34(1)99-108               中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)  Chinese Journal of Biological Control                    2018年 2 月  收稿日期： 2017-09-25 基金項(xiàng)目： 公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（ 201303025）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（ 2017YFD0201100）；河北省財(cái)政專項(xiàng)（ F17C10007）；河北省人才培養(yǎng)工程  作者簡(jiǎn)介： 趙衛(wèi)松，博士，助研， E-mail： zhaoweisong1985163.com； *通信作者 ， 李社增，碩士，研究員， E-mail： shezengli163.com；馬平，博士，研究員， E-mail： pingma88126.com。  DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2018.01.012 防治 番茄 灰霉病 的 枯草芽胞桿菌 BAB-1粉塵劑研制  趙衛(wèi)松，鹿秀云，郭慶港，王培培，商俊燕，年冠臻，張曉云，董麗紅，李社增 *，馬  平 * （河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所 /河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心 /農(nóng)業(yè)部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，               保定  071000）  摘要： 目前我國(guó)農(nóng)藥登記的微生物殺菌劑主要為水劑和可濕性粉劑兩種劑型。為了克服常規(guī)噴霧導(dǎo)致溫室大棚內(nèi)濕度增加給防病帶來的不利影響，本文以枯草芽胞桿菌 BAB-1 為有效成分開展了粉塵劑研究，通過對(duì)載體和助劑的篩 選，明確了最佳的載體、助劑種類及其比例，最終確定 100 億 CFU/g 枯草芽胞桿菌BAB-1 粉塵劑的配方為：滑石粉 20%、分散劑 GY-D900 2%、 菌株 BAB-1 原藥補(bǔ)足至 100%。該制劑具有很好的懸浮效果（ 30 min 時(shí)懸浮率 50%）。室內(nèi)盆栽試驗(yàn)表明， 菌株 BAB-1 粉塵劑對(duì)番茄灰霉病防效達(dá)到 57.14% 71.43%，對(duì)黃瓜灰霉病的保護(hù)作用優(yōu)于治療作用，施用 1 次的防病效果分別為 48.80%和1.65%；溫室大棚試驗(yàn)結(jié)果表明，該制劑在番茄大棚中施用 3 次后對(duì)灰霉病的防效達(dá)到 79.04%，對(duì)照化學(xué)藥劑嘧菌酯 800 倍水溶液的防效為 82.55%。該研究結(jié)果為枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑的進(jìn)一步產(chǎn)業(yè)化開發(fā)和應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。  關(guān)   鍵   詞： 枯草芽胞桿菌；相容性；粉塵劑；番茄灰霉??；防治效果  中圖分類號(hào)： S476    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A    文章編號(hào)： 1005-9261(2018)01-0099-10 A Preparation of Bacillus subtitles BAB-1 DPC against Tomato Gray Mold  ZHAO Weisong, LU Xiuyun, GUO Qinggang, WANG Peipei, SHANG Junyan, NIAN Guanzhen,             ZHANG Xiaoyun, DONG Lihong, LI Shezeng*, MA Ping* (IPM Center of Hebei Province/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northern Region of North China, Ministry of Agriculture/Institute of Plant Protection, Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences,                      Baoding 071000, China) Abstract: In present, wettable powder and aqueous solutions is the main types of microbial fungicide formulations in pesticide registration of China. Humidity was increased by the conventional spray method in greenhouse, in order to overcome the adverse effects for the disease prevention and control, Bacillus subtitles BAB-1 was used as active ingredient to develop the dust powder concentrate (DPC). After carefully screening the suitable factors including carrier and additives, the optimal carrier, additive and their proportions were determined and employed for 1010 BAB-1 DPC formulation including talcum powder 20%, dispersing agent GY-D900 2%, up to 100% by BAB-1 technical material. This preparation of BAB-1 DPC had a excellent suspension rate more than 50% at 30 min. Pot experiment showed that the control efficacy of BAB-1 DPC was reached 57.14% to 71.43%, and the protective effect was superior to therapeutic action against tomato gray mold with control efficacy reached 48.80% and 1.65% after applying once, respectively. In greenhouse experiment, the control efficacy of BAB-1 DPC and chemical fungicide azoxystrobin 800-fold aqueous solution after applying 3 times were 79.04% and 82.55%, 100             中  國(guó)  生  物  防  治  學(xué)  報(bào)      第 34 卷  respectively. The research results provided a scientific basis for further industrial development and application of Bacillus subtitles BAB-1 DPC. Key words: Bacillus subtitles; compatibility; dust powder concentrate (DPC); tomato gray mold; control effect 灰霉病是由灰葡萄孢菌 Botrytis cinerea 引起的一類重要真菌病害 1，在溫室大棚等保護(hù)地栽培蔬菜上危害尤為嚴(yán)重 2,3。隨著保護(hù)地蔬菜種植面積的快速發(fā)展，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的蔬菜如黃瓜、番茄等單一種植，灰霉病發(fā)生越來越重，常造成減產(chǎn) 20% 30%，甚至絕收 4。該病害的 防治 歷來依賴于 化學(xué)殺菌劑，但引起該病的 病原菌寄主范圍廣、繁殖快且遺傳變異頻繁，極易對(duì)化學(xué)殺菌劑產(chǎn)生抗性，使得化學(xué)藥劑 的 防治效果不斷下降 4-7， 進(jìn)一步造成農(nóng)民 頻繁大劑量施用化學(xué)殺菌劑，導(dǎo)致 防治 成本不斷提高，同時(shí)導(dǎo)致高水平化學(xué)農(nóng)藥殘 留。因此，研制開發(fā)高效環(huán)保的微生物殺菌劑成為植物保護(hù)工作者的研究熱點(diǎn)。  目前 ， 微生物殺菌劑 以其環(huán)境友好性和適應(yīng)性 強(qiáng) 在生防菌中得到越來越多的關(guān)注 8,9 。我 國(guó)已成功開發(fā)并投入生產(chǎn)的 以枯草芽胞桿菌為有效成分的制劑主要 有 萎菌凈、百抗、麥豐寧、紋曲寧等，涉及到的劑型包括可濕性粉劑、片劑、懸浮劑、粒劑 10-16，其中 主要以水劑和可濕性粉劑為主。據(jù)中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)統(tǒng)計(jì)，在防治番茄灰霉病上，我國(guó)登記的微生物殺菌劑主要成分包括枯草芽胞桿菌、木霉和熒光假單胞桿菌，登記制劑 13 個(gè)，其中 11 個(gè)制劑為可濕性粉劑， 2 個(gè)制劑為水分 散粒劑，應(yīng)用方式均為噴霧使用。  已有許多文獻(xiàn)和生產(chǎn)實(shí)踐表明溫室大棚中作物灰霉病的發(fā)生與流行，直接與作物栽培環(huán)境的濕度密切相關(guān) 17,18?；瘜W(xué)殺菌劑和微生物殺菌劑，在作物灰霉病防治應(yīng)用中均采用噴霧處理，加大了溫室大棚中濕度，進(jìn)一步加重了作物灰霉病的發(fā)生 18-20  枯草芽胞桿菌 BAB-1 是 河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所 植物病害生物防治實(shí)驗(yàn)室 篩選 到 的 對(duì) 番茄灰霉病具有很好防治效果的 菌株，已獲得 中國(guó) 發(fā)明專利授權(quán) （專利證號(hào)： ZL200710121275.0）。以該菌株為有效成分開發(fā)了 80 億 CFU/mL 枯草芽胞 桿菌懸浮劑（登記證號(hào)： PD20150190）已在新沂中凱農(nóng)用化工有限公司實(shí)現(xiàn) 產(chǎn)業(yè)化 。 為了克服常規(guī)噴霧導(dǎo)致溫室內(nèi)濕度增加給 番茄灰霉病 防治帶來的不利影響， 著重研究 非噴霧 應(yīng)用 的制劑非常必要。 然而目前有關(guān)粉塵劑的研制與應(yīng)用方面的報(bào)道較少。因此，本研究擬以 菌株 BAB-1 為有效成分， 開展 用于 溫室大棚 中噴粉 使用的 粉塵劑 研究， 以期為枯草芽 胞 桿菌 BAB-1 粉塵劑的 進(jìn)一步 開發(fā)和應(yīng)用 提供 科學(xué)依據(jù)。  1  材料與方法  1.1  供試材料  枯草芽 胞 桿菌 Bacillus subtilis BAB-1 和 番茄灰霉病菌 Botrytis cinerea， 均 由 河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病害生物防治實(shí)驗(yàn)室 分離、鑒定和保存 。其中 菌株 BAB-1 于 2007 年保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為 CGMCC No. 2099。 LB 培養(yǎng)基用于 枯草芽 胞 桿菌 BAB-1 的培養(yǎng)， PDA 培養(yǎng)基用于灰霉病菌的培養(yǎng)。載體及助劑：輕質(zhì)碳酸鈣、高嶺土、膨潤(rùn)土、滑石粉均購(gòu)自天津市奧湛醫(yī)科醫(yī)藥銷售有限公司，陶土購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；助劑主要包括 MF、 GY-WS01、GY-D800、 GY-D06、 GY-D10、 GY-D900、 GY-DM02 均購(gòu) 自北京廣源益農(nóng)化學(xué)有限責(zé)任公司，木質(zhì)素磺酸鈉購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，十二烷基苯磺酸鈉（ DBS）、十二烷基硫酸鈉（ SDS）均購(gòu)自 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司， GF/A 玻璃微纖維濾紙（ 10 cm 10 cm， Whatman）。  1.2  枯草芽胞桿菌 BAB-1 原藥的制備  將枯草芽 胞 桿菌 BAB-1 在 LB培養(yǎng)基 平板上 劃線培養(yǎng)進(jìn)行 活化，然后挑取單菌落在克氏瓶（ LB培養(yǎng)基）中劃線接種， 35 培養(yǎng) 7 d 用作發(fā)酵種子。將準(zhǔn)備好的發(fā)酵種子 （ 4 瓶） 克氏瓶培養(yǎng)的枯草芽胞桿菌BAB-1 菌苔用無菌刮 鏟 刮下 ， 每瓶用 100 mL 無菌水 配置成孢子懸浮液 （濃度為 108 cfu/mL） ，接入 1 t 種子發(fā)酵罐， 31 培養(yǎng) 12 h 后作為種子液轉(zhuǎn)入 5 t 生產(chǎn)發(fā)酵罐 ， 31、 180 r/min 培養(yǎng) 48 h，即得到菌株 BAB-1第 1 期               趙衛(wèi)松 等 ： 防治 番茄 灰霉病 的 枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑研制  101 發(fā)酵液。在發(fā)酵液中添加 10%陶土（ 粒徑 26.67 m）進(jìn)行噴霧干燥得到菌株 BAB-1 原藥 。采用平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)菌株 BAB-1 原藥 中活菌含量為 2 1010 CFU/g。  1.3  載體或助劑與枯草芽胞桿菌 BAB-1 的生物相容性  在試驗(yàn)質(zhì)量濃度（ 1%、 2%、 3%和 4%）范圍內(nèi)，供試助劑與 LB 培養(yǎng)液混合時(shí)存在完全溶解、產(chǎn) 生顏色和不溶解（產(chǎn)生沉淀） 3 種情況。（ 1）生長(zhǎng)量測(cè)定法：針對(duì)助劑與 LB 培養(yǎng)液完全溶解的處理，采用生長(zhǎng)量測(cè)定法評(píng)價(jià)助劑與枯草芽胞桿菌 BAB-1 的相容性。參考孫朝華等 21方法，并略作修改。將保存的菌株 BAB-1 轉(zhuǎn)接到 LB平板上活化，經(jīng)劃線分離培養(yǎng) 24 h 后，挑取單菌落接種于 LB 培養(yǎng)液中，在 30 、180 r/min 的搖床里培養(yǎng) 24 h，作為后續(xù)試驗(yàn)的種子液。在 250 mL 三角瓶中，將 1%的種子液接種于含有上述質(zhì)量濃度助劑的 100 mL 培養(yǎng)液中，在 pH 7.0、 30 和 180 r/min 振蕩培養(yǎng) 24 h。 利用酶標(biāo)儀測(cè)定 OD600的吸收值來表示菌株 BAB-1 的生長(zhǎng)量。每個(gè)濃度 3 次重復(fù)，以不添加助劑菌株 BAB-1 的生長(zhǎng)量為對(duì)照。（ 2）毒性平板法：針對(duì)助劑與 LB 培養(yǎng)基產(chǎn)生沉淀或顏色的問題，采用平板培養(yǎng)法評(píng)價(jià)助劑與枯草芽胞桿菌 BAB-1 的相容性。參考李姝江等 11方法，并略作修改。稱取一定質(zhì)量的供試助劑按照 1%、 2%、 3%、4%的質(zhì)量濃度分別加入到 LB 培養(yǎng)基中，制得固體平板，劃線接種菌株 BAB-1，培養(yǎng) 24 h 后考察其生長(zhǎng)情況。每個(gè)濃度 3 次重復(fù)，以不添加助劑菌株 BAB-1 生長(zhǎng)情況為對(duì)照。篩選出對(duì)菌株生長(zhǎng)沒有影響的 載體和助劑。  以沉降率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，將不同載體與 BAB-1 原藥混合對(duì)其懸浮效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，參考李寶聚等 23評(píng)價(jià)方法，即噴粉 30 min 后沉降率 50%，認(rèn)為在空氣中能夠達(dá)到很好的懸浮效果。通過將不同載體與菌株BAB-1 原藥混合后的沉降率進(jìn)行測(cè)定，篩選最佳載體。根據(jù)載體與枯草芽胞桿菌 BAB-1 的生物相容性和粒徑測(cè)定結(jié)果，將 3 種載體與 BAB-1 混合后分別記作配方 A（滑石粉 +BAB-1 原藥）、配方 B（皂土 +BAB-1原藥）和配方 C（陶土 BAB-1 原藥）。  1.4  枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑的加工與配比優(yōu)化  將上述獲得的菌株 BAB-1 原藥、相容性好的載體、助劑分別經(jīng)氣流粉碎機(jī)（江陰新友機(jī)械制造有限公司）處理后，按照一定比例置于 SYH 三維混合機(jī)中（上海塵鑫粉體設(shè)備有限公司）混合均勻加工成不同的粉塵劑。其配比如下（按質(zhì)量百分比計(jì)， w/w）：載體 20%、潤(rùn)濕劑 0 2%、分散劑 0 2%、菌株 BAB-1原藥補(bǔ)足至 100%。利用平板 菌落 計(jì)數(shù)法測(cè)定其含菌量。  1.5  樣品加工后主要質(zhì)量指標(biāo)檢測(cè)  1.5.1  粒徑測(cè)定   利用激光粒度分布儀 （ BT-9300HT，丹東百特儀器有限公司） 測(cè)定粒徑的大小。 首先 使用 碳酸鈣 標(biāo)樣 對(duì) 儀器 進(jìn) 行 校正，選定背景值 ，然后 將循環(huán)池 用蒸餾水 清洗干凈后加入 待測(cè) 樣品，遮光率調(diào)整到 10% 20%停止加樣，打開超聲波分散 3 min，使其充分混勻。記錄樣品在 D10、 D50、 D90、 D98時(shí)的粒徑大小 ，每個(gè)樣品 3 次重復(fù)。  1.5.2  沉降率測(cè)定   參考周勁松等 22方法，并稍作修改。采用稱重法評(píng)價(jià)懸浮效果，將一定面積的玻璃微纖維濾紙平鋪于密閉空間地面，通過計(jì)算密閉空間地面濾紙上的沉降量，折算出總面積的沉降量，最終得到噴粉試驗(yàn)后的沉降率。  1.6  枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑對(duì)灰霉病的防治效果評(píng)價(jià)  1.6.1  室內(nèi)效果評(píng)價(jià)   通過離體葉片法和盆栽法開展枯草芽胞桿菌 BAB-1粉塵劑對(duì)灰霉病防治效果研究。  離體葉片法：選擇大小、葉齡基本一致的健康番茄葉片，去除葉片表面灰塵，用蘸水的脫脂棉包裹住葉柄保濕，置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中。在溫室放置干凈的紙板，將裝有葉片的培養(yǎng)皿置于其上，打開培養(yǎng)皿，開始噴粉作業(yè)，在噴粉完成后的 30、 60 和 120 min，蓋上培養(yǎng)皿，置于 25 恒溫培養(yǎng) 24 h，在所有葉片的葉背葉脈處接種活化培養(yǎng)的灰霉菌（ 5 mm）， 25 恒溫光照 /黑暗（ 16 h/8 h）培養(yǎng) 3 5 d 觀察發(fā)病情況。以未 噴粉塵劑的葉片為對(duì)照，每個(gè)處理 4 次重復(fù)，每次重復(fù) 20 個(gè)葉片。測(cè)量橢圓形病斑的長(zhǎng)直徑和短直徑，按照以下公式計(jì)算發(fā)病面積和防治效果。發(fā)病面積 ab/4，其中 a 和 b 分別為長(zhǎng)直徑和短直徑；防治效果（ %） 空白對(duì)照的發(fā)病面積處理的發(fā)病面積 /空白對(duì)照的發(fā)病面積 100。  盆栽法：選擇子葉平展、整齊一致的黃瓜苗作為試驗(yàn)材料。保護(hù)作用：先噴施粉塵劑后接種病原菌。選擇 長(zhǎng)出 2 3 片葉子的黃瓜苗置于溫室中進(jìn)行噴粉作業(yè)，待枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑沉降 24 h 后，置102             中  國(guó)  生  物  防  治  學(xué)  報(bào)      第 34 卷  于人工氣候箱中 25 恒溫光照保濕培養(yǎng) 24 h，然后接種活化 培養(yǎng)的灰霉菌（ 5 mm），重新置于 25 恒 溫光照保濕培養(yǎng) 3 5 d，觀察發(fā)病情況。治療作用：先接種病原菌后噴施粉塵劑。在黃瓜苗子葉中央接種活化培養(yǎng)的灰霉菌（ 5 mm），在 25 恒溫光照保濕培養(yǎng) 24 h 后，置于溫室中進(jìn)行噴粉作業(yè)，沉降24 h，重新置于人工氣候箱中 ， 25 恒溫光照保濕培養(yǎng) 3 5 d，觀察發(fā)病情況。每個(gè)處理 4 次重復(fù)，每次重復(fù) 20 株黃瓜苗。以接種灰霉病菌不噴菌株 BAB-1 粉塵劑的處理為空白對(duì)照，待其充分發(fā)病后調(diào)查各處理發(fā)病情況，按照上述公式計(jì)算發(fā)病面積和防治效果。  1.6.2  田間 效果評(píng)價(jià)   2017 年于河北省定興縣華農(nóng)蔬菜專業(yè)合作社（河北省定興縣賢宇鎮(zhèn)龍華村）開展試驗(yàn)。番茄品種荷蘭 8 號(hào)，長(zhǎng)勢(shì)整齊。試驗(yàn)共設(shè) 3 個(gè)處理： 枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑，孢子濃度為 100億 CFU/g； 25%嘧菌酯懸浮劑（英國(guó)先正達(dá)有限公司）； 清水對(duì)照。每個(gè)處理 4 次重復(fù)，共設(shè) 12 個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積 48 m2，隨機(jī)區(qū)組排列。首次施藥為第二穗花開花期。病害發(fā)生之前開始第一次開始噴粉施藥，以后每隔 7 10 d 噴施一次，粉塵劑每次用量為 15 kg/hm2， 25%嘧菌酯懸浮劑使用濃度為 800 倍水稀釋液，共施藥 3 次 。  發(fā)病調(diào)查指標(biāo)包括，病株數(shù)（發(fā)病率）、發(fā)病果、發(fā)病側(cè)枝、發(fā)病葉片數(shù)、發(fā)病主莖、發(fā)病花數(shù)。病株率是指小區(qū)面積內(nèi)發(fā)病植株占總株數(shù)的百分比；發(fā)病點(diǎn)是指小區(qū)面積內(nèi)植株發(fā)病的不同部位，包括果、葉、側(cè)枝、主莖、花。發(fā)病點(diǎn)率是指小區(qū)面積內(nèi)發(fā)病部位占總株數(shù)的百分比。  1.7  數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析  應(yīng)用 SPSS 17.0 軟件，采用鄧肯氏新復(fù)極差多重比較法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。應(yīng)用 Excel軟件和 Sigmaplot 12.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理與初步計(jì)算分析。  2  結(jié)果 與 分析  2.1  載體或助劑對(duì)枯草芽胞桿菌 BAB-1 生長(zhǎng)的影響  研究了助劑 MF、 GY-D800、 GY-D06、 GY-D10、 GY-D900、 GY-DM02、 GY-WS01、木質(zhì)素磺酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉（ DBS）、十二烷基硫酸鈉（ SDS） ， 載體皂土、滑石粉、陶土與枯草芽胞桿菌 BAB-1的生物相容性。針對(duì)助劑 GY-D800、 GY-D06、 GY-D900 和 SDS，通過生物量比較結(jié)果表明（圖 1 A-D），  AG Y - D 0 6  ( % )C K 1 2 3 4OD6000 . 00 . 20 . 40 . 60 . 8BS D S  ( % )C K 1 2 3 4OD6000 . 00 . 20 . 40 . 60 . 8CG Y - D 8 0 0  ( % )C K 1 2 3 4OD6000 . 00 . 20 . 40 . 60 . 81 . 01 . 21 . 41 . 6DG Y - D 9 0 0  ( % )C K 1 2 3 4OD6000 . 00 . 20 . 40 . 60 . 81 . 01 . 21 . 41 . 6aaaaabaaaaabcddabcdd圖 1  部分助劑在不同濃度下枯草芽胞桿菌 BAB-1 的生長(zhǎng)量  Fig. 1  The growth of B. subtilis BAB-1 with the different concentrations of some additives  第 1 期               趙衛(wèi)松 等 ： 防治 番茄 灰霉病 的 枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑研制  103 助劑 GY-D06 和 SDS 在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)菌株 BAB-1 的生長(zhǎng)表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制作用（圖 1A、 B），而除了濃度 4%時(shí)，助劑 GY-D800 和 GY-D900 均對(duì)菌株 BAB-1 的生長(zhǎng)呈現(xiàn)出促進(jìn)作用。助劑 GY-D800 和GY-D900 在添加濃度分別為 2%和 1%時(shí)，生長(zhǎng)量達(dá)到最大，之后隨著添加濃度的增加生長(zhǎng)量呈下降趨勢(shì)（圖 1C、 D）。方差分析結(jié)果表明（ P 0.05），助劑 GY-D800 和 GY-D900 添加濃度為 1%和 2%時(shí)，菌株 BAB-1 的生長(zhǎng)無顯著差異，而與對(duì)照差異顯著。  同時(shí)，進(jìn)一步采用毒性平板法研究載體或助劑與枯草芽胞桿菌 BAB-1 的生物相容性。研究結(jié)果表明，載體或助劑與枯草芽胞桿菌 BAB-1 的相容性存在區(qū)別。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)（ 1% 4%， w/v），除載體陶土在高濃度（ 3%和 4%）對(duì)菌株 BAB-1 生長(zhǎng)有抑制作用外，皂土、滑石粉與菌株 BAB-1 相容性好，菌株BAB-1 均能夠較好的生長(zhǎng)。助劑與枯草芽胞桿菌 BAB-1 的相容性不同，助劑 MF、 GY-D10、 GY-D800、GY-D900 與菌株 BAB-1 相容性好；助劑 GY-D06、 GY-DM02、木質(zhì)素磺酸鈉在低濃度時(shí)（ 1%和 2%） 與菌株 BAB-1 相容性好，隨著濃度的升高對(duì)菌株 BAB-1 的生長(zhǎng)表現(xiàn)抑制作用；然而助劑 GY-WS01、 DBS、SDS 在試驗(yàn)濃度 1% 4%時(shí)對(duì)菌株的生長(zhǎng)均表現(xiàn)出抑制作用 （圖 2、表 1） 。  表 1  載體或助劑對(duì)枯草芽胞桿菌 BAB-1 的生物相容性評(píng)價(jià)  Table 1  Bio-compatibility evaluation between carriers or additives and B. subtilis BAB-1 助劑  Additives 相容性 Compatibility  載體或 助劑  Carriers or additives 相容性 Compatibility 1% 2% 3% 4%  1% 2% 3% 4% MF         木質(zhì)素磺酸鈉  Sodium ligninsul fonate    - - GY-WS01 - - - -  十二烷基苯磺酸鈉  DBS - - - - GY-D800         十二烷基 硫 酸鈉  SDS - - - - GY-D06    - -  皂 土  Bentonite        GY-D10         滑石粉  Talcum powder        GY-D900          陶土  Figuline    - - GY-DM02    - -       注：“ ”表示的是相容性好；“ -”表示的是相容性差。  Note: “ ” represented good compatibility, “-” represented poor compatibility. 2.2  載體的篩選  研究結(jié)果表明，配方 A、配方 B 和配方 C 的沉降率分別為 42.69%、 70.20%和 48.34%，配方 B 的沉降率大于 50%，不符合粉塵劑的沉降要求，配方 A 優(yōu)于配方 C，無顯著差異，而與 B 有顯著差異。因此，選擇滑石粉作為枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑制備的最佳載體 （圖 3） 。  2.3  分散劑的篩選  基于生 長(zhǎng)量測(cè)定法和毒性平板法篩選出與枯草芽胞桿菌 BAB-1 相容性好的 4 種分散劑（ GY-D800、GY-D900、 GY-D10 和 MF）。按照分散劑 2%、滑石粉 20%、菌株 BAB-1 原藥補(bǔ)足至 100%，混勻，篩選制備菌株 BAB-1 粉塵劑的分散劑。試驗(yàn)結(jié)果 表明，含有分散劑 GY-D800、 GY-D900、 GY-D10和 MF 的粉塵劑的沉降率分別為 42.56%、 33.17%、 43.30%和 49.63%，均小于 50%。含有分散劑 GY-D800的粉塵劑沉降率與其他粉塵劑處理有顯著差異，而含有分散劑 GY-D800 與 GY-D10 的粉塵劑沉降率無顯著差異。因此，制備菌株 BAB-1 粉塵劑的最佳分散劑為 GY-D900，其次為 GY-D800 和 GY-D10（圖 4） 。  2.4  不同樣品組分及其混合后的粒徑測(cè)定  關(guān)于粉塵劑粒徑的要求，參考李寶聚等 23評(píng)價(jià)方法，粉碎細(xì)度要求 D90 53 m。載體陶土、滑石粉和皂土的 D90 粒徑分別為 21.86、 14.24 和 33.70 m，枯草芽胞桿菌 BAB-1 原粉的 D90 粒徑為 8.19 m。載體分別與枯草芽胞桿菌 BAB-1 混合后， D90 粒徑差異顯著 ， 分別為 50.39、 31.68 和 67.14 m。載體滑石粉、分散劑 GY-D900 與枯草芽胞桿菌 BAB-1 混合后滿足粉塵劑的粒徑要求，以此組分 開展 粉塵劑 的 后續(xù)研究 （ 表 2） 。  104             中  國(guó)  生  物  防  治  學(xué)  報(bào)      第 34 卷  G Y - D M 0 2 G Y - D 9 0 0十 二 烷 基 硫 酸 鈉  S D SG Y - D 8 0 0 G Y - D 0 6 M FG Y - D 1 0 G Y - W S 0 1十 二 烷 基 苯 磺 酸 鈉  D B S木 質(zhì) 素 磺 酸 鈉S o d i u m  l i g n i n s u l  f o n a t e皂 土  B e n t o n i t e 滑 石 粉  T a l c u m  p o w d e r陶 土  F i g u l i n e注：每個(gè)圖中平板從上到下，從左到右分別代表的是載體或助劑在不同濃度（ CK、 1%、 2%、 3%和 4%）的 LB 平板上菌株的生長(zhǎng)情況。  Note: The plates at each figure represent the growth of strain BAB-1 with carriers or additives in different concentrations (CK, 1%, 2%, 3% and 4%) from top to bottom, from left to right, respectively. 圖 2  載體或助劑與枯草芽胞桿菌 BAB-1 的生物相 容性（毒性平板法）  Fig. 2  The bio-compatibility between carriers or additives and B. subtilis BAB-1 by method of toxicity plate  2.5  枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑的室內(nèi)防效評(píng)價(jià)  菌株 BAB-1 粉塵劑沉降 30、 60 和 120 min 時(shí)，葉片灰霉病的發(fā)病面積分別為 1.20、 0.60 和 0.40 cm2，對(duì)照發(fā)病面積為 1.40 cm2，防病效果分別為 14.29%、 57.14%和 71.43%。  枯草芽 胞 桿 菌 BAB-1 粉塵劑 對(duì)黃瓜灰霉病的保護(hù)效果和治療效果分別為 48.80%和 1.65%，保護(hù)作用優(yōu)于治療作用（表 3）。  第 1 期               趙衛(wèi)松 等 ： 防治 番茄 灰霉病 的 枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑研制  105 配 方  F o r m u l aA B C沉降率Sedimentationrate(%)02 04 06 08 01 0 0aab圖 3  不同載體與枯草芽胞桿菌 BAB-1 混合的沉降效果  Fig. 3  Sedimentation effects of different carriers mixed with B. subtilis BAB-1 分 散 劑  D i s p e r s a n t sG Y - D 8 0 0 G Y - D 9 0 0 G Y - D 1 0 M F01 02 03 04 05 06 0abbc沉降率Sedimentationrate(%)圖 4  不同分散劑與枯草芽胞桿菌 BAB-1 混合后的沉降效果  Fig. 4  Sedimentation effects of different dispersants mixed with B. subtilis BAB-1 表 2  不同組分及其混合后的粒徑  Table 2  Particle size of different components and its mixture  樣品名稱   Sample name 粒徑 Particle size (m) D10 D50 D90 D98 陶土  Figuline 1.66 0.35 8.34 1.04 21.86 1.49 30.35 1.68 滑石粉  Talcum powder 1.24 0.42 5.56 0.52 14.24 1.88 20.54 1.57 皂土 Bentonite 1.65 0.18 7.58 1.76 33.70 2.13 54.58 3.44 GY-D900 43.80 1.34 107.72 4.98 244.84 3.19 384.61 3.86 BAB-1 原 藥 BAB-1 technical material 0.69 0.11 2.75 0.34 8.19 0.83 11.56 2.17 陶 土 GY-D900 BAB-1 原 藥  Figuline GY-D900 BAB-1 technical material   7.66 0.19 17.29 0.71 50.39 0.73 b 61.26 0.87 滑石粉 GY-D900 BAB-1 原 藥  Talcum powder GY-D900 BAB-1 technical material 1.67 0.29 10.56 0.43 31.68 0.86 a 48.55 0.35 皂土 GY-D900 BAB-1 原 藥  Bentonite GY-D900 BAB-1 technical material 9.68 0.95 19.24 0.76 67.14 0.49 c 83.43 0.42 C K 3 0  m i n 6 0  m i n 1 2 0  m i n 圖 5  枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑對(duì)灰霉病防 治 效 果  Fig. 5  Control effect on Botrytis cinerea by B. subtilis BAB-1 DPC 表 3  枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑對(duì)灰霉病的保護(hù)和治療作用  Table 3  Protective and curative effect of B. subtilis BAB-1 DPC against B. cinerea 處理  Treatment 保護(hù)作用 Protective effect 治療作用 Curative effect 病情指數(shù) Disease index 防治效果 Control effect (%) 病情指數(shù) Disease index 防治效果 Control effect (%) 枯草芽 胞 桿菌 BAB-1 粉塵劑  B. subtilis BAB-1 DPC 30.84 3.26 48.80 2.78  98.35 1.47 1.65 1.04 空白 CK 60.24 2.15 - 100.00 0.00 - 106             中  國(guó)  生  物  防  治  學(xué)  報(bào)      第 34 卷  2.6  枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑的溫室大棚試驗(yàn)  枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑對(duì)番茄灰霉病具有很好的防治效果。第 2 次施藥后 7 d 調(diào)查（ 2017.01.10），  菌株 BAB-1 粉塵劑按照 15 kg/hm2 施藥后的病株防效和發(fā)病防效均為 100%，對(duì)照藥劑 25%嘧菌酯 懸浮劑800 倍 水稀釋液的病株防效和發(fā)病防效分別為 66.29%和 82.61%，表明 BAB-1 粉塵劑使用濃度 的防效高于對(duì)照藥劑，尤其是在對(duì)病株的防效方面。第 3 次施藥 7 d 后調(diào)查（ 2017.01.18）， BAB-1 粉塵劑的病株防效和發(fā)病 點(diǎn) 防效分別為 71.08%和 79.04%，對(duì)照藥劑 25%嘧菌酯 懸浮劑 800 倍 水稀釋液的病株防效和發(fā)病點(diǎn) 防效分別為 75.93%和 82.55%。不同調(diào)查時(shí)間 BAB-1粉塵劑和嘧菌酯處理的病株防效有顯著差異； BAB-1粉塵劑 發(fā)病點(diǎn)防效之間存在顯著差異，呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而化學(xué)藥劑嘧菌酯的發(fā)病點(diǎn)防效無顯著差異。隨著用藥次數(shù)的增加和病害的發(fā)展，粉塵劑對(duì)灰霉病的防治效果有所下降，化學(xué)藥劑嘧菌酯仍表現(xiàn)出 很好的防治效果（表 4）。  表 4  枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑對(duì)番茄灰霉病的防治效果  Table 4  Control effects of B. subtilis BAB-1 DPC on B. cinerea  時(shí)間  Time 處理  Treatment 病株率  Diseased plant rate (%) 病株防效  Diseased plant control effect (%) 發(fā)病點(diǎn)  Incidence rate (%) 發(fā)病點(diǎn)防效  Incidence of control effect (%) 2017.01.10 A 0.00 0.00 100 0.00 d 0 0.00 100 0.00 c B 2.08 1.26 66.29 3.17 a 2.08 0.74 82.61 4.92 b CK 6.17 1.64 - 11.96 2.37 - 2017.01.18 A 6.26 1.18 71.08 2.42 b 6.26 1.24 79.04 3.67 a B 5.21 1.66 75.93 4.83 c 5.21 2.07 82.55 6.73 b CK 21.64 3.23 - 29.85 2.86 - 注： A 表示的是枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑， B 表示的是 嘧菌酯 800 倍。  Note: A represented B. subtilis BAB-1 DPC, B represented azoxystrobin 800 folds.  3  討論  枯 草芽 胞 桿菌以其環(huán)境適應(yīng)性和環(huán)境友好性在生防菌中得到越來越多的關(guān)注 。微 生物農(nóng)藥粉塵劑噴施后可以在空氣中產(chǎn)生更好的懸浮效果和更強(qiáng)的葉片附著性，從而可以對(duì)溫室作物病蟲害有更好的防治效果。  載體對(duì)制劑的潤(rùn)濕性和懸浮率 有主要影響 12，而助劑不僅可以提高防效，延長(zhǎng)貨架期，還能降低成本。