33(3)385-393               中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)  Chinese Journal of Biological Control                    2017 年 6 月  收稿日期： 2016-12-29 基金項(xiàng)目：國(guó)家公益 性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（ 201303015） ；福建省自然科學(xué)基金（ 2015J01103） ；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年人才創(chuàng)新基金（ YC2016-15）  作者簡(jiǎn)介：鄭雪芳，副研究員， E-mail： zhengxuefangfz163.com； *通信作者，研究員， E-mail： liubofaas163.com。 DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2017.03.013 青枯病植物疫苗對(duì)番茄根系土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響  鄭雪芳，劉 波*，朱育菁 （福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福州 350003）  摘要： 為了探討青枯雷爾氏菌無(wú)致病力菌株 FJAT1458 作為青枯病植物疫苗菌株對(duì)番茄根系土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響， 利用磷脂脂肪酸 （ phospholipid fatty acids， PLFAs） 生物標(biāo)記法研究植物疫苗菌株 FJAT1458接種處理后番茄根系土壤微生物 PLFAs 組成、含量、微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的變化。結(jié)果表明，與清水對(duì)照相比，接種菌株 FJAT1458 后，番茄根系土壤微生物脂肪酸組成及含量發(fā)生了明顯變化，可分為減少型、無(wú)變化型和增加型。進(jìn)一步分析表明，菌株 FJAT1458 能促進(jìn)番茄根系土壤微生物總量、細(xì)菌總量和真菌總量的增加，增加幅度分別為 5.98% 47.36%、 2.07% 58.07%和 5.65% 74.42%，對(duì)放線(xiàn)菌生長(zhǎng)起到先抑制后促進(jìn)作用。此外，接種菌株 FJAT1458 后番茄根系土壤微生物群落的 Shannonwiener 指數(shù)顯著增加， 21 d 增加量最高（ 13.32%） 。聚類(lèi)分析表明，菌株 FJAT1458 處理組與對(duì)照組的番茄根系土壤微生物均劃分為 3 個(gè)群落類(lèi)型（蘭氏距離分別為 3.28 和 4.62） ，但它們各自群落組成及特征不同；同時(shí)主成分分析也將 2 種處理劃分在 2 個(gè)不同類(lèi)群中。 上述結(jié)果說(shuō)明菌株 FJAT1458 處理能明顯改變番茄根系土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，增加其多樣性，從而提高土壤微生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，增強(qiáng)土壤抑制病害能力。  關(guān)  鍵  詞： 植物疫苗；番茄；土壤微生物群落結(jié)構(gòu)；磷脂脂肪酸 中圖分類(lèi)號(hào)： S476    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A    文章編號(hào)： 1005-9261(2017)03-0385-09 Effects of Avirulent Ralstonia solanacearum Strain as Plant Vaccine on Microbial Community in Rhizosphere Soil of Tomato ZHENG Xuefang, LIU Bo*, ZHU Yujing (Agricultural Bio-Resources Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China) Abstract: In order to explore the effect of avirulent Ralstonia solanacearum strain FJAT-1458 as plant vaccine on microbial community structures in tomato rhizosphere soil, tomato plants were inoculated by FJAT-1458 with water as a control. Then the rhizosphere soil was sampled at 3, 6, 9, 12, 15, 18 and 21 d after treatment, respectively. Phospholipid fatty acids (PLFAs) of soil samples were detected using Agilent 6890 N. The results showed that PLFAs composition and content in tomato rhizosphere soil were significantly altered by inoculation of FJAT-1458, which could be divided into decreasing type, unchanging type and increasing type. Further statistical analysis showed that the inoculation of FJAT-1458 could increase the content of total microbes, bacteria and fungi by 5.98% 47.36%, 2.07% 58.07% and 5.65% 74.42%, respectively. Growth of actinomycetes was inhibited at the beginning and then improved by FJAT-1458 inoculation. Moreover, inoculation of FJAT-1458 could increase the microbial community diversity in tomato rhizosphere soil, and the enhancement of Shannon-wiene index was the most significant, with the highest value of 13.32% at 21 d after inoculation. Cluster analysis revealed that the microbe in tomato rhizosphere soil both in FJAT-1458 treatment and control could be divided into three communities at 3.28 and 4.62 Lance distance, but constitutes and characters of PLFAs between the two treatments were different. Principal component analysis demonstrated that the two treatments could also be distinguished into 386             中  國(guó)  生  物  防  治  學(xué)  報(bào)    第 33 卷  two different groups. All these suggested that inoculation of FJAT-1458 could alter microbial community structure in tomato rhizosphere soil and increase its diversity, and further improve the stability of soil micro-ecosystem and the ability for bacterial wilt disease control. Key words: plant vaccine; tomato; soil microbial community structure; PLFAs 番茄青枯病是由青枯雷爾氏菌 Ralstonia solanacearum 引起的一種毀滅性土傳病害1。近年來(lái)，隨著農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，蔬菜種植面積擴(kuò)大，復(fù)種指數(shù)連年提高，番茄青枯病的發(fā)生與危害呈逐年加重趨勢(shì)，據(jù)調(diào)查，輕病田減產(chǎn) 10%，重病田減產(chǎn) 50%以上，嚴(yán)重制約著番茄種植面積的擴(kuò)大和經(jīng)濟(jì)效益的提高2。盡管對(duì)番茄青枯病的防治已有很多研究報(bào)道，如栽培措施、作物輪作、抗性品種及藥劑防治等，但當(dāng)茬番茄發(fā)病未見(jiàn)有效的防治措施3。  青枯雷爾氏菌在自然條件下存在著豐富的致病力分化，形成強(qiáng)致病力菌株、過(guò)渡型菌株和無(wú)致病力菌株4-6，其無(wú)致病力菌株可以侵染植株，對(duì)植株不造成病害，在導(dǎo)管及相鄰組織內(nèi)蔓延，形成免疫抗病特性，延緩或防止植株發(fā)病7。利用青枯雷爾氏菌無(wú)致病力突變菌株防治作物青枯病是目前國(guó)際上研究熱點(diǎn)，研究人員通過(guò)自然分離篩選、輻射誘變、基因工程（轉(zhuǎn)座子 Tn5 插入）等途徑獲得青枯雷爾氏菌的無(wú)致病力突變菌株，用于防治青枯病，均取得良好的防治效果8-10。劉波等11提出利用青枯雷爾氏菌無(wú)致病力菌株作為植物疫苗，在作物苗期預(yù)先接種，可對(duì)青枯病的防治起到良好的作用。作者經(jīng)多年研究篩選到一株對(duì)番茄青枯病防效好， 性狀穩(wěn)定的青枯雷爾氏菌無(wú)致病力菌株 FJAT1458， 利用該菌株研發(fā)青枯病植物疫苗，在田間應(yīng)用取得理想效果12。  許多研究證明青枯雷爾氏菌無(wú)致病力菌株能有效地控制青枯病的發(fā)展，并從多種途徑解析其作用機(jī)理，如誘導(dǎo)抗性、營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、免疫抗病等。已有文獻(xiàn)報(bào)道青枯病發(fā)生與植株根系土壤微生物群落結(jié)構(gòu)關(guān)系密切13,14，如匡傳富等13研究表明煙草青枯病發(fā)病重土壤中細(xì)菌和真菌含量高，放線(xiàn)菌含量低，發(fā)病輕田塊土壤則相反。傳統(tǒng)對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)研究是稀釋平板分離微生物，分離出的微生物只占總數(shù) 0.1%1%，不能全面反映土壤微生物多樣性信息15。磷脂脂肪酸（ phospholipid fatty acids， PLFAs）生物標(biāo)記具有微生物種類(lèi)遺傳穩(wěn)定性16，可以標(biāo)識(shí)出微生物種類(lèi)和數(shù)量，用于檢測(cè)土壤樣本中微生物群落的變化，具有方法簡(jiǎn)便、可定量分析、精確度高等特點(diǎn)17。利用 PLFAs 生物標(biāo)記研究，有望觀(guān)察到青枯病植物疫苗施用到番茄根部控制青枯病過(guò)程根際微生物群落結(jié)構(gòu)變化，從微生物群落的角度尋找植物疫苗防病機(jī)制。相關(guān)的研究未見(jiàn)報(bào)道。  本研究對(duì)番茄植株接種青枯病植物疫苗菌株 FJAT1458（青枯雷爾氏菌無(wú)致病力菌株），采用 PLFAs標(biāo)記研究接種后番茄植株根系土壤微生物脂肪酸組生態(tài)學(xué)特性的變化， 分析植物疫苗菌株 FJAT1458 對(duì)番茄根系土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，從生態(tài)學(xué)角度揭示青枯病植物疫苗構(gòu)建的根際微生物群落影響番茄免疫抗病的機(jī)制，為青枯病植物疫苗作用機(jī)制的解析提供新思路。  1  材料與方法  1.1  供試材料 供試番茄品種為金石王 1 號(hào)（廈門(mén)如意集團(tuán)開(kāi)發(fā)有限公司）。青枯病植物疫苗菌株 FJAT1458 分離于感染番茄青枯病的田塊中表現(xiàn)健康的植株，由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所菌種庫(kù)收集保存。培養(yǎng)青枯雷爾氏菌的固體培養(yǎng)基 TTC 的配制參照 Kelman18，液體培養(yǎng)基為 SPA（蔗糖 20 g，蛋白胨 5 g，KH2PO4 0.5 g， MgSO4 0.025 g，定容至 1 L， pH 7.0）。   1.2  菌株 FJAT1458 接種番茄植株和取樣方法  菌株 FJAT1458 在 TTC 平板上活化后，接種于 SPA 培養(yǎng)基中， 30 、 170 r/min 培養(yǎng) 48 h，菌液稀釋至 1 108cfu/mL，傷根接種于 5 6 葉齡的番茄盆栽苗上（番茄苗種植于直徑 15 cm，高 10 cm 的塑料盆，育苗基質(zhì)土購(gòu)自廈門(mén)銀農(nóng)種苗有限公司， 3 kg/盆， 1 棵 /盆），接種量為 80 mL/盆，每個(gè)處理 30 盆，設(shè)清水對(duì)照 30 盆。在接種后第 3、 6、 9、 12、 15、 18 和 21 d 取樣。取樣方法：分 3 組取樣，為 3 個(gè)重復(fù)，即每 10 盆處理組和 10 盆對(duì)照組為 1 組，收集離表層約 5 cm 的根系土壤，每盆土樣約 5 g，再將相同處理  第 3 期               鄭雪芳等：青枯病植物疫苗對(duì)番茄根系土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響  387 組和對(duì)照組的各小樣混合、拌勻、碾碎，通風(fēng)陰涼處自然晾干，過(guò) 40 目篩， 80 冰箱保存?zhèn)溆谩? 1.3  PLFAs 分析方法  土壤樣本 PLFAs 提取和分析方法參照 Frostegrd 等19和 Kourtev 等20方法進(jìn)行。 具體步驟如下： 50 mL離心管中加入 10 g 土壤樣本和 20 mL 0. 2 mol/L 的 KOH 甲醇溶液，渦懸、充分混勻， 37 水浴 1 h，釋放脂肪酸并甲酯化；加入 3 mL 1.0 mol/L 醋酸溶液，渦懸、充分混勻，中和 pH；加入 10 mL 正己烷，充分搖勻，使脂肪酸轉(zhuǎn)到有機(jī)相中， 2000 r/min 離心 15 min，將上層正己烷相轉(zhuǎn)入干凈玻璃試管中，利用 N2吹儀吹干有機(jī)溶劑；加入 0.5 mL 體積比為 1:1 的正己烷和甲基叔丁基醚混合溶液，充分溶解，轉(zhuǎn)入 GC 小瓶，用于 PLFAs 測(cè)定。  采用 Agilent 6890 N 型氣相色譜儀測(cè)定樣本的 PLFAs：分流進(jìn)樣，分流比為 100:1，進(jìn)樣量 l L，載氣為氫氣，流速 2 mL/min，尾吹氣為氮?dú)?，流速?30 mL/min。二階程序升高柱溫：以 5 /min 的速率使柱溫由 170 升至 260 ；再以 40 /min 的速率升溫至 310 ，保持 90 s。汽化室溫度為 250 ，檢測(cè)器溫度為 300 ，柱前壓 10.00 Psi。采用美國(guó) MIDI 公司開(kāi)發(fā)的 Sherlock MIS 4.5 系統(tǒng)進(jìn)行 PLFAs 成分分析，系統(tǒng)根據(jù)各組分保留時(shí)間計(jì)算等鏈長(zhǎng)（ ECL）值以確定目標(biāo)組分的存在，采用峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)含量。 1.4  數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 1.4.1  微生物種類(lèi)的 PLFAs 生物標(biāo)記的識(shí)別   磷脂脂肪酸是活體微生物細(xì)胞膜的重要組分， 可以很好地標(biāo)識(shí)微生物的生物量21。其中， 16:15c、 18:15c、 18:17c、 18:19c、 18:26,9c 等多烯脂肪酸為真核生物所獨(dú)有22，其總和可指示真菌生物量；而一些含有以酯鏈與甘油相連的飽和或單不飽和脂肪酸如 i15:0、a15:0、 16:0、 i16:0 等的總和可代表細(xì)菌生物量，指示土壤細(xì)菌分布數(shù)量23；指示放線(xiàn)菌的脂肪酸種類(lèi)有10Me16:0、 10Me17:0 和 10Me18:024，各類(lèi)群微生物對(duì)應(yīng)的磷脂脂肪酸標(biāo)記具體見(jiàn)表 1。  微生物總量 每種 PLFAs 含量；細(xì)菌總量 （ 12:0 14:0 16:0 18:0 19:0 20:0 i14:0i15:0 i16:0 i17:0 a15:0 a16:0 a17:0 cy17:0 cy19:08c i15:0 2OH 16:1 2OH）；真菌總量 （ 16:15c 18:15c 18:17c 18:19c 18:26,9c）；放線(xiàn)菌總量 （ 10Me16:0 10Me17:010Me18:0）。  表 1  估算各類(lèi)群微生物的磷脂脂肪酸標(biāo)記  Table 1  PLFAs biomarkers for calculating soil microbial biomass 微生物類(lèi)型  Microbial type 磷脂脂肪酸標(biāo)記  PLFAs biomarkers 參考文獻(xiàn)  Reference 細(xì)菌  Bacteria in genera 12:0、 14:0、 16:0、 18:0、 19:0、 20:0、 i14:0、 i15:0、 i16:0、 i17:0、 a15:0、a16:0、 a17:0、 cy17:0、 cy19:08c、 i15:0 2OH、 16:1 2OH 23,25 革蘭氏陽(yáng)性菌  Gram positive bacterial i14:0、 i15:0、 i16:0、 i17:0、 a15:0、 a16:0、 a17:0 26,27革蘭氏陰性菌  Gram negative bacterial cy17:0 26,28 好氧細(xì)菌  Aerobic bacteria i14:0、 i15:0、 a15:0、 i15:0 2OH 29 嗜熱解氫桿菌  Hydrogeno bacteria 18:0 30 伯克霍爾德菌 Burkholderia bacteria cy19:08c 19放線(xiàn)菌  Actinobacteria 10Me16:0、 10Me17:0、 10Me18:0 21,24真菌  Fungi 16:15c、 18:15c、 18:17c、 18:19c、 18:26,9c 22 1.4.2  微生物群落多樣性指數(shù)分析  引入群落生態(tài)學(xué)豐富度指數(shù) ShannonWiener 和優(yōu)勢(shì)度指數(shù) Simpson分析不同處理及時(shí)間番茄根系土壤微生物群落的多樣性。按照計(jì)算物種指數(shù)方法31計(jì)算各指數(shù)值。ShannonWiener 指數(shù)： H PilnPi； Simpson 指數(shù)： C 1 （ ni/N）2。式中， S 為群落中的脂肪酸總種類(lèi)數(shù)， Pi ni/N， ni為 i 類(lèi)脂肪酸個(gè)數(shù)， N 為該試驗(yàn)中總脂肪酸個(gè)數(shù)。  1.4.3  聚類(lèi)分析   采用 DPS 7.05 軟件，以 PLFAs 生物標(biāo)記為樣本，以其在不同處理及取樣時(shí)間分布數(shù)量為指標(biāo)，構(gòu)建矩陣，將數(shù)據(jù)進(jìn)行中心化處理，以蘭氏距離為聚類(lèi)尺度，類(lèi)平均法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)，分析接種植物疫苗對(duì)番茄根系土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。  1.4.4  主成分分析   采用 DPS 7.05 軟件，以供試樣品為樣本，以每種 PLFAs 在供試樣品的分布量為指標(biāo)，  388             中  國(guó)  生  物  防  治  學(xué)  報(bào)    第 33 卷  進(jìn)行主成分分析，主成分分析過(guò)程采用 DPS 7.05 軟件的相關(guān)模塊進(jìn)行處理，主要包括求協(xié)方差矩陣、計(jì)算特征方程中所有特征值、根據(jù)特征值累積百分率確定主成分的數(shù)量、計(jì)算主成分載荷值和主成分分析因子得分等，具體步驟參見(jiàn)文獻(xiàn) 32。  2  結(jié)果與分析   2.1  植物疫苗接種后番茄根系土壤微生物 PLFAs 測(cè)定  菌株 FJAT1458 接種后第 3、 6、 9、 12、 15、 18 和 21 d 的番茄根系土壤分別檢測(cè)到 25、 25、 24、 24、24、 25 和 24 種 PLFAs，對(duì)照組第 3、 6、 9、 12、 15、 18 和 21 d 的番茄根系土壤分別檢測(cè)到 23、 21、 20、23、 21、 21 和 18 種 PLFAs。 PLFAs 的種類(lèi)繁多，包含各種飽和磷脂脂肪酸如 12:0、 14:0、 16:0 等，不飽和的磷脂脂肪酸如 16:15c、 18:15c、 18:17c 等，分支的磷脂脂肪酸如 a15:0、 a16:0、 a17:0 等，環(huán)化脂肪酸如 cy17:0 和 cy19:08c。  2.2  植物疫苗接種番茄根系土壤微生物 PLFAs 組成及含量變化 統(tǒng)計(jì)菌株 FJAT1458 接種處理和對(duì)照組的番茄根系土壤在取樣期內(nèi)各微生物 PLFAs 總含量，計(jì)算植物疫苗菌株 FJAT1458 接種后番茄根系土壤各類(lèi)微生物 PLFAs 總量增加或降低百分比。與對(duì)照相比，菌株 FJAT1458 處理后，可將 PLFAs 含量的變化分為 3 類(lèi)，第 1 類(lèi)為減少型：（ 1）指示細(xì)菌的飽和脂肪酸12:0、 14:0、 18:0、 19:0 和 20:0 含量減少幅度為 15.49% 41.12%；（ 2）指示革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的分支脂肪酸 i17:0 和 a16:0，二者的含量分別降低 15.00%和 16.67%；（ 3）環(huán)化脂肪酸 cy19:08c 和羥基脂肪酸16:1 2OH 含量分別降低 23.03%和 17.99%。第 2 類(lèi)為無(wú)變化型：包含了細(xì)菌特征的脂肪酸 16:0 和放線(xiàn)菌特征的脂肪酸 10Me16:0。 第 3 類(lèi)型為增加型： （ 1） 指示真菌的不飽和脂肪酸 16:15c、 18:15c、 18:17c、18:19c 和 18:26,9c 的含量均增加，增加幅度為 9.53% 91.40%；（ 2）分支脂肪酸除了 i17:0 和 a16:0為減少型，其他均為增加型，其含量增加幅度為 29.14% 207.27%。（ 3）指示革蘭氏陰性細(xì)菌的環(huán)化脂肪酸 cy17:0 含量增加了 56.68%（圖 1）。  12:014:016:018:019:020:0i14:0i15:0i16:0i17:0a15:0a16:0a17:010Me 16:010Me 17:010Me18:016:1 5c18:15c18:1 7c18:19c18:26,9ccy17:0cy19:0 8ci15:0 2OH16:1 2OHPLFAs含量增加或降低百分比Percentage ofincreasing or decreasing PLFAscontent (%)圖 1  菌株 FJAT1458 接種后取樣期內(nèi)番茄根系土壤微生物各類(lèi)型 PLFAs 總量比對(duì)照增加或降低百分比  Fig. 1  Percentage of increasing or decreasing of PLFAs content in tomato root zone soil under strain FJAT1458 treatment during sampling times, while compared with water control 2.3  植物疫苗接種對(duì)番茄根系土壤 PLFAs 標(biāo)識(shí)特征微生物數(shù)量變化動(dòng)態(tài)  菌株 FJAT1458 處理后的不同時(shí)間番茄根系土壤微生物總量均比對(duì)照組高， 增加量為 5.98% 47.36%（圖 2A），其中菌株 FJAT1458 處理后 15 和 21 d 增加量分別為 47.36%和 24.89%，達(dá)極顯著水平（ P0.01），其他處理時(shí)間的差異達(dá)顯著水平（ P 0.05），說(shuō)明接種菌株 FJAT1458 能夠富集番茄根系土壤的微生物。 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)， 菌株 FJAT1458 處理能夠促進(jìn)番茄根系土壤細(xì)菌的生長(zhǎng)， 增加幅度為 2.07%58.07%，但是除了處理后 15 d（增加量為 58.07%）和 21 d（增加量為 29.92%）的差異達(dá)極顯著（ P 0.01）第 3 期               鄭雪芳等：青枯病植物疫苗對(duì)番茄根系土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響  389 外，其余處理時(shí)間的差異未達(dá)顯著水平（圖 2B）。菌株 FJAT1458 處理后不同時(shí)間對(duì)番茄根系土壤真菌促長(zhǎng)與細(xì)菌相似，增加量為 5.65% 74.42%（圖 2C）。與對(duì)照相比，菌株 FJAT1458 處理后番茄根系土壤放線(xiàn)菌含量先降低后增長(zhǎng)，但均未達(dá)顯著水平（圖 2D）。  微生物總量Contentof totalmicrobes  (nmol/g)細(xì)菌總量Content oftotalbacteria  (nmol/g)真菌總量Contentof totalfungi  (nmol/g)放線(xiàn)菌總量Contentoftotal actinomycete (nmol/g)注： *表示 0.05 水平差異顯著， *表示 0.01 水平差異顯著。  Note: * indicated significant difference at 0.05 level, and * indicated significant difference at 0.01 level 圖 2  菌株 FJAT1458 接種后不同時(shí)間番茄根系土壤 PLFAs 標(biāo)識(shí)的特征微生物含量的變化  Fig. 2  Alternation of PLFAs content related to the special microbe in the tomato root zone soil under strain FJAT1458 treatment at different sampling times 2.4  植物疫苗接種對(duì)番茄根系土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性影響 Simpson 指數(shù)反映群落中常見(jiàn)的物種數(shù)量， Shannonwiener 指數(shù)反映群落中物種的豐富度33。與對(duì)照相比，取樣期內(nèi)菌株 FJAT1458 處理的番茄根系土壤微生物群落的 Simpson 指數(shù)增加，但差異不明顯，Shannonwiener 指數(shù)均比對(duì)照高，且差異顯著，處理后 21 d，菌株 FJAT1458 處理的 Shannonwiener 增加量最高達(dá) 13.32%（表 2）。  表 2  菌株 FJAT1458 接種后不同時(shí)間番茄根系土壤微生物群落多樣性指數(shù)  Table 2  Microbial community diversity index of tomato root zone soil under strain FJAT1458 treatment at different sampling times  Simpson 指數(shù)  Simpson index Shannon-Wiener 指數(shù) Shannon-Wiener index 項(xiàng)目  Items 3 d 6 d 9 d 12 d 15 d 18 d 21 d 3 d 6 d 9 d 12 d 15 d 18 d 21 d 處理  Treatment 0.94 a 0.94 a 0.93 a 0.93 a 0.94a 0.94 a 0.94 a 4.29 a 4.19 a 4.15 a 4.17 a 4.18 a 4.18 a 4.17 a對(duì)照  Control 0.93 a 0.92 a 0.92 a 0.94 a 0.93 a 0.94 a 0.92 a 4.14 b 3.97 b 3.92 b 3.82 b 3.93 b 3.93 b 3.68 b注：表中同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（ P 0.05）。  Note: Data followed by the different lowercase letters within a column indicated significantly different (P 0.05). 2.5  植物疫苗接種對(duì)番茄根系土壤微生物群落分化的影響  接種植物疫苗菌株 FJAT1458 和對(duì)照對(duì)番茄根系土壤微生物群落分化影響不同，當(dāng)蘭氏距離為 3.28時(shí)，可將菌株 FJAT1458 處理的番茄根系土壤微生物 PLFAs 生物標(biāo)記劃分為 3 個(gè)群落類(lèi)型，類(lèi)型包含12:0、 20:0、 a16:0 和 16:1 2OH 4 條 PLFAs 生物標(biāo)記，其特征是脂肪酸生物標(biāo)記在各樣本中分布量?。?90             中  國(guó)  生  物  防  治  學(xué)  報(bào)    第 33 卷  類(lèi)型共有 17 條 PLFAs， 分別為 14:0、 10Me17:0、 16:15c、 18:0、 cy19:08c、 i17:0、 10Me18:0、 cy17:0、19:0、 a17:0、 18:17c、 18:26,9c、 i15:0 2OH、 10Me16:0 和 i14:0，其特征為分布量中等；類(lèi)型含有16:0、 a15:0、 i15:0、 i16:0、 18:19c 和 18:15c 共 6 條脂肪酸生物標(biāo)記，其特征是分布量大（圖 3A）。  當(dāng)蘭氏距離為 4.62 時(shí)，可將對(duì)照處理的番茄根系土壤微生物 PLFAs 生物標(biāo)記劃分為 3 個(gè)群落類(lèi)型，類(lèi)型包含 12:0、 a16:0、 16:15c、 20:0、和 i15:0 2OH 5 條 PLFAs 生物標(biāo)記，其特征為不完全分布類(lèi)型即只在部分樣本中分布， 且分布量?。?類(lèi)型共有 18 條 PLFAs， 分別為 14:0、 10Me17:0、 i17:0、 18:17c、a17:0、 10Me18:0、 16:1 2OH、 19:0、 18:26,9c、 i15:0、 i16:0、 a15:0、 10Me16:0、 18:15c、 18:0、 18:19c、cy19:08c 和 cy17:0，其特征為分布量不均勻，在有些樣本中分布量較大，而在另一些樣本中分布量低或沒(méi)有分布； 類(lèi)型只含有 16:0 一條脂肪酸生物標(biāo)記， 其特征是分布量大， 且在各樣本中均有分布 （圖 3B） 。  蘭氏距離  Lance distance0.00 0.82 1.64 2.46 3.28 4.10 0.00 0.95 1.90 2.86 3.81 4.76蘭氏距離  Lance distance12:020:0a16:016:1 2OH14:010Me 17:016:15c18:0cy19:08ci17:010Me 18:0cy17:019:0a17:018:17c18:26,9ci15:0 2OH10Me16:0i14:016:0a15:0i15:0i16:018:19c18:15c12:0a16:016:15ci14:020:0i15:0 2OH14:010Me 17:0i17:018:17ca17:010Me 18:016:1 2OH19:018:26,9ci15:0i16:0a15:010Me16:018:15c 18:018:19ccy19:08ccy17:016:0AB圖 3  菌株 FJAT1458 處理 （ A） 和對(duì)照 （ B） 的番茄根系土壤微生物群落 PLFAs 聚類(lèi)分析  Fig. 3  Cluster analysis of PLFAs structures in the tomato root zone soil under strain FJAT1458 treatment (A) and control (B) 2.6  植物疫苗接種后番茄根系土壤微生物群落時(shí)間動(dòng)態(tài)的主成分分析 主成分 1（ PC1）和主成分 2（ PC2）將菌株 FJAT1458 處理和對(duì)照不同時(shí)間的番茄根系土壤分別劃分在 2 個(gè)不同類(lèi)群。菌株 FJAT1458 處理不同時(shí)間的番茄根系土壤與 PC1呈正相關(guān)，對(duì)照不同時(shí)間的番茄根系土壤與 PC1呈負(fù)相關(guān)。 菌株 FJAT1458 處理 3 d 的番茄根系土壤與對(duì)照 3 d 的番茄根系土壤在 PC1和 PC2坐標(biāo)的零點(diǎn)附近，說(shuō)明接種植物疫苗菌株 FJAT1458 初期對(duì)番茄根系土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響不大。菌株FJAT1458 處理 6 d 的番茄根系土壤與 PC1和 PC2均表現(xiàn)出高度的正相關(guān)，與對(duì)照 6 d 的番茄根系土壤相距較遠(yuǎn)，說(shuō)明菌株 FJAT1458 處理 6 d 后番茄根系土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化。菌株 FJAT1458處理 12、 15、 18 和 21 d 番茄根系土壤聚集在較近的距離，說(shuō)明菌株 FJAT1458 處理后期，番茄根系土壤微生物群落結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定的狀態(tài)（圖 4）。  3  討論  植物根系土壤是一個(gè)特殊的環(huán)境，棲居著大量微生物34。這些微生物的種類(lèi)和數(shù)量對(duì)根系土壤有機(jī)物轉(zhuǎn)化、植株養(yǎng)分吸收、生長(zhǎng)發(fā)育及其抗病能力都具有明顯的影響35。番茄青枯病是一種典型系統(tǒng)性侵染的土傳病害，土傳病害的發(fā)生與植株根系土壤微生物群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，土壤微生物的健康狀態(tài)，即土壤病原菌少，益生菌多，能阻止或延緩病害的侵染。接入大量人工篩選的生防菌可以改變土壤微生態(tài)系統(tǒng)中微生物的組成，增加有益菌數(shù)量，抑制病菌的繁殖36。本研究發(fā)現(xiàn)青枯病植物疫苗菌株 FJAT1458 接種番茄植株，能改變其根系土壤 PLFAs 標(biāo)識(shí)的微生物組成及含量，可分為減少型、無(wú)變化型和增加型，表明  第 3 期               鄭雪芳等：青枯病植物疫苗對(duì)番茄根系土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響  391 43210-1-2-3-4-5-6-4 -3 -2 -1 01234CK9 dCK3 dCK6 dCK12 dCK15 dCK18 d CK21 dTR3 dTR6 dTR9 dTR12 dTR15 dTR18 dTR21 dPC1(61.67%)PC2(21.79%)圖 4  菌株 FJAT1458 處理 （ TR） 和對(duì)照 （ CK） 的番茄根系土壤微生物群落時(shí)間動(dòng)態(tài)的主成分分析  Fig. 4  PCA analysis of microbial community in the tomato root zone soil under strain FJAT1458 treatment (TR) and control (CK) PLFAs 所標(biāo)識(shí)的不同種類(lèi)微生物對(duì)菌株 FJAT1458 接種后番茄根系土壤的響應(yīng)不同。有研究發(fā)現(xiàn)苗床拌土接種生防菌可顯著改變辣椒根域微生物組成和數(shù)量，從而減少病害37，本文的研究結(jié)果與其吻合。  微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要因子，在自然界同一環(huán)境中許多微生物群體組成一個(gè)群落，在有限的自然環(huán)境中通過(guò)生物間的相互作用，經(jīng)過(guò)自然選擇最終達(dá)到平衡，一種外源菌的加入會(huì)影響到這種平衡，最終由環(huán)境決定其存亡38。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株 FJAT1458 處理后的不同時(shí)期番茄根系土壤 PLFAs 標(biāo)識(shí)的微生物總量均比對(duì)照組高，說(shuō)明接種植物疫苗菌株 FJAT1458 能改變根系土壤微生物種群結(jié)構(gòu)，能夠促進(jìn)番茄根系土壤細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)，對(duì)放線(xiàn)菌先促進(jìn)后抑制其生長(zhǎng)（其中土壤細(xì)菌數(shù)量的增長(zhǎng)，也不排除由于菌株 FJAT1458 接種的緣故），研究結(jié)果與朱偉杰等39報(bào)道相反，生防菌熒光假單胞菌 Pseudomonas fluorescens 2P24 處理甜瓜根圍土壤會(huì)抑制土壤中細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)， 促進(jìn)放線(xiàn)菌生長(zhǎng)。 與 Rogers 和 Burns40研究得出結(jié)論一致，研究發(fā)現(xiàn)土壤中接入固氮灰色念珠藻能促進(jìn)細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)。郁雪平等41研究發(fā)現(xiàn)生防木霉菌 Th2 和 T4 對(duì)甜瓜根圍土壤細(xì)菌有明顯的促生作用，而對(duì)真菌和放線(xiàn)菌有明顯的抑制作用。前人不同的研究結(jié)果表明不同生防菌對(duì)不同作物根系土壤微生物種群結(jié)構(gòu)的影響不同，因此，探索生防菌對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)生防菌的安全應(yīng)用具有重要參考價(jià)值。  Steenwertha 等42指出土壤微生物群落及其多樣性反映土壤環(huán)境質(zhì)量的變化， 其特征可作為生物指標(biāo)指示土壤質(zhì)量。當(dāng)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)越豐富，物種越均勻，多樣性越高時(shí)，土壤質(zhì)量越好，對(duì)病原菌的防控能力越強(qiáng)43。 Yoshitaka 等44研究發(fā)現(xiàn)抗青枯病番茄根系土壤微生物群落的多樣性顯著高于感病土壤中微生物的群落多樣性。朱偉杰等39研究發(fā)現(xiàn)，生防菌 2P24 在甜瓜根圍土壤的釋放對(duì)微生物多樣性造成一定的影響， ShannonWiener 指數(shù)有所提高。本研究發(fā)現(xiàn)，接種植物疫苗菌株 FJAT1458 后番茄根際土壤的 ShannonWiener 指數(shù)在不同時(shí)期均有所提高，與對(duì)照相比，差異達(dá)顯著水平，表明接種菌株 FJAT1458能提高番茄根系土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性，從而提高土壤微生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性、提升土壤質(zhì)量、增強(qiáng)土壤抑制病害能力。  參  考  文  獻(xiàn)  1 Hayward A C. Biology and epidemiology of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearumJ. Annual Review