湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 自然科學(xué)版 2022 48 2 196 200 DOI 10 13331 ki jhau 2022 02 011 Journal of Hunan Agricultural University Natural Sciences 引用格式 周鵬澤 王曉敏 孔維康 王林 白圣懿 李小紅 郭猛 程國新 銀川市番茄白粉病病原菌的鑒定 J 湖 南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 自然科學(xué)版 2022 48 2 196 200 ZHOU P Z WANG X M KONG W K WANG L BAI S Y LI X H GUO M CHENG G X Identification of pathogen causing tomato powdery mildew in Yinchuan J Journal of Hunan Agricultural University Natural Sciences 2022 48 2 196 200 投稿網(wǎng)址 銀川市番茄白粉病病原菌的鑒定 周鵬澤 1 王曉敏 1 2 3 4 孔維康 1 王林 1 白圣懿 1 李小紅 1 郭猛 1 2 3 4 程國新 1 2 3 4 1 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院 寧夏 銀川 750021 2 寧夏現(xiàn)代設(shè)施園藝工程技術(shù)研究中心 寧夏 銀川 750021 3 寧夏 優(yōu)勢(shì)特色作物現(xiàn)代分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 寧夏 銀川 750021 4 寧夏設(shè)施園藝 寧夏大學(xué) 技術(shù)創(chuàng)新中心 寧夏 銀 川 750021 摘 要 對(duì)寧夏銀川市收集的番茄白粉病病葉上的病原菌進(jìn)行分離 純化 分別進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果表明 銀川市番茄白粉病病原菌分生孢子單生 呈卵圓形或腰鼓狀 其頂端位置萌發(fā)出芽管 芽管末端生有乳突狀附著胞 附著胞亦著生于菌絲上 分生孢子梗直立不分支 未發(fā)現(xiàn)閉囊殼 對(duì)病原菌的內(nèi) 部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列進(jìn)行比對(duì) 其與新番茄粉孢菌 Oidium neolycopersici 的一致性達(dá) 99 以上 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)合 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明 引起銀川市番茄白粉病的病原菌為新番茄粉孢菌 關(guān) 鍵 詞 番茄 白粉病菌 形態(tài)學(xué)鑒定 內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)鑒定 銀川市 中圖分類號(hào) S436 412 1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1007 1032 2022 02 0196 05 Identification of pathogen causing tomato powdery mildew in Yinchuan ZHOU Pengze 1 WANG Xiaomin 1 2 3 4 KONG Weikang 1 WANG Lin 1 BAI Shengyi 1 LI Xiaohong 1 GUO Meng 1 2 3 4 CHENG Guoxin 1 2 3 4 1 School of Agriculture Ningxia University Yinchuan Ningxia 750021 China 2 Modern Facility Horticulture Engineering Technology Research Center Yinchuan Ningxia 750021 China 3 Key Laboratory of Modern Molecular Breeding for Dominant and Special Crops in Yinchuan Ningxia 750021 China 4 Facility Horticulture Ningxia University Technology Innovation Center Yinchuan Ningxia 750021 China Abstract Pathogen of tomato powdery mildew in Yinchuan of Ningxia was isolated and purified then characterized by morphology and molecular biology methods Morphology of the pathogen showed that its conidia were solitary oval or drum shaped germ tubes germinated at the top of conidia mastoid appressoriums formed at the end of germ tubes which also occurred on hyphae conidiophores were erect and unbranched no closed capsule was found Internal transcribed spacer sequence alignment showed the pathogen have more than 99 consistency with the Oidium neolycopersici Morphological and molecular biological identification showed that the pathogen causing tomato powdery mildew in Yinchuan was Oidium neolycopersici Keywords tomato powdery mildew morphology identification internal transcribed spacer ITS identification Yinchuan 收稿日期 2021 03 10 修回日期 2022 01 05 基金項(xiàng)目 國家自然科學(xué)基金委地區(qū)項(xiàng)目 31860561 寧夏回族自治區(qū)科學(xué)技術(shù)廳重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目 2019BBF02022 2016 年度教育部春暉計(jì) 劃項(xiàng)目 教外司 2016 2083 號(hào) 作者簡介 周鵬澤 1996 男 河北石家莊人 碩士研究生 主要從事蔬菜生物技術(shù)與遺傳育種研究 347987760 通信作者 王曉敏 博士 副教授 主要從事蔬菜生物技術(shù)與遺傳育種研究 wangxiaomin 1981 第 48 卷第 2 期 周鵬澤等 銀川市番茄白粉病病原菌的鑒定 197 1900 年 SALMON 首次在意大利發(fā)現(xiàn)番茄白粉 病 將病原菌鑒定為蓼白粉菌 1 后來日本 澳大利 亞 荷蘭等多個(gè)國家陸續(xù)報(bào)道發(fā)生番茄白粉病 2 10 番茄白粉病已成為一種全球性真菌病害 其中引起 日本 英國 加拿大 匈牙利和西班牙番茄白粉病 的病原菌被鑒定為蓼白粉菌 Erysiphe polygoni 而 引起荷蘭 澳大利亞 法國和保加利亞番茄白粉病 的病原菌被鑒定為番茄粉孢菌 Oidium lycopersici 中國最早的白粉病發(fā)病記錄由日本學(xué)者澤田 兼吉于 1919 年在臺(tái)灣報(bào)道 病原菌被鑒定為蓼白 粉菌 2 隨后新疆 11 黑龍江 12 13 遼寧 14 等地都 有番茄白粉病的報(bào)道 但病原菌的鑒定結(jié)果并不相 同 其中新疆地區(qū)發(fā)現(xiàn)的番茄白粉病病原菌無性世 代為 Oidiopsis taurica Salmon 有性世代為 Leveillula taurica Lev Arn Lt 黑龍江地區(qū)的番茄 白粉病病原菌只發(fā)現(xiàn)了無性世代 為 O taurica 引 起遼寧地區(qū)白粉病的病原菌為蓼白粉菌 近年來吉 林 河南等多個(gè)省份均有番茄白粉病病原菌是新番 茄粉孢菌 O neolycopersici 的報(bào)道 15 18 筆者隨機(jī)采集寧夏銀川市寧夏大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場溫 室內(nèi)的番茄白粉病病葉 對(duì)其病原菌分離 純化后 進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定 結(jié)合基于 ITS 區(qū)的分子生物學(xué)鑒 定方法 對(duì)該病原菌 ITS 區(qū)進(jìn)行序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā) 育樹構(gòu)建 以期為銀川番茄白粉病防治提供參考 1 材料與方法 1 1 材料 2018 年 4 月 于寧夏回族自治區(qū)銀川市永寧縣 寧夏大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場的溫室內(nèi)隨機(jī)采集番茄白粉病 病葉 白粉病感病番茄品種 Moneymaker MM 由西 北農(nóng)林科技大學(xué)鞏振輝教授惠贈(zèng) 1 2 方法 1 2 1 菌種分離和純化 觀察并記錄番茄發(fā)病后病葉病斑的顏色 大小 和形狀 采用刷葉法對(duì)病葉進(jìn)行菌種分離 采用單 孢直接挑取分離白粉菌進(jìn)行純化 18 經(jīng)純化后的白 粉菌用于形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定 1 2 2 番茄白粉菌的鑒定 參考肖仲久等 19 的方法 利用奧林巴斯 sc180 光學(xué)顯微鏡對(duì)番茄白粉菌形態(tài)進(jìn)行觀察并拍照 使用 BioSpin 真菌基因組 DNA 提取試劑盒 提取白粉病菌的 DNA 采用核酸蛋白檢測儀檢測 DNA 吸光值和濃度 1 瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 完整性 經(jīng)檢測后的 DNA 稀釋至 20 50 ng L 利 用通用引物 ITS1 5 TCCGTAGGTGAACCTGCG G 3 和 ITS4 5 TCCTCCGCTTATTGATATGC 3 進(jìn)行 PCR 反應(yīng) 參考 Takara Ex Taq 酶使用說明書 設(shè)計(jì) PCR 體系 反應(yīng)體系 20 L 5 mol L Ex Taq 0 2 L 10 Ex Taq Buffer 2 0 L 2 5 mmol L dNTP Mix 1 6 L 20 mmol L ITS1 1 0 L 20 mmol L ITS4 1 0 L DNA 0 5 L ddH 2 O 13 7 L 反應(yīng)程序 95 預(yù)變性 5 min 95 變性 30 s 56 退火 30 s 72 延伸 30 s 共 25 個(gè)循環(huán) 72 再延伸 10 min 4 保存 1 瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產(chǎn)物 目的條帶 交奧科鼎盛生物科技有限公司測序 將測得的序列 利用 SeqMan 軟件進(jìn)行測序信號(hào)峰圖拼接 得到完 整序列后 于 NCBI 中進(jìn)行核酸序列比對(duì) 分別確 定 18S ITS1 5 8S ITS2 28S 位點(diǎn) 隨后選取 ITS1 至 ITS2 之間序列于 DNAMAN 中進(jìn)行多序列 比對(duì) 利用 Mega7 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 1 2 3 病原菌的驗(yàn)證 按照科赫氏法則進(jìn)行病原菌的驗(yàn)證 將已鑒定 的番茄白粉病病原菌接種于 MM 番茄葉片上 20 在 光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 21 20 d 后觀察分離出的病原菌 是否為番茄白粉病病原菌 2 結(jié)果與分析 2 1 銀川番茄白粉病病原菌的分離純化結(jié)果 銀川番茄白粉病發(fā)病部位多位于葉片和葉柄 先從下部葉片發(fā)病 逐漸向上部葉片蔓延 發(fā)病初 期 葉片表面出現(xiàn)褪綠小點(diǎn)并變黃 局部有白色粉 狀物 圖 1 1 白色粉狀物斑塊較稀疏 后逐漸加厚 擴(kuò)大 形成不規(guī)則的粉斑 圖 1 2 發(fā)病后期 粉斑 198 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 自然科學(xué)版 2022 年 4 月 逐漸連成片并覆蓋大部分葉片 葉片大面積褪綠 變?yōu)楹稚?逐漸枯萎 圖 1 3 圖 1 銀川番茄葉片白粉病發(fā)病情況 Fig 1 The symptoms of tomato powdery mildew 2 2 銀川番茄白粉病病原菌的鑒定結(jié)果 銀川番茄白粉病病原菌的分生孢子全部單生 呈卵圓形或腰鼓狀 大小為 10 0 32 6 m 5 7 15 6 m 圖 2 1 分生孢子頂端萌發(fā) 產(chǎn)生芽管 芽管 末端生有乳突狀附著胞 圖 2 2 附著胞亦著生于菌 絲上 圖 2 3 分生孢子梗直立 不分支 長度為 37 5 100 8 m 圖 2 4 未發(fā)現(xiàn)有閉囊殼 由此可 鑒定為新番茄粉孢菌 A 附著胞 C 分生孢子 Ce 分生孢子梗 G 芽管 H 菌絲 圖 2 番茄白粉病病原菌的形態(tài) Fig 2 Morphological characteristics of the pathogen fungus of tomato powdery mildew 白粉菌 DNA 經(jīng) PCR 擴(kuò)增后在 500 750 bp 出現(xiàn) 清晰的單一條帶 測序得知該條帶長度為 640 bp 符合目的 ITS 序列的條帶大小 其中 在總長為 640 bp 的 ITS 序列中 ITS1 至 ITS2 之間序列位點(diǎn)為 31 582 長度為 552 bp 將銀川市番茄白粉病病原菌 ITS1 至 ITS2 之間 序列 552 bp 于 NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行 BLAST 搜索 將相似性較高的新番茄粉孢菌序列進(jìn)行多序列比 對(duì)分析 結(jié)果如圖 3 所示 銀川市番茄白粉病病原 菌與已鑒定的匈牙利 On EU047567 Hungary 韓國 On KC213756 1 South Korea 日本 On AB808583 1 Japan 塞爾維亞 On JQ619840 1 Serbia 中國海南 On MH137258 1 Hainan China 中國河南 On EU828521 1 Henan China 中國黑龍江 On JQ972700 1 Heilongjiang China 新番茄粉孢菌的相 似性為 100 與法國 On HQ286688 1 France 和中 國臺(tái)灣 On GU358451 1 Taiwan China 新番茄粉孢 菌的相似性分別達(dá)到 99 82 和 99 63 分別選取 NCBI 上已提交的不同來源的新番茄 粉孢菌 On 番茄粉孢菌 Ol 蓼白粉菌 Ep 韃 靼 內(nèi)絲白粉菌 Lt 菌株與分離的菌株 ITS 全長序列構(gòu) 建系統(tǒng)進(jìn)化樹 圖 4 結(jié)果銀川市番茄白粉病病原菌 歸為新番茄粉孢菌 On 分支 同屬于蓼白粉菌 Ep 的 3 個(gè)菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn) 番茄粉孢菌 Ol 和韃靼 內(nèi)絲白粉菌 Lt 分支與新番茄粉孢菌 On 分支關(guān)系 較遠(yuǎn) 值得關(guān)注的是 番茄粉孢菌 Ol AF229019 1 USA 和新番茄粉孢菌 On 在同一分支 主要因?yàn)榉?茄粉孢菌與新番茄粉孢菌 ITS 序列間存在比較高的 保守性 而新番茄粉孢菌 On GU358451 1 Taiwan China ITS 序列個(gè)別位點(diǎn)的堿基突變 所以未被歸入 新番茄粉孢菌分支 1 2 3 1 2 3 4 第 48 卷第 2 期 周鵬澤等 銀川市番茄白粉病病原菌的鑒定 199 圖 3 新番茄白粉病病原菌的多序列比對(duì) Fig 3 Multiple sequence alignment of the pathogen fungus of tomato powdery mildew On 新番茄粉孢菌 Ol 番茄粉孢菌 Ep 蓼白粉菌 Lt 韃靼內(nèi)絲白粉菌 圖 4 基于 5 8S rDNA 及 ITS1 和 ITS2 基因序列構(gòu)建的 番茄白粉菌系統(tǒng)進(jìn)化樹 Fig 4 Phylogenetic tree of Tomato Powdery mildew based on 5 8S rDNA ITS1 and ITS2 gene sequences 2 3 番茄白粉病病原菌驗(yàn)證結(jié)果 如圖 5 所示 人工接種 20 d 的 MM 番茄葉片 局部褪綠變黃 并在表面形成明顯的白色粉狀物 圖 5 2 圖 5 4 與采集到的番茄白粉病病葉發(fā)病癥 狀 圖 5 1 圖 5 3 一致 說明鑒定后的病原菌和接 種前的病原菌具有相同致病性 為同一種病原菌 1 采集的番茄白粉病發(fā)病植株 2 回接病原菌的發(fā)病番茄植株 3 采集的番茄白粉病病葉 4 回接病原菌的發(fā)病番茄葉片 圖 5 科赫氏驗(yàn)證結(jié)果 Fig 5 Verification results based on Koch postulates 3 討論 番茄白粉病是生產(chǎn)中的主要病害之一 目前已報(bào) 道的番茄白粉菌有番茄粉孢菌 新番茄粉孢菌 蓼白 1 2 3 4 200 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 自然科學(xué)版 2022 年 4 月 粉菌 擬粉孢菌以及辣椒擬粉孢菌 22 本研究形態(tài)學(xué) 鑒定銀川番茄白粉病病原菌為新番茄粉孢菌 這與李 帥等 18 的新番茄粉孢菌形態(tài)特征結(jié)果一致 對(duì)銀川市番茄白粉病菌進(jìn)行多序列比對(duì)和進(jìn) 化樹分析 從分子水平上確定此菌為新番茄粉孢 菌 序列比對(duì)中發(fā)現(xiàn)法國和中國臺(tái)灣報(bào)道的新番茄 粉孢菌 ITS 序列與新番茄粉孢菌的其他菌株存在差 異 表現(xiàn)為兩者特定位點(diǎn)的堿基發(fā)生突變 可能是 因?yàn)槠渖硇》N進(jìn)化所導(dǎo)致 與新番茄粉孢菌相 比 目前有關(guān)番茄粉孢菌 蓼白粉菌和韃靼內(nèi)絲白 粉菌 ITS 全長序列的報(bào)道有限 故在構(gòu)建進(jìn)化樹時(shí) 所用上述 3 種菌株的 ITS 序列相對(duì)較少 參考文獻(xiàn) 1 劉薇 劉淑艷 李玉 等 番茄白粉病的病原菌鑒定 J 植物病理學(xué)報(bào) 2009 39 1 11 15 2 ABIKO K Influence of temperature and humidity on development of tomato powdery mildew J Annual Report of the Kansai Plant Protection Society 1978 20 49 52 3 PRICE T V Powdery mildew of tomato in Australia Australasian J Plant Pathology 1981 10 38 40 4 PATERNOTTE S J Echte meeldauw in tomaat geen echte bedreiging J Groentenen Fruit 1988 43 30 31 5 FLETCHER J T SMEWIN B J COOK R T A Tomato powdery mildew J Plant Pathology 1988 37 4 594 598 6 BURGERJON A NICOT P C BERTRAND F et al Early powdery mildew of greenhouse grown tomatoes in France J Phytopathology 1990 80 1063 7 NESHEV G Powdery mildew Oidium sp on tomatoes in Bulgaria J Phytoparasitica 1993 21 4 339 343 8 BELANGER R R JARVIS W R Occurrence of powdery mildew erysiphe sp on greenhouse tomatoes in Canada J Plant 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菌物學(xué)報(bào) 2012 31 1 68 73 21 鄭坤 姜景彬 康立功 等 番茄白粉病苗期抗病性 鑒定方法及抗病種質(zhì)資源篩選 J 植物保護(hù) 2012 38 5 105 123 22 李金萍 白全江 周艷芳 等 李寶聚博士診病手記 四 十四 兩種病原菌引起的番茄白粉病的診斷與防治 J 中國蔬菜 2012 3 23 25 責(zé)任編輯 羅慧敏 英文編輯 羅 維