018 年第 1期 CIA PLA PROECIO 0 18,l. 8 . 1 葡萄灰霉病是由灰葡萄孢 （ Botrytis cinerea Pers . ） 通過侵染葡萄葉片 、 新鞘 、 花穗 、 果實等導致的 一種真菌病害 。 其產孢量大 、 寄主范圍廣 1 ， 是葡萄 生產中的主要病害之一 2 ， 每年因灰霉病造成的損 失在 20%以上 3 。 目前 ， 葡萄灰霉病仍以化學防治為 主 ， 存在農藥殘留 、 環(huán)境污染以及抗藥性等問題 4-7 。 生物防治具有安全 、 無污染 、 無抗藥性等優(yōu)勢 ， 已成 為葡萄灰霉病防治的研究熱點 8 。 利用拮抗菌防治 灰霉菌已有廣泛研究的報道 9-11 。 但關于葡萄灰霉 病果穗附生拮抗菌篩選 、 鑒定的研究較少 。 本研究從 葡萄中抗品種 “ 紅地球 ” 果穗中分離附生細菌的拮抗 試驗中 ， 篩選出葡萄灰霉病優(yōu)勢拮抗菌 ， 并進行生理 葡萄灰霉病優(yōu)勢拮抗細菌的篩選與鑒定 崔 欣 1 ， 李 偉 2 ， 朱建蘭 3 （ 1. 長春科技學院生物食品學院 ， 吉林長春 130600； 2. 長春長東北開放開發(fā)先導區(qū) （ 長德新區(qū) ） 管理委員會 ， 林長春 130000 ； 3. 甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院 ， 甘肅蘭州 730070 ） 摘要 ： 以葡萄灰霉病病菌為供試菌 ，采用平板對峙法 ， 研究了葡萄果穗附生細菌對葡萄灰霉病的拮抗效果 。 同時 ， 進 行生理生化 、 16S rDNA 序列鑒定與同源性分析 。 結果表明 ， 在分離得到的 13株附生細菌中 ， 其中 11株對葡萄灰霉 病有不同程度的拮抗作用 ， 且拮抗菌的保護作用優(yōu)于治療作用 。 其中 ， B5和 B12對葡萄灰霉病病菌孢子的抑菌率均 為 100%，對葡萄灰霉病病菌菌絲的抑菌率分別為 14 . 49%和 15. 17%，顯著高于其他拮抗菌 （ P 0. 05）。 B5、 B12菌株具 有良好的拮抗和離體抑制效果 ， 拮抗菌鑒定與同源性分析結果表明 ， B5屬于芽孢桿菌屬 ， B12屬于枯草芽孢桿菌 。 關鍵詞 ： 葡萄 ； 灰霉病 ； 拮抗菌 ； 篩選 ； 鑒定 中圖分類號 ： S432.1 文獻標識碼 ： A 文章編號 ： 1672-6820（ 2018 ） 01-0012-05 Sele e Botrytis cinerea Cui Xin 1 , Li Wei 2 , Zhu Jianlan 3 （ 1.College of Biological and Food, Changchun Sci -ech University, Changchun Jilin 130600, China; 2. Changchun long Northeast Open Development Pilot Area anagement Committee, Changchun Jilin 130000, China; 3.College of Pratacultural, Gansu Agricultural University, Lanzhou Gansu 730070, China ） A: Antagonistic effect of adnascent bacteria isolated from grape fruit scion to Botrytis cinerea was studied by plate confrontation method. Physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence of these antagonistic bacteria were determined and analysed. he results showed that 11 strains among 13 isolated bacteria strains had certain function of antagonism against B. cinerea , with more protection function than cure function. Inhibitory rates of B5 and B12 against the conidia germination were both 100%, and those against hyphae were 14.49% and 15.17%, respectively, which were higher than those of other strains significantly （ P 0.05）. B5 and B12 had better inhibiting and antagonistic effect in vitro. Based on antagonistic bacterium identification and homology analysis, B5 strain belonged to Bacillus sp., and B12 strain belonged to B. subtilis. Ke w: grape; Botrytis cinerea ; antagonistic bacterium; selection; identification 收稿日期 ： 2017-07-05 ； 修回日期 ： 2017-11-08 基金項目 ： 長春科技學院青年科研啟動基金 （ 2014CK0642） 作者簡介 ： 崔欣 ， 碩士 ， 講師 ， 研究方向為園林植物配置研究及病害防治 。 - mail ： cuixin1982yeah .net * 通訊作者 ： 朱建蘭 ， 博士 ， 教授 ， 研究方向為病蟲害生物防治 。 - mail ： zhujlgsau .edu .cn 。 12 018 年第 1 期 CIA PLA PROECIO 0 18 ,l. 8 . 1 生化和分子生物學鑒定 ， 以期為葡萄灰霉病生物防 治產品的開發(fā)提供參考 。 1 材料與方法 1 .1 試驗材料 葡萄中抗品種紅地球采摘于甘肅省農業(yè)科學院 葡萄園 。 灰霉病菌種來自感染灰霉病的紅地球葡萄 病果果穗上分離所得 ， 按柯赫氏法則進行純化 ， 經甘 肅農業(yè)大學草業(yè)學院實驗室鑒定為半知菌亞門灰葡 萄孢屬的灰葡萄孢 （ Botrytis cinerea Pers . ）。 PDA 培 養(yǎng)基配制 ： 馬鈴薯 200 g ， 葡萄糖 20 g ， 瓊脂 20 g ， 蒸 餾水 1 000 mL 。 1 . 試驗方法 1 . .1 附生細菌平板對峙試驗 采用復式篩選法 1 2對葡萄果穗附生菌進行分離 篩選 ， 經過平板粗篩和二次篩選 ， 分離得到具有拮抗 作用的拮抗菌 ， 并根據菌落直徑計算抑菌率 。 抑菌率 （ %） =（ 對照菌落直徑 -致病菌菌落的直 徑 ） /對照菌落直徑 100 1 . . 灰霉病孢子萌發(fā)和菌絲生長的抑制試驗 取葡萄灰霉病孢子懸浮液 （ 1 10 7 個 /mL ） 10 L， 加 10 L拮抗菌發(fā)酵液 ， 以 0.5%葡萄糖液作對 照 ， 置無菌潔凈載玻片上 ， 25 培養(yǎng) 8 h 后觀察孢 子萌發(fā) ， 計算拮抗菌發(fā)酵液對病菌孢子萌發(fā)的抑制 率 ； 取灰霉病菌孢子懸浮液 0.5 mL 加入 PDA 培養(yǎng) 基中 。 將直徑為 5 mm 滅菌濾紙片蘸上發(fā)酵液 ， 以無 菌水作對照 ， 25 培養(yǎng) 3 d 后測量抑菌圈直徑 ， 計 算拮抗菌發(fā)酵液對菌絲生長的抑制率 13 。 抑制率 （ %） =（ 對照病斑直徑 -處理病斑直徑 ） / 對照病斑直徑 100 1 . . 離體果防治試驗 選取大小 、 成熟度一致的紅地球葡萄果實 ， 每個 處理為 30 個果粒 ， 隨機分為 5個處理 。 拮抗細菌發(fā) 酵液 （ 1 10 8 cfu/mL ） 組分為 2個處理 ： 一個先刺傷果 皮接灰霉病菌的菌餅 （ 5 mm ）， 24 h 后噴拮抗菌發(fā)酵 液 ； 另一處理先噴拮抗菌發(fā)酵液 ， 24 h 后刺傷果皮 接灰霉病菌的菌餅 ； 拮抗細菌菌懸液 （ 1 10 8 cfu/mL ） 組分為 2個處理 ： 先刺傷果皮接灰霉病菌的菌餅 ， 24 h 后噴拮抗細菌 ； 另一個處理先噴拮抗菌菌懸液 ， 24 h 后刺傷果皮接灰霉病菌的菌餅 ； 以噴無菌水對照 處理 。 在 27 條件下 ， 處理 3 d ， 計算葡萄灰霉病病 情指數和相對抑制率 14 。 病情指數 = （ 各級病果粒 相對級數值 ） /調查 總果粒數 9 100% 相對抑制率 （ %） =（ 對照病情指數 -處理病情指 數 ） /對照病情指數 100 1 . .4 拮抗菌形態(tài)學鑒定 參照 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊 15 進行菌落形態(tài) 和培養(yǎng)特征觀察 ， 革蘭氏染色后觀察菌體形態(tài) 。 1 . .5 分子生物學鑒定 采用苯酚 /氯仿抽提法提取細菌 DNA ， 利用上 游引物 5-GAGCGGAAACAACACACAGG -3， 下游引物 5-CGCCAGGGCCCAGCACGAC -3 進行 16S rDNA 序列擴增 。 反應體系總體積 50 L： 模板 DNA 1 L， 上下游引物各 1 L， 10 buffer 5 L， gCl 2 5 L， dNP 2 L， Taq DNA Polymerase 0 .25 L， ddH 2 O補足至 50 L。 擴增條件 ： 94 預變 性 5 min ， 94 變 性 10 s ， 54 退火 10 s ， 72 延伸 1 min ， 35個 循環(huán) ， 最 后 72 延伸 7 min 。 PCR 產 物經 1%瓊脂糖 凝膠電泳檢 測后 ， 采用 凝膠回收試劑盒 進 行 回收與 純化 。 將 PCR 產 物 送 至 寶 生物 工程 （ 大 連 ） 有 限公司 測序 。 測序 結 果 與 Genebank 已 知序列進行 對 比 ， 利用 mega 構建 系統(tǒng)進化 樹 。 結果與分析 .1 附生細菌對峙試驗結果 從 葡萄病果果穗上分離的附生細菌中得到 13 株 拮抗菌 ， 其 平板對 峙試 驗 結 果見 表 1 。 從 分離 出 的 拮抗細菌中 ， B9和 B13 對葡萄灰霉病 沒 有拮抗作 用 ； 其余 11 種菌對灰霉病 均 有拮抗作用 ， 抑菌率 均 大于 20% ； B5、 B12 對灰霉病的拮抗作用 最強 ， 顯著 高 于 其他 拮抗菌 （ P 0.05 ）； B4 抑菌率 最低 ， 為 16.11% 。 . 拮抗細菌對葡萄灰霉病病菌孢子萌發(fā)和菌絲 生長抑制效果 從 分離的附生細菌中篩選 出 的 11 株 拮抗細菌 ， 對葡萄灰霉病孢子萌發(fā)和菌絲生長抑制 試 驗 結 果 顯 示 ， 菌 株 B12 、 B5對葡萄灰霉病孢子萌發(fā)的抑制率 均 為 100% ， 其 對葡萄灰霉病病菌絲生長抑制率分 別 為 15.17%和 14.49% ， 顯著高 于 其他 拮抗菌 株 （ P 0.05）； 13 018 年第 1 期 CIA PLA PROECIO 0 1 8,l. 8 . 1 菌株編號 抑菌率 （ % ） B5 （ 55.230 1.77） a B12 （ 53.140 2.39） a B11 （ 43.600 2.18） b B1 （ 42.870 1.33） b B3 （ 38.950 2.03） bc B10 （ 38.590 1.54） bcd B2 （ 35.600 1.03） cd B8 （ 34.800 1.32） cd B7 （ 33.040 1.16） d B6 （ 20.640 0.87） e B4 （ 15.130 0.42） e B9 （ 0.003 0.40） f B13 （ 0.003 0.40） f 表 1 葡萄附生細菌拮抗菌葡萄灰霉病病菌平板對峙試驗 1） 1） 不同小寫字母表示差異顯著 （ P 0.05）。 菌株編號 孢子抑制率 （ % ） 菌絲抑制率 （ % ） B12 （ 100.00 1.12） a （ 15.17 0.35） a B5 （ 100.00 1.05） a （ 14.49 0.45） a B1 （ 100.00 0.95） a （ 9.67 0.31） bc B11 （ 100.00 1.06） a （ 8.22 0.28） cd B10 （ 99.84 1.98） a （ 10.61 0.19） b B3 （ 97.17 2.01） ab （ 8.56 0.30） bcd B8 （ 93.84 0.95） bc （ 7.33 0.15） cd B2 （ 90.50 2.03） cd （ 6.31 0.19） de B7 （ 86.84 2.48） d （ 5.55 0.20） e B6 （ 73.67 3.01） e （ 5.55 0.17） e B4 （ 70.67 2.00） e （ 5.55 0.24） e 表 葡萄附生拮抗細菌對葡萄灰霉病病菌孢子 和菌絲的抑制率 1） 1） 同列數據后母不同小寫字母表示差異顯著 （ P 0.05）。 菌株 編號 發(fā)酵液 菌懸液 先接病菌 后接病菌 先接病菌 后接病菌 病情指數 相對抑制 率 （ % ） 病情指數 相對抑制 率 （ % ） 病情指數 相對抑制 率 （ % ） 病情指數 相對抑制 率 （ % ） B1 （ 41.48 2.26） g 53.34 （ 32.22 0.69） g 63.75 （ 47.41 1.36） e 46.66 （ 34.44 1.26） g 61.26 B2 （ 54.80 1.76） de 38.34 （ 45.19 1.35） de 49.16 （ 61.85 2.36） c 30.42 （ 48.52 2.64） e 45.42 B3 （ 55.60 3.18） de 37.50 （ 43.70 1.44） e 50.84 （ 59.26 3.04） c 33.33 （ 49.63 1.66） e 44.17 B4 （ 67.41 2.23） b 24.16 （ 59.26 1.58） b 33.33 （ 69.63 2.94） b 21.67 （ 62.96 1.74） b 29.17 B5 （ 33.33 1.08） h 62.50 （ 16.67 0.68） h 81.25 （ 37.04 1.53） f 58.33 （ 21.11 0.47） h 76.25 B6 （ 65.56 1.92） b 26.25 （ 50.07 1.05） c 43.67 （ 71.85 1.49） b 19.17 （ 59.26 2.68） bc 33.33 B7 （ 57.78 0.99） cd 35.00 （ 49.26 2.08） cd 44.58 （ 67.41 0.98） b 24.16 （ 55.56 1.97） cd 37.50 B8 （ 62.96 1.32） bc 29.17 （ 48.15 1.17） cde 45.83 （ 60.74 1.01） c 31.67 （ 51.85 0.95） de 41.67 B10 （ 48.15 0.87） f 45.83 （ 30.37 2.00） g 65.83 （ 48.89 1.48） e 45.00 （ 32.22 0.95） g 63.75 B11 （ 51.11 1.06） ef 42.50 （ 37.78 1.09） f 57.50 （ 53.33 2.02） d 40.00 （ 40.00 1.85） f 55.00 B12 （ 35.56 0.59） h 60.00 （ 19.26 0.67） h 78.33 （ 38.15 0.96） f 57.08 （ 24.81 0.86） h 72.09 CK （ 88.89 3.06） a 0 （ 88.89 3.06） a 0 （ 88.89 3.06） a 0 （ 88.89 3.06） a 0 表 葡萄附生拮抗細菌菌懸液與其發(fā)酵液對離體果粒上葡萄灰霉病病菌的抑菌效果 1） 1） 同列數據后不同小寫字母表示差異顯著 （ P 0.05）。 除 B7 、 B6 和 B4 外 ，其他拮抗菌對灰霉病孢子抑制率 均大于 90% ， B4 對其孢子抑制率最低 ； B12 、 B5 和 B10 對葡萄灰霉病病菌絲抑菌率大于 10% ， B7 、 B6 和 B4 對葡萄灰霉病病菌絲抑菌率最低 （ 表 2）。 . 對葡萄離體果粒灰霉病病菌的抑制效果 葡萄離體果灰霉病病菌生物抑制試驗結果如表 3所示 。 相同拮抗菌條件下 ， 后接病菌處理組的病情 指數和相對抑制率明顯優(yōu)于先接病菌處理組 ， 拮抗 菌發(fā)酵液后接病菌處理組的病情指數和相對抑制率 優(yōu)于懸浮液后接菌處理組 ； 11種拮抗菌中 ， B5 和 B12 的病情指數顯著低于其他拮抗菌 （ P 0. 05）， B5 和 B12 的相對抑制率均高于其他拮抗菌 ； B4 病情指 數最高 ， 相對抑制率最低 。 對照組病情指數為 88. 89。 .4 優(yōu)勢拮抗細菌培養(yǎng)特征與染色反應 優(yōu)勢拮抗細菌 B5 、 B12 培養(yǎng)特征和染色反應如 14 018 年第 1 期 CIA PLA PROECIO 0 18 ,l. 8 . 1 a b c d a. B5單菌落 b. B5革蘭氏染色 c. B12單菌落 d. B12革蘭氏染色 圖 1 葡萄附生拮抗菌株 B5 、 B1 的培養(yǎng)性狀 及革蘭氏染色反應 2 000 bp 1 000 bp 2 000 bp 1 2 . arker DL2000 1. B5 2. B12 圖 葡萄附生拮抗菌株 B5 、 B1 的 1S DA 擴增圖譜 B5 Bacillus sp. （ F471916.1） Bacillus subtilis . （ AB195282.1 ） B12 0.01 圖 葡萄附生拮抗優(yōu)勢菌株 B5 、 B1 系統(tǒng)發(fā)育學地位 圖 1所示 。 B5菌落圓形 ， 白色 ， 稍隆起 ， 邊緣整齊 ， 中 間有小突起 ， 不透明 。 菌落大小一致 ， 直徑約 2.5 mm 。 菌體桿狀 ， 革蘭氏染色呈陽性 （ 圖 1a 、 b ）。 B12菌 落圓形 ， 灰白色 ， 隆起 ， 邊緣不整齊 ， 表面光滑發(fā)亮 ， 菌落大小一致 ， 直徑約 2 mm ， 革蘭氏染色陽性 ， 菌體 桿狀 （ 圖 1c 、 d ）。 .5 細菌的 16S rDNA 檢測 優(yōu)勢拮抗菌的 16S rDNA 擴增結果如圖 2所 示 。 B5和 B12分別在 1 500 bp 左右處有 1條明亮 的 PCR 特異性條帶 ， 經測序片段大小為 1 465 bp 。 優(yōu)勢拮抗菌系統(tǒng)發(fā)育樹如圖 3所示 。 B5與芽孢 桿菌屬 （ Bacillus sp . F471916 .1） 親緣關系最近 ， 同 源性為 99% ， 確定 B5屬于芽孢桿菌屬 （ Bacillus sp . ）； B12與枯草芽孢桿菌屬 （ Bacillus subtilis . AB- 195282.1） 親緣關系最近 ， 同源性為 100% ， 確定 B12 屬于枯草芽孢桿菌 （ Bacillus subtilis ）。 結論與討論 目前 ， 葡萄灰霉病的防治仍以化學防治為主 ， 但 化學殺菌劑容易造成農藥殘留 、 環(huán)境污染以及抗藥 性等問題 4-7 。 生物防治特別是拮抗菌的開發(fā)已成 為葡萄灰霉病的研究熱點 。 葡萄果實內部 、 果穗 、 葉 面等區(qū)域附生有大量的真菌 、 細菌 、 酵母菌等微生 物 1 6-17 ， 已先后分離出了木霉菌 、 類鼻疽假單胞桿 菌 、 鼻疽假單胞桿菌 、 枯草芽孢桿菌 、 高溫芽孢桿菌 、 嗜熱溶胞桿菌等多種對葡萄灰霉病具有拮抗作用的 微生物 1 7-20 。 本研究從葡萄品種果穗中分離出了 11 種對葡萄灰霉病具有拮抗作用的細菌 ， 其中 B5、 B12 兩種拮抗菌的抑菌率和離體果的抑菌效果均顯著優(yōu) 于其他菌株 。 經生理生化和 16S rNDA 鑒定 ， B5、 B12 分別為芽孢桿菌屬和枯草芽孢桿菌 ， 與前人研究結 果一致 。 通過離體果的防治試驗發(fā)現 ， 先噴施拮抗菌發(fā) 酵液后接種病原菌的防治效果 ， 優(yōu)于先接種病原菌 而后噴施拮抗菌發(fā)酵液的防治效果 。 表明拮抗菌的 保護作用好于治療作用 。 可能是由于拮抗菌在果實 傷口處定殖 ， 快速增長的拮抗菌有助于其與病原菌 15 018 年第 1 期 CIA PLA PROECIO 0 1 8,l. 8 . 1 （ 上接第 51 頁 ）病發(fā)病率明顯下降 。 參考文獻 1 和秋菊 ， 易傳輝 . 曲足侎緣蝽生物學特性及防治 J . 浙 江林業(yè)學報 ， 2008， 25 （ 3）： 363-366 . 2 黃蔭規(guī) . 肉桂泡盾盲蝽生物學特性及防治 J . 廣西植 保 ， 1997 ， 10（ 5）： 5-9 . 3 劉建峰 ， 楊五烘 ， 李敦松 ， 等 . 肉桂新害蟲泡盾盲蝽的生 物學特性及防治研究 J . 廣東農業(yè)科學 ， 1995 ， 14（ 1）： 36-39. 4 蕭采瑜 . 中國蝽類昆蟲鑒定手冊 ： 第 1冊 . 北京 ： 科 學出版社 ， 1977 ： 208-209 . 5 朱志建 ， 潘國良 ， 朱煒 ， 等 . 樟頸曼盲蝽生物學特性研究 J . 浙江林業(yè)科技 ， 2012 ， 32（ 5）： 42-45 . 6 文新 ， 宋力 ， 黎啟槍 ， 等 . 肉桂枝枯病病原研究 J . 微生 物學報 ： 1995 ， 35（ 3）： 152-185 . 7 張翠疃 ， 李大亂 ， 蘇海峰 ， 等 . 茶翅蝽和黃斑蝽生物學特 性研究 J . 林業(yè)科學研究 ， 1993， 6（ 3）： 271-274 . 之間的營養(yǎng)競爭 21 ， 也可能與拮抗菌誘導寄主產生 抗病性或直接與病原菌作用等機制有關 。 本試驗研究了葡萄附生拮抗細菌菌懸液與其發(fā) 酵液對離體果粒上葡萄灰霉病病菌的抑菌作用 ， 但 實際田間應用會受到細菌定殖 、 自然環(huán)境和管理等 多種因素的影響 ， 而且細菌間存在一定的拮抗和協(xié) 同作用 ， 為了研究開發(fā)高效的葡萄灰霉病防治產品 ， 需對復合拮抗菌的防效以及田間試驗進行深入研 究 。 參考文獻 1 韓之琪 ， 賁海燕 ， 謝學文 ， 等 . 灰葡萄孢對殺菌劑抗性研 究進展 J . 中國蔬菜 ， 2014， 1（ 5）： 6-10. 2 嚴紅 ， 燕繼曄 ， 王忠躍 ， 等 . 葡萄灰霉病病菌對 3種殺菌 劑的多重抗藥性檢測 J . 果樹學報 ， 2012 （ 4）： 625-629 . 3 陳宇 飛 ， 文 景芝 ， 李 立軍 . 葡萄灰霉病研究進展 J . 東 北農業(yè)大學學報 ， 2006， 37（ 5）： 693-699. 4 陳 玲 ， 王 小艷 . 葡萄采 后 生理生 化 特 征 及 貯藏 保 鮮 技 術 的研究進展 J . 食 品 安全 導 刊 ， 2014 （ 20）： 70-72 . 5 李明 娟 ， 游向榮 ， 文 仁德 ， 等 . 葡萄果實采 后 生理及 貯藏 保 鮮方法 研究進展 J . 北 方園藝 ， 2013（ 20）： 173-178 . 6 Fern ndez - Ortu o D ， Grabke A ， Bryson P K ， et al . 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