DOI 10 13629 j cnki 53 1054 2020 10 025 中國食用菌 2020 39 10 117 119 EDIBLE FU GI OF CHI A C 53 1054 ISS 1003 8310 金針菇黑腐病病原菌的分離與分子鑒定 蘭玉菲 張煥利 于清偉 叢倩倩 泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 山東 泰安 271000 摘要 為了明確山東省金針菇 Flammulina velutipes 工廠化廠房內(nèi)發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌性病害的種類 從感病子實(shí)體組 織分離獲得病原菌菌株 通過提取其基因組總 D A 并分別擴(kuò)增病原菌的 16S rD A 和 gyrB 基因 序列分析結(jié)果 表明該病原菌為托拉斯假單胞桿菌 Pseudomonas tolaasii 關(guān)鍵詞 金針菇 黑腐病 托拉斯假單胞桿菌 中圖分類號 646 9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1003 8310 2020 10 0117 03 I I B k D Flammulina velutipes LAN Y HANG H YU Q w ONG Q q Tai an Academy of Agricultural Sciences Tai an 271000 C ina A In order to identify t e types of acterial diseases found in t e factory uilding of Flammulina velutipes in S andong province acterial strains were isolated from t e diseased fruiting ody T e total genomic D A of t e pat ogen was extracted and t e 16S rD A and gyrB genes of t e pat ogen were amplified Pat ogenicity test and sequence analysis s owed t at t e pat ogen was Pseudomonas tolaasii K w Flammulina velutipes lack rot disease Pseudomonas tolaasii 基金項(xiàng)目 2013年山東省食用菌創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)病蟲害防控與質(zhì)量控制項(xiàng)目 SDAIT 07 04 2008 年國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè) 食用菌 產(chǎn)業(yè)體系建設(shè)專項(xiàng) CARS 20 作者簡介 蘭玉菲 1980 女 博士 高級農(nóng)藝師 主要從事食 藥 用菌遺傳多樣性分析 新品種選育 馴化栽培 病蟲害防控方面研究 E mail lanyufei526 163 com 收稿日期 2020 08 12 金針菇 Flammulina velutipes Fr Singer 是 一種在世界上廣泛栽培的重要食用菌之一 營養(yǎng)豐 富 味道鮮美 深受人們喜愛 1 2 近幾年 山東省工廠化金針菇發(fā)展迅速 主要 栽培種類為白色金針菇 隨著栽培規(guī)模的不斷擴(kuò)大 和栽培年限的延長 病害發(fā)生越發(fā)嚴(yán)重 黑腐病是 金針菇工廠化生產(chǎn)中的主要病害之一 給工廠化金 針菇生產(chǎn)帶了嚴(yán)重?fù)p失 為明確黑腐病病原菌 對 病原菌進(jìn)行分離和分子鑒定 明確了病原菌的分類 地位 為科學(xué)防治提供理論依據(jù) 1 材料與方法 1 1 樣品采集 供試樣品采自濟(jì)寧工廠化金針菇廠房內(nèi) 1 2 培養(yǎng)基 A 培養(yǎng)基 蛋白胨 10 g L 1 牛肉膏 3 g L 1 aCl 5 g L 1 瓊脂 20 g L 1 LB培養(yǎng)基 胰蛋白胨 10 g L 1 酵母提取物 5 g L 1 aCl 10 g L 1 1 3 病原菌分離和純化 分別取菌蓋和菌柄病健交界處組織進(jìn)行病原菌 的分離 純化 方法參照文獻(xiàn) 3 1 4 致病性測定 將純化的菌株在 A 平板上 28 培養(yǎng) 48 后 用無菌水配成細(xì)菌懸浮液 約 1 10 8 cfu mL 1 采 用噴霧法接種 分別將 2 mL 細(xì)菌懸浮液噴灑在正常 生長的金針菇菌蓋和菌柄處 無菌水處理為對照 接種后的金針菇置于 15 菇房內(nèi) 保持空氣相對濕 病蟲害防治 度 90 每天觀察發(fā)病情況 從接種發(fā)病的金針菇 菌蓋和菌柄上重新分離病原菌并鑒定 1 5 病原菌的分子鑒定 1 5 1 基因組D A 提取 將分離純化的菌株在 A 培養(yǎng)基上劃線 挑取 單菌落于LB培養(yǎng)基中 28 震蕩培養(yǎng)過夜 收集菌 體 利用 Solar io 細(xì)菌基因組 D A 提取試劑盒提取 致病菌基因組D A 1 5 2 16S rD A 和 gyrB 序列的擴(kuò)增 以D A 為模板 使用高保真酶 利用引物分別 擴(kuò)增致病菌的 16S rD A 和 gyrB 序列 引物名稱及 序列見表1 1 PCR反應(yīng)體系 5 uffer 10 L d TP 2 5 mmol L 1 eac 4 L 上游引物 10 mol L 1 1 5 L 下游引物 10 mol L 1 1 5 L 酶 2 5 U L 1 0 5 L 模 板1 L ddH 2 O 補(bǔ)加至50 L 2 擴(kuò)增16S rD A 基因的反應(yīng)程序 94 預(yù)變性3 min 98 變性10 s 55 退火5 s 72 延伸 100 s 共進(jìn)行 35個(gè)循環(huán) 最后 72 延 伸5 min 3 擴(kuò)增gyrB 基因的反應(yīng)程序 94 預(yù)變性3min 94 變性30s 55 退火30s 72 延伸 1 min 共進(jìn)行 35個(gè)循環(huán) 最后 72 延 伸10 min PCR擴(kuò)增結(jié)束后 電泳并切膠回收目的產(chǎn)物送 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院測序中心測序 1 5 3 序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 將所得D A 序列輸入GenBank 進(jìn)行Blast 檢索 采用 D ASTAR D AMA 和 MEGA 6 等軟件對所 得的核苷酸序列與GenBank 中收錄分離物的相應(yīng)序 列進(jìn)行比較和分析 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 2 結(jié)果與分析 2 1 病害癥狀 工廠化金針菇自然發(fā)病癥狀見圖1A 圖 1B 致病性試驗(yàn)接種菌蓋和菌柄后發(fā)病癥狀見圖 1C 圖 1D 表 1 引物名稱及序列 Ta 1 Primer names and sequences 引物序列 5 3 CAGGAAACAGCTATGACCAYGS G G GG AARTTYRA AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 擴(kuò)增序列 引物名稱 UP1E 16S rD A 27F TACGGYTACCTTGTTACGACTT 1429R gyrB APrU TGTAAACGACGGCCAGTGC GGRT CYTTYTCYTGRCA 圖 1 黑腐病對金針菇的為害癥狀 Fig 1 Symptom of Black rot disease caused y Pseudomonas tolaasii on Flammulina velutipes 如圖 1A 圖 1B所示 該病害一般從菌柄基部 瓶口周圍 發(fā)病 初期呈黃褐色至黑褐色 并可延 菌柄往上侵染幼小菇蕾 導(dǎo)致其萎蔫死亡 亦可直 接侵染菌蓋 呈現(xiàn)凹陷病斑 初期黃色 后期顏色 逐漸加深 最后萎焉死亡 2 2 致病性測定 分別從菌蓋和菌柄分離獲得20 個(gè)菌落形態(tài)一致 的單菌落進(jìn)行致病性測定 其中16個(gè)菌落接種后 3天后菌蓋和菌柄出現(xiàn)明顯的黑褐色病斑和腐爛癥 狀 癥狀與工廠化金針菇自然發(fā)病癥狀相同 圖 1C 和圖 1D 而噴灑無菌水的對照子實(shí)體生長正常 說明分離的 16個(gè)單菌落均為金針菇黑腐病的致病 菌 其余 4個(gè)單菌落接種后未出現(xiàn)癥狀 通過初步 接種鑒定為非致病菌 2 3 病原菌的序列測定與分析 利用 Solar io 細(xì)菌基因組 D A 提取試劑盒提取 致病菌基因組 D A 以 D A 為模板 使用高保真 酶 利用表 1的引物分別擴(kuò)增3個(gè)致病菌的 16S r D A 和 gyrB 基因 PCR 擴(kuò)增結(jié)束后 電泳并切膠 回收目的產(chǎn)物送測序公司測序 分別得到長度約為 1 400 p 的 16S rD A 基因和 900 p 的 gyrB 基因 分別基于 ITS和 gyrB 基因序列構(gòu)建的 J 系統(tǒng)發(fā)育 樹見圖 2和圖3 從圖 2和圖 3可知 同源性比對結(jié)果表明分離 的 3個(gè)致病菌的 16S rD A 基因與 GenBank 中托拉 斯假單胞桿菌 Pseudomonas tolaasii 的分離物的同 源性最高 核苷酸一致率最高為 100 gyrB 基因與 GenBank 中 Pseudomonas tolaasii 分離物 AB039423 同源性最高 核苷酸一致率為 100 進(jìn)一步基于 ITS和 gyrB 2個(gè)基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 結(jié)果表 明 引起金針菇黑腐病的致病菌與 GenBank 中托拉 斯假單胞桿菌 Pseudomonas tolaasii 的分離物聚為 一簇 組內(nèi)核苷酸一致率均高達(dá) 100 因此分子鑒 定病原菌為 P tolaasii 3 討論 通過致病性試驗(yàn)篩選出引起金針菇黑腐病的病 原菌 進(jìn)一步擴(kuò)增病原菌的 ITS和 gyrB 2個(gè)基因并 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 結(jié)果表明引起金針菇黑腐病的病 原菌與 GenBank 中托拉斯假單胞桿菌 P tolaasii 的分離物聚為一簇 組內(nèi)核苷酸一致率均高達(dá) 100 因此確定病原菌為 P tolaasii 前人研究結(jié)果 表明托拉斯假單胞桿菌 P tolaasii 可以危害平菇 Pleurotus ostreatus 金針菇 雙孢菇 Agaricus bis porus 杏鮑菇 Pleurotus eryngi 香菇 Lentinula edodes 等多種食用菌并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失 4 6 本研究在國內(nèi)外已有研究基礎(chǔ)上 基于 ITS和 gyrB 2個(gè)基因?qū)S化金針菇黑腐病病原進(jìn)行了分子鑒 定 明確其病原為 P tolaasii 為該病害的防治和抗 病品種的選育研究奠定理論基礎(chǔ) 參考文獻(xiàn) 1 Smiderle FR Car onero ER Sassaki GL et al C aracteri a tion of a eterogalactan some nutritional values of t e edi le mus room Flammulina velutipes J Food C emistry 2008 108 1 329 333 2 Cai H Liu X C en Z Isolation purification and identification of nine c emical compounds from Flammulina velutipes fruit ing odies J Food C emistry 2013 141 3 2873 2879 3 方中達(dá) 植病研究方法 J 第 3版 北京 中國農(nóng)業(yè)出版 社 1998 122 145 4 Lee HI C a JS Cloning of a D A fragment specific to Pseu domonas tolaasii causing acterial rown lotc disease of oyster mus room Pleurotus ostreatus J Korean Journal of Plant Pat ology 1998 14 177 183 5 Han HS J une CS C eong JC et al Occurrence of lack rot of cultivated mus rooms Flammulina velutipes caused y Pseudomonas tolaasii in Korea J European Journal of Plant Pat ology 2012 133 527 535 6 Tsuneda A Suyama K Murakami S et al Occurrence of Pseudomonas tolaasii on fruiting odies of Lentimula edodes formed uercus logs J Mycoscience 1995 36 283 288 圖 2 基于 ITS基因序列構(gòu)建的 J 系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig 2 P ylogenetic tree ased on ITS sequences and constructed using t e neig or joining met od 圖 3 基于 gyrB 基因序列構(gòu)建的 J 系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig 3 P ylogenetic tree ased on gyrB sequences and constructed using t e neig or joining met od 蘭玉菲等 金針菇黑腐病病原菌的分離與分子鑒定