操作步驟為 試驗開始前先將異丙 醇放入 冰箱中預冷 乙醇 預冷 水 浴鍋加熱到 用滅過菌的槍頭刮取 菌 絲置于 離心管中 向保存菌絲的離心管中加 入少量石英砂 約 加 的 提取緩沖液 開始用研磨棒研磨 直到研磨充分為 止 然后加入 的 提取緩沖液 把 離心管放置于 水浴鍋中 水浴 后冷卻至室 溫 水浴時每 顛倒混勻 次 水浴結束后 在離心管中加入等體積的 的三氯甲烷 異戊 醇 在 離心 的條件下 充分振蕩混勻 離心期間將 提取緩沖液 水浴加熱 離心后取 的上清液于新 的離心管中 向離心管中加入 的提前預熱好 的 提取緩沖液 振蕩混勻 然后加入 的三氯甲烷 異戊醇 在 離心 的條件下充分振蕩搖勻 離心結束后 取 的上清液于新的離心管中 加入 提前預冷好的異丙醇 輕輕混勻 在 的條件 下靜置 最多 以上 靜置后再次離心 然后在 的條件下離心 然 后將上清液緩慢移去 倒置片刻 加入 提前預 冷的 乙醇洗滌 在 的條件下離心 再重復 次洗滌 洗滌完成后移去上清液 把剩余的液體用滅過菌的槍頭小心的吸去 最好不 要吸到沉淀 在工作臺上完全風干 左右 最后加入 的去離子水 在 的條件下保 存以便進行下一步的操作 反應體系 其中模板 上游引物 下游引物 a 去離子 水 設置 反應程序 預變性 變性 退火 個循環(huán) 延 伸 將擴增產物送到生工生物工程 上海 股 份有限公司進行比對測序 把得到的序列在 上用 進行同源性比對 下載與月季 黑斑病病原菌相關的同源序列 聯(lián)合 序 列 序列和 序列 利用 軟件 的鄰位方法構建系統(tǒng)發(fā)育樹 致病性測定 采用離體接種法進行病原菌 的致病性測定 在接種前用無菌水對健康無病的 月季葉片進行沖洗 除去表面雜質 用滅菌接種針 進行刺傷處理 將在 條件下培養(yǎng) 的病 江蘇農業(yè)科學 年第 卷第 期 原菌用打孔器制成直徑為 的菌餅 接種于接 種點處 用無菌 培養(yǎng)基圓片用來當作對照 將 接種后的葉片放置于鋪有濕潤脫脂棉的培養(yǎng)皿內 于 下保濕培養(yǎng) 每天觀察發(fā)病狀況 病原菌生物學特性的測定 不同溫度 值和光照對病原菌菌絲生長的影響試驗 采用 平板測定法 把直徑為 的 菌餅 接種在 培養(yǎng)基的正中央 分別設置溫度為 把直徑為 的 菌餅接種在 值為 的 培養(yǎng)基正中央 分別在全光照 全黑 暗 光 暗 條件下 把直徑為 的 菌餅接種在 培養(yǎng)基的正中央 把 以上處理分別放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 定期測量菌落直 徑 每個處理重復 次 碳源和氮源對病原菌菌絲生長的影響試驗 采用平板測定法 把直徑為 的 菌餅接種在不含蔗糖的查氏培養(yǎng)基中 以乳糖 蔗 糖 葡萄糖 麥芽糖 果糖 淀粉為 種碳源 把直徑 為 的 菌餅接種在不加硝酸鈉的 查氏培養(yǎng)基中 分別加入蛋白胨 硫酸銨 硝酸銨 硝酸鉀和硝酸鈉 種氮源 把以上處理分別放在培 養(yǎng)箱中培養(yǎng) 定期測量菌落直徑 每個處理重復 次 數據分析 利用 軟件對試驗數據進 行統(tǒng)計分析 利用鄧肯氏多重比較法對試驗數據進 行差異顯著性分析 結 果 與 分 析 月季黑斑病發(fā)病癥狀 月季黑斑病主要發(fā)生在葉片上 發(fā)病初期 葉 片正面出現(xiàn)小的暗褐色斑點 隨著時間的推移漸漸 擴大為圓形的或近圓形的黑色斑點 發(fā)病后期 月 季黑斑病斑點上有散在的黑色顆粒 呈散生或者輪 狀排列 有些品種的斑點是相互連接的 葉柄上開 始產生橢圓形的暗褐色斑點 略凸起 斑點邊緣無 明顯菌絲 月季花瓣上大多數是橢圓形狀的褐色 斑點 當月季黑斑病發(fā)生嚴重時 植株中下部的葉 片幾乎全部脫落 只留下頂部的幾張綠葉 整個植 株下部的葉片呈枯黃色 月季黑斑病病原菌的形態(tài)特征 從月季黑斑病葉片病斑中分離出 株病原菌菌 株 編號為 而第 次的清洗液涂布平 板上無菌落生長 在 平板上培養(yǎng) 后可產生零星的白色菌絲 培養(yǎng) 后開始產 孢 后長滿平板 菌落表面濕潤并且不光滑 呈 現(xiàn)黑褐色 沒有輪紋 圖 圖 顯微觀察 表明 病原菌分生孢子梗為灰褐色 有隔膜 孢子 為長卵形或倒棍棒形 橫隔膜 個 縱隔膜 個 分生孢子大小為 圖 圖 初步鑒定為鏈格孢 系統(tǒng)進化分析 以月季黑斑病病原菌菌株 的 為模板 以 引物 引物和 引物對菌株 進行 擴增 再對 擴增產物測序 將所得的 序列 序列 和 序列 在 基因數據庫中進 行 同源性比對 在 分別下載與菌株 的 序列 序列和 序列具有同源性的序列 以番茄葡柄霉 序列 序列 序列 為外群 利用 軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹 圖 結果表 明 菌株 序列 序 列 序列 與鏈格孢 序 列 序列 序列 聚于一個分支 將病原菌的親緣關系分 析結果和它的形態(tài)特征 培養(yǎng)性狀以及致病性結果 結合起來對該病原菌進行鑒定 確定 菌 株為鏈格孢 月季黑斑病病原菌的致病性鑒定 采集形狀 大小相近的健康月季葉片 用無菌 水清洗干凈 用滅過菌的竹簽分別對稱刺傷葉片 并將菌餅放入葉片左上方和右下方 處 觀察 菌株發(fā)病時間并記錄 后 接種 葉片上出現(xiàn)了黑褐色病斑 并且葉片上產生的癥狀 與田間月季黑斑病發(fā)病癥狀極其相似 發(fā)病率為 圖 而只接 培養(yǎng)基圓片的對照 組 圖 未發(fā)病 從患病的接種葉片組織中再 次分離出真菌 觀察到的菌落形態(tài)和孢子形態(tài)與接 種菌株一致 由此證明河南省商丘市月季黑斑病 由鏈格孢病原菌 侵染所致 致病菌最適生長條件的測定 溫度對菌絲生長的影響 從圖 可以看出 江蘇農業(yè)科學 年第 卷第 期 月季黑斑病病原菌 在溫度為 時都可以生長 最適宜 菌絲生長的溫度 為 不同溫度條件下 菌絲的生長 差異顯著 值對菌絲生長的影響 從圖 可以看 出 月季黑斑病病原菌 在 值 時都可以生長 在 值 時 菌絲的半徑隨著 值的升高逐漸增大 最適宜 菌絲生長的 值為 此時 菌生長最快 最適合菌落生長 值 為 時 菌絲半徑差異不顯著 表明該 菌 的 值適應范圍很廣 江蘇農業(yè)科學 年第 卷第 期 光照對菌絲生長的影響 從圖 可以看出 月季黑斑病病原菌 在不同的光照條件 下都可以生長 在 光照情況下生長最快 在 黑暗情況下次之 在 光照 黑暗交替 生長時最慢 光照和 黑暗對 菌絲的生長差異不顯著 光照 光照 黑暗交替生長對 菌絲的生長差異顯著 黑暗和 光照 黑暗交替生長對 菌絲的生長差異顯著 碳源對菌絲生長的影響 從圖 可以看出 月季黑斑病病原菌 能在 種碳源下生 長 然而菌絲在不同碳源上的生長明顯不同 在無 碳源對照條件下 菌絲生長最慢 在碳 源為葡萄糖時 菌生長最快 在乳糖 麥 芽糖 蔗糖 果糖 淀粉作為碳源時 生長速率依次 降低 表明不同碳源對 菌絲的生長有 顯著影響 氮源對菌絲生長的影響 從圖 可以看出 在無氮源對照條件下 菌絲生長速率最 慢 菌絲在 種氮源上均能生長 以蛋 白胨為氮源時生長最快 以硝酸鈉 硝酸鉀 硫酸銨 江蘇農業(yè)科學 年第 卷第 期 和硝酸銨為氮源時生長速率依次降低 并且硫酸銨 和硝酸銨的生長速率相等 說明不同氮源對 菌絲的生長有顯著影響 討 論 與 結 論 本試驗對河南商丘月季黑斑病病原菌進行顯 微形態(tài)學鑒定 致病性鑒定 分子生物學鑒定和生 物學特性分析 本試驗結果表明 月季黑斑病病原 菌 最開始菌落顏色為灰白色 最后變?yōu)?黑褐色 在健康的月季葉片上接種菌餅 后 葉片上出現(xiàn)了黑褐色病斑 并且葉片上產生的 癥狀與田間月季黑斑病發(fā)病癥狀極其相似 系統(tǒng) 進化分析結果表明 與鏈格孢 序列 序 列 序 列 聚于 個分支 由此確定河南省商丘市 月季黑斑病病原菌 為鏈格孢 最適宜 菌絲生長的溫度 值 光照條件 碳 源 氮源為 光照 葡萄糖 蛋白胨 馮寶珍等報道 月季黑斑病在初期時菌落為灰白 色 后漸變?yōu)榘瞪梁诤稚?其分生孢子為黑褐色 呈倒梨形 卵形或倒棍棒形 而劉寶軍報道的月 季黑斑病的大部分致病菌為薔薇盤二孢 有分生孢 子盤 位于角質層下 形狀為圓形至不規(guī)則形 顏色 為黑色 分隔處略縊縮 鏈格孢真菌在自然界中的很多地方都有存在 主要分布在土壤 空氣和農作物殘體中 主要通過 腐生 內生和致病這 種形式存在 鏈格孢真菌種 類多種多樣 是世界上分布最廣的半知菌類真菌之 一 該真菌 以上的種類兼性寄生于植物上 能 夠使多種植物產生病害 如花椒穗枯病 麥的黑 胚病和菊花的黑斑病 梨樹黑斑病 三七黑斑 病 給大田生產帶來了巨大的經濟損失 鏈格孢 菌侵染月季 在月季葉片上產生黑斑 病害嚴重時 造成葉片脫落 植株枯死 本試驗對河南省商丘市月季黑斑病病原菌進 行鑒定 對月季黑斑病病原菌的生物學特性進行研 究 試驗結果有利于植物病害的檢疫 有利于月季 更好地生長 在今后的相關研究中可以有效篩選月 季抗病性品種 為有效預防月季黑斑病提供有力的 技術支撐 參 考 文 獻 中國花卉協(xié)會月季分會 中國月季發(fā)展報告 第 版 農業(yè)科 技與信息 現(xiàn)代園林 孫海楠 呂運舟 汪有良 基于不同提取方法的月季香氣成分比 較分析 江蘇農業(yè)學報 韓云艷 淺析月季主要病害的診斷與綜合防治技術 種子科 技 金一鋒 郭廣兵 楊清淼 等 月季黑斑病病原鑒定與抗性鑒定方 法研究 北方園藝 馮寶珍 李培謙 月季黑斑病病原菌鑒定及室內藥劑初步篩選 植物保護學報 a a a a a a a 徐玲玲 陶貴榮 姚武偉 等 月季內生真菌分離及抗黑斑病活性 菌株的篩選 安徽農業(yè)科學 方中達 植病研究方法 版 北京 中國農業(yè)出版社 張 強 羅非魚片真空微凍保鮮工藝的研究 海口 海南大 學 何靖柳 秦 文 劉曉燕 等 紅陽獼猴桃中葡萄座腔菌的生物 學特性及致病性研究 食品與機械 張 鑫 冒浩宇 李 禹 等 月季黑斑病病原鑒定及室內藥劑 篩選 中國園藝文摘 劉寶軍 月季黑斑病菌薔薇盤二孢 a a a 形態(tài)多樣 性 致病性多樣性和遺傳多樣性研究 泰安 山東農業(yè)大 學 劉 峰 楊文香 張 娜 等 花椒枯穗病病原鑒定 植物病 理學報 許高娟 陳發(fā)棣 菊花黑斑病菌的分離鑒定 江蘇農業(yè)學 報 楊曉平 胡紅菊 王友平 等 梨黑斑病病原菌的生物學特性及其 致病性觀察 華中農業(yè)大學學報 何 遲 王慧玲 金 鑫 等 云南 廣西三七黑斑病病原鏈格孢 菌的鑒定 植物病理學報 江蘇農業(yè)科學 年第 卷第 期